Shock Wave aplicación a los cultivos celulares
Summary
Las ondas de choque en la actualidad son bien conocidos por sus efectos regeneradores. Por lo tanto, los experimentos in vitro son de creciente interés. Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo in vitro para los ensayos de la onda de choque en (IVSWT) que nos permite imitar las condiciones in vivo, evitando así los efectos físicos que distraen.
Abstract
Las ondas de choque en la actualidad son bien conocidos por sus efectos regeneradores. Resultados de las investigaciones básicas demostraron que las ondas de choque causan un estímulo biológico a las células o tejido diana sin ningún daño posterior. Por lo tanto, los experimentos in vitro son de creciente interés. Se han descrito varios métodos de aplicación de ondas de choque en cultivos celulares. En general, todos los modelos existentes se centran en cómo aplicar mejor las ondas de choque en las células.
Sin embargo, esta pregunta sigue siendo: ¿Qué sucede con las olas después de pasar el cultivo celular? La diferencia de la impedancia acústica del medio de cultivo celular y el aire ambiente es tan alto, que más del 99% de ondas de choque se reflejan! Por lo tanto, hemos desarrollado un modelo que consiste principalmente en un recipiente de plexiglás incorporado que permite a las olas se propaguen en el agua después de pasar el cultivo celular. Esto evita efectos de cavitación, así como la reflexión de las ondas que de otra manera perturbar los próximos. With este modelo somos capaces de imitar las condiciones in vivo y por lo tanto ganar más y más conocimiento sobre cómo el estímulo físico de las ondas de choque se traduce en una señal de célula biológica ("mechanotransduction").
Introduction
Las ondas de choque son ondas de presión sonora que surgen de una súbita liberación de energía, por ejemplo. como un trueno cuando un rayo. En la medicina ondas de choque se han utilizado durante más de 30 años en litotricia para la desintegración de cálculos renales. Desde el hallazgo incidental de ilíaca engrosamiento óseo en pacientes Litotricia a principios de 1980, se llevaron a cabo los primeros estudios para evaluar el efecto del tratamiento con ondas de choque (SWT) en el hueso de curación 1. Resultados impresionantes de una mejor curación de seudoartrosis de huesos largos se pudieron observar 2. Posteriormente, las indicaciones se ampliaron a las heridas de tejidos blandos 3. Resultados de las investigaciones básicas mostraron que las ondas de choque causan un estímulo biológico al tejido diana sin ningún daño posterior. La liberación de factores de crecimiento angiogénicos (por ejemplo, VEGF, PlGF, FGF) es seguida por una angiogénesis significativa. Esto condujo a una mayor expansión de las indicaciones hacia las patologías isquémicas. Nuestro grupo y otros mostraron el eff positivoect de SWT en la cardiopatía isquémica en modelos animales como en ensayos clínicos 4-6.
Sin embargo, el mecanismo exacto de cómo se traduce el estímulo físico de SWT en una señal biológica (mecanotransducción) permanece en gran medida desconocido. A medida que el interés en la SWT de varios campos de la medicina aumenta continuamente, la búsqueda del mecanismo es cada vez más intensa. Por lo tanto, los experimentos in vitro de ondas de choque están ganando importancia. Además de la reducción de la experimentación con animales y la rentabilidad, la mayor ventaja de vitro tratamiento con ondas de choque en (IVSWT) puede ser la posibilidad de estudiar el comportamiento específico de un determinado tipo de célula. En onda de choque la regeneración de tejidos mediada más probable todas las células del tejido tratado están involucrados, se discuten incluso efectos sistémicos. Sin embargo, cada tipo de célula juega un papel específico y tiene su propia función intrínseca. IVSWT nos permite detectar esta función en particular unnd con lo que nos da una mejor comprensión de los procesos subyacentes complejas.
El conocimiento de hoy acerca de los efectos de las ondas de choque en cultivos de células incluye el aumento de la proliferación, la alteración de los receptores de la membrana celular, aumento y la aceleración de la diferenciación celular, la liberación de factores de crecimiento y quimioatrayentes, así como aumento de la migración celular 7-9.
Se han descrito efectos físicos que causan distracción en la mayoría de modelos in vitro varios métodos de aplicación de ondas de choque en cultivos celulares. Este hecho conduce al problema de que es muy difícil comparar los resultados, ya que las condiciones físicas de la estimulación de células son muy diferentes entre estos modelos. En general, todos los modelos existentes se centran en cómo aplicar mejor las ondas de choque en las células.
Sin embargo, esta pregunta sigue siendo: ¿Qué sucede con las olas después de pasar el cultivo celular? El problema principal es que la diferencia de la acústicaimpedancia del medio de cultivo celular y el aire ambiente es tan alto, que más del 99% de ondas de choque se reflejan la Figura 1.
Debido a la diferencia en la impedancia acústica de los dos medios de las ondas se reflejan no sólo pero un desplazamiento de fase de 180 ° se produce resulta en fuertes fuerzas de tracción a las células Figura 2.
La impedancia acústica se define como el producto de la densidad de un material y su velocidad del sonido Z = ρ x c. Para el agua de la impedancia acústica es ZWater = 1440000 Ns / m 3, para que el aire que está a sólo 420 Ns / m 3. La gran diferencia de estos dos valores da lugar a la reflexión y el cambio de fase de las ondas de choque. El cambio de fase se vuelve un impulso de presión positiva en una onda de tensión.
Incluso si esta fuerza de tracción no es perjudicial para las células, que interfiere con la idea de imitar los efectos de ondas de choque in vivo in vitro. In vivo estosfuerzas de tracción casi no se producen debido a las grandes estructuras del cuerpo.
Además, la parte de atrás corriendo olas incluso puede perturbar los entrantes. Esto puede causar interferencias. Se conocen dos tipos de interferencia. La interferencia constructiva significa que se agregan dos olas que resulta en el doble de amplitud Figura 3. La interferencia destructiva ocurre si las ondas se encuentran diametralmente opuestos. Se hace que la abolición de las ondas (Figura 3). Por lo tanto, IVSWT necesita un modelo que permite a las ondas de choque para propagar después de pasar el cultivo celular.
Baño de agua IVSWT
Consideraciones siguientes las preocupaciones antes mencionados nos llevan a diseñar un baño de agua para evitar los problemas descritos Figura 4. Básicamente, consiste en un recipiente de plexiglás construido con una membrana para conectar cada tipo de onda de choque aplicador. Para el acoplamiento entre esta membrana y la transmisión de ultrasonidos aplicador GEL tiene que ser utilizado. El baño de agua se llena con agua desgasificada para evitar la cavitación que se produciría si el gas se soluted dentro del agua. Un calentador en la parte inferior con un sensor de temperatura conectado a una unidad de control permite regular la temperatura para la imitación de las condiciones in vivo y para evitar cultivos de células se enfríe durante el procedimiento. Temperatura se puede mantener estable a 37 grados centígrados, como se hace en una incubadora. Un soporte para las muestras de células permite la inmersión de cualquier tipo de frasco de cultivo o tubo. De este modo, el recipiente de la muestra necesita ser completamente lleno con medio de cultivo, como burbujas de aire bloquearían ondas de choque! Un absorbedor en forma de cuña en la pared del fondo de la bañera destructs olas con el fin de no quedar reflejada y volver corriendo para evitar interferencias.
Una ventaja adicional a otros modelos IVSWT es la posibilidad de variar la distancia entre el aplicador y los frascos de cultivo. Los hallazgos de nuestro grupo y otros que utilizan este modelo es claramentecómo que cada tipo de célula reacciona muy específicamente a diferentes parámetros de tratamiento. Por otra parte, la definición de la distancia entre la fuente de las ondas y la muestra es crucial, ya que nos permite controlar las células para estar en una posición específica en relación con el enfoque de la onda de choque aplicador.
Protocol
Representative Results
Discussion
La importancia del modelo propuesto para el tratamiento in vitro de la onda de choque es en el hecho de que las ondas pueden propagarse después de pasar el cultivo de células en contraste con los modelos existentes. De este modo, los efectos físicos perturbadores tales como fuerzas de tracción se pueden evitar. El modelo se asemeja más estrechamente las condiciones in vivo que por otros que la aplicación de ondas de sus frascos de cultivo celular directamente.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Reiner Schultheiss y Wolfgang Schaden por su inspiración para este modelo. También agradecemos cristiana Dorfmüller por sus enormes esfuerzos todos los tiempos para apoyar nuestra investigación.
Muchas gracias a Robert Göschl y Hans Hohenegger de realización técnica cuidadosa de nuestras ideas!
Materials
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger – Technical Products | – | |
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipets 25ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | – | |
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| mikrozid disinfectant | Schülke | – | |
| 3,5l degassed water | |||
| paper towels | |||
References
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