Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

Summary

We beschrijven een protocol bij de antivirale cytokine productie in muizen geïnfecteerd met een model herpesvirus, muizen gamma herpesvirus 68 (γ HV68) die nauw verwant aan humane Kaposi-sarcoom geassocieerde herpesvirus (KSHV) en Epstein-Barr virus (EBV) te meten. Gebruik makend van genetisch gemodificeerde muizen en muis embryonale fibroblasten (MEF) hebben we de antivirale cytokine productie zowel in vivo als ex vivo. "Bereiding" de uitdrukking van aangeboren immuunsysteem componenten in knockout embryonale fibroblasten door lentivirale transductie, we verder lokaliseren specifieke aangeboren immuunsysteem moleculen en ontleden de belangrijkste signalering gebeurtenissen die differentieel reguleren van de antivirale cytokine productie.

Abstract

In antwoord op een virale infectie, is de gastheer immuunreactie geactiveerd up-reguleren genexpressie en productie van antivirale cytokines. Omgekeerd hebben virussen ingewikkelde strategieën te ontwijken en te exploiteren gastheerimmuunsysteem signalering voor overleving en voortplanting geëvolueerd. Virale immuun ontduiking keuring, waarbij de afweer en virale fraude, biedt een van de meest fascinerende en dynamische interfaces naar de host-virus interactie onderscheiden. Deze studies ons begrip in aangeboren immuniteit en effenen de weg naar nieuwe antivirale therapieën te ontwikkelen.

Muizen γHV68 is een natuurlijke ziekteverwekker van muizen knaagdieren. γHV68 infectie van muizen geeft een handelbaar klein diermodel om de antivirale respons op menselijke KSHV en EBV waarvan verstoring van in vivo virus-gastheer interacties is niet van toepassing te onderzoeken. Hier beschrijven we een protocol bij de antivirale cytokine productie te bepalen. Dit protocol kan worden aangepast aan andere virgebruikt en signaalwegen.

Onlangs hebben we ontdekt dat γHV68 kaapt MAVS en IKKβ, belangrijke aangeboren immuunsysteem signaleringscomponenten stroomafwaarts van de cytosolische RIG-I en MDA5 te NFKB activering en antivirale cytokine productie teniet. Concreet γHV68 infectie activeert IKKβ en dat geactiveerd IKKβ phosphorylates RelA om RelA afbraak versnellen. Als zodanig, γ HV68 ontkoppelt efficiënt NFKP activering van zijn upstream geactiveerd IKKβ, ontkennen antivirale cytokine genexpressie. Deze studie belicht een ingewikkelde strategie waarbij de upstream aangeboren immuunsysteem activering wordt onderschept door een virale ziekteverwekker aan de onmiddellijke downstream transcriptieactiveringsdomein teniet te doen en ontwijk antivirale cytokine productie.

Introduction

Recente studies hebben de algemene signalisatie cascades die in de montage gastheer aangeboren immuunrespons. Wonende in verschillende compartimenten, receptoren patroonherkenning (PRRS) detecteren pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) van diverse oorsprong aangeboren immuunsysteem signalering activeren ^1. De retinoic zuur-geïnduceerde gen I (RIG-I) en melanoom differentiatie antigeen 5 (MDA5) eiwitten zijn cytosole sensoren die RNA soorten herkennen met specifieke structurele kenmerken ^2. Na activatie RIG-I reageert met de stroomafwaartse MAVS (ook bekend als IPS-1, VISA en CARDIF) adapter die op zijn beurt activeert het IKK (IKKαβγ) en IKK-gerelateerde kinase (TBK1 en IKKε, ook bekend als IKKI ) complexen ^3-6. Geactiveerde aangeboren immuunsysteem kinases fosforileren belangrijke regulatoren van genexpressie, waaronder transcriptiefactoren en remmers daarvan, en maken transcriptionele activering van gastheer antivirale genen (bijv. IL6, TNF & #945;, CCL5 en IFNβ). Deze signaleringscascades vormen krachtige intrinsieke aangeboren immuunrespons dat een anti-microbiële staat te vestigen om pathogeen propagatie tijdens de vroege stadia van de infectie te beperken.

Muizen γHV68 is nauw verwant aan de menselijke oncogene KSHV en EBV. Aldus γHV68 infectie van muizen verschaft een handelbaar klein diermodel om de gastheer immuunrespons op gamma herpes virusinfectie in vivo onderzoeken ^7. Met behulp γHV68, heeft ons lab een ingewikkelde strategie blootgelegd waarbij γHV68 kaapt hosten aangeboren immuunsysteem signalering naar virale infectie mogelijk te maken. Enerzijds γHV68 activeert de MAVS-IKKβ weg van virale transcriptionele activatie promoten via leiding geactiveerd IKKβ replicatie transactivator (RTA), het virale transcriptiefactor pijl op γHV68 replicatie ⁸ fosforyleren. Aan de andere kant, de IKKβ-gemedieerde fosforylering priemgetallen RelA voor degradatie en termijninates NFKB activering ^9. Als zodanig γHV68 infectie vermijdt effectief antiviraal cytokine productie. Interessant is dat een screening met behulp van een expressie bibliotheek van γHV68 geïdentificeerd RTA als een E3 ligase aan RelA afbraak veroorzaken en trekt NFKB activering ^10. Deze bevindingen ontrafel een ingewikkelde immuun ontduiking strategie waarbij de upstream immuun signalering evenementen worden benut door γHV68 om de ultieme antivirale cytokine productie ontkrachten.

Hier beschrijven we een protocol bij de antivirale cytokines in muizen geïnfecteerd met γHV68 zowel in vivo als ex viv o meten. In het protocol verder we de "gereconstitueerde" expressie van aangeboren immuunrespons componenten staand in de knockout embryonale fibroblasten door lentivirale transductie, die de functie van de specifieke aangeboren immuunrespons moleculen reguleren van de antivirale cytokine productie lokaliseert. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere viruses en signaalwegen.

Protocol

Ethiek Verklaring: Al het dierlijke werk werd uitgevoerd onder strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de University of Southern California.

1. Cytokine genexpressie door kwantitatieve real-time PCR en secretie door ELISA in γHV68-geïnfecteerde muizen

1. Verdoven geslacht gematchte, 6-8 weken oude C57BL / 6 (B6) nestgenoten (8-12 muizen / groep) via intraperitoneaal injecteren van 1,5 mg ketamine/0.12 mg xylazine en te enten intranasaal met 40 PFU van γHV68 in 40 ul (infectie beschreven in Dong Feng en ^11). Op verschillende tijdstippen na infectie, euthanaseren de muizen met _CO2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Open de kist met een linker laterale versnijding in de sternum en dwars door de ribben met een scherpe schaar. Verzamel het longweefsel.
3. Verzamel de helft van het longweefsel (linker kwab) in steriele 1,5 ml met een schroefdop af buisjes met 500 ul 1,0 mm Zirconia / Silica kralen. Voeg 1 ml koude serumvrij DMEM in de buis en homogeniseren het longweefsel door bead-slaan gedurende 30 sec. Chill buizen op ijs gedurende 2 minuten en een keer herhaal dit proces.
4. Centrifugeer de buizen (15.000 x g gedurende 10 min) bij 4 ° C, verzamel de bovenstaande vloeistof en meet de cytokine productie zoals hierna beschreven.
5. Meet cytokinen in de handel verkrijgbare cytokine ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant.
6. Verzamel de andere helft van het longweefsel (rechter kwab) in een ander parelbevattende buis en voeg 1 ml TRIzol. Meng en laat supernatant zoals beschreven in stap 1.3 en RNA extract volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Bepaal RNA-concentratie door het nemen van metingen van de absorptie bij 260 en 280 nm. Bereid cDNA met 1 pg totaal RNA en reverse transcriptase volgens de aanwijzingen van de fabrikant (het totale eindvolume was 20 pi). Verdunde cDNA 50 keer met DNAse-en RNAse-vrij water en voer kwantitatieve real-time PCR.
7. Voer het programma op een kwantitatieve real-time PCR machine. Elke reactie bevat 0,5 ul van een paar genspecifieke primers of controle GAPDH primers (de werking concentratie van de primers waren 10 uM, CE 500 nM van elke primer), 5 ui van de SYBR master mix en 4 ui van het verdunde cDNA. Bereken ΔΔCt de relatieve hoeveelheid van mRNA transcripten van antivirale cytokines te bepalen.

2. MEF Cell Infection and Cytokine kwantificering door ELISA en qRT-PCR

1. Grow Mavs ^{+ / +} en Mavs ^{- / -} MEF cellen om sub-confluerende (ongeveer 80%) dichtheid voor plating cellen.
2. Splits MEF cellen in 12-well platen bij 100.000 cellen / putje (de celdichtheid wordt ongeveer 70% op de tweede dag). Voeren γHV68 infectie in drievoud, met een multipliciteit van infectie (MOI) van 5-10 te synchroniseren en te maximaliseren cytokine inductie.
3. Bereid γHV68 schorsing in volledige DMEM medium met de juiste hoeveelheid virus (1 ml per putje).
4. Verwijderen medium en voeg γHV68-suspensie naar MEF cellen.
5. Plaats de plaat in weefselkweek incubator, rots elke 30 minuten en laat een totaal van 2 uur incubatie.
6. Remove-γHV68 bevattend medium, eenmaal wassen met PBS, en te vervangen door verse volledige DMEM.
7. Op verschillende tijdstippen na infectie, oogst gemiddeld in 1,5 ml Eppendorf buizen. Was de cellen met koude PBS en laat geïnfecteerde cellen door trypsine digestie.
8. Meet antivirale cytokines in medium zoals beschreven in stap 1.5.
9. Extract RNA, bereiden cDNA en het uitvoeren van qRT-PCR om antivirale cytokine genexpressie te bepalenzoals beschreven in stappen 1.5-1.7.

3. Lentivirus productie, infectie en generatie van stabiele cellijnen

1. Split 293T cellen een dag voor transfectie en laat de cellen ~ 40% confluentie bereiken op het moment van transfectie.
2. Transfecteren 10 cm schotel van 293T cellen met de verpakking plasmiden (1,2 ug pVSV-G en 6 ug pDR8.9) en 7,2 ug pCDH-FLAG-MAVS of pCDH controle door calciumfosfaatprecipitatie.
3. Vervang medium bij 6-8 uur na transfectie met verse volledige DMEM.
4. Op 72 uur na transfectie, verzamel medium dat lentivirus, centrifuge bij 4000 xg gedurende 15 minuten en filter met 0,22 urn membraan. De lentivirus titer verhogen centrifuge we-virus bevattend medium bij 110.000 xg gedurende 2,5 uur bij 4 ° C. Resuspendeer de virale pellet voorzichtig in kleine volume medium van belang.
5. Seed Mavs ^{- / -} MEF-cellen of andere knockout MEF cellen een dag before infectie in 6-well platen bij ongeveer 30-40% confluentie.
6. Infect MEF cellen met 1 ml lentivirus en 2 ml vers compleet DMEM, aangevuld met polybreen tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml.
7. Centrifugeer de plaat bij 500 xg bij 30 ° C gedurende 30 min en breng de plaat een weefselkweek incubator.
8. Vervang medium bij 6 uur na infectie met verse volledige DMEM.
9. Split MEF cellen op 24 uur na infectie en voeg puromycine tot een eindconcentratie van 1 ug / ml op 48 uur na infectie cellen te selecteren die stabiel MAVS.
10. Handhaaf MEF cellen in-puromycine bevattend medium en controleer eiwit expressie door immunoblotting met overeenkomstige antilichamen.
11. Cellen kunnen worden gebruikt voor virusinfecties, cytokine genexpressie en secretie experimenten beschreven in protocol 2.

Representative Results

Drie representatieve cijfers worden hier getoond, met inbegrip van cytokines in de long van γHV68-geïnfecteerde Mavs ^{+ / +} en ^{Mavs-/ -} muis, cytokine secretie en genexpressie niveau van γHV68-geïnfecteerde Mavs ^{+ / +} en Mavs ^{- / -} MEF, en cytokine mRNA niveaus van γHV68 geïnfecteerde Mavs ^{- / -} MEF "opgelost" met MAVS. Deze representatieve experimenten benutten knockout muizen antivirale cytokine productie in vivo te onderzoeken en verkennen knockout MEF tot het mechanisme van gereguleerde cytokine productie ex vivo ontleden. Specifiek γHV68 infectie van Mavs ^{- / -} muizen leidde tot significant hogere productie van CCL5 in vivo. Mavs ^{- / -} MEF produceerde meer antivirale cytokine dan Mavs ^{+ / +} MEF tijdens γHV68 infectie, die de in vivo fenotype recapituleert. "Gereconstitueerdstitueerde "expressie van MAVS in Mavs ^{- / -} MEF verminderde CCL5 productie Tezamen tonen deze resultaten aan dat MAVS is noodzakelijk γHV68 antivirale cytokine productie onderdrukken zowel in vivo als ex vivo..

Figuur 1. γHV68 acute infectie veroorzaakt hogere cytokines in de longen van Mavs ^{- / -} muizen dan in MAV ^{+ / +} muizen. Leeftijd en geslacht gematchte Mavs ^{+ / +} en Mavs ^{- / -} muizen werden intranasaal geïnfecteerd met 40 PFU van γHV68 en CCL5 in het besmette longen op aangegeven dagen na infectie werd gemeten met behulp van ELISA. γHV68 infectie van Mavs ^{- / -} muizen leidde tot significant hogere productie van antivirale cytokine CCL5, die suggereerde dat MAVS is noodzakelijk voor γHV68 antivirale cytokine productie onderdrukken. De gegevens worden als het gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM). De statistische significantie: *, p <0,05; **, p <0,02. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2. Bij γHV68 infectie, Mavs ^{- / -} MEF produceerde meer antivirale cytokine dan Mavs ^{+ / +} MEF Mavs ^{+ / +} en Mavs ^{-. / -} MEF waren geïnfecteerd met γHV68 en geoogst bij bepaalde uur na infectie (HPI), CCL5 in het supernatant werd beoordeeld met ELISA (A) en genexpressie in MEF cellen door kwantitatieve real-time PCR (B). The resultaten van Mavs ^{- / -} MEF besmet met γHV68 recapituleren die van γHV68 geïnfecteerde Mavs ^{- / -} muizen. De gegevens worden als het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. De statistische significantie:. **, P <0,02, *** p <0,005 Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3. "Gereconstitueerde" expressie van MAVS in Mavs ^{- / -} MEF verminderde productie CCL5 (A) Mavs ^{-. / -} MEF werden geïnfecteerd met controle of MAVS lentivirus-expressie en de expressie van MAVS werd geanalyseerd door immunoblotting. (B) Mavs ^{- / -} MEF "opgelost" met MAVS waren geïnfecteerd met γHV68. MEF werden geoogst op de aangegeven uur na infectie (hpi) en RNA werd geanalyseerd door kwantitatieve real-time PCR met primers specifiek voor CCL5. De gegevens worden als het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. De statistische significantie:. **, P <0.02 Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussion

Virale immuun ontduiking is een van de meest dynamische en boeiende interacties interfacing virale aanval en afweer ^9. De gastheer aangeboren immuunsysteem componenten zijn zodanig dat signaaltransductie effectief wordt geïnitieerd en getrouw doorgegeven gestructureerd. Afbakening van de hiërarchie en de regulering van signaleringscascades is een vooraanstaande onderwerp van aangeboren immuniteit. Hier introduceren we een protocol bij de regulerende rol van een aangeboren immuun component, MAVS, in virale ontduiking van cytokine productie te identificeren. Het protocol omvat een werkwijze bepalen cytokine productie in virus-geïnfecteerde muis en beoordelen van cytokine genexpressie en productie in MEF. Het gen knockout MEF en muis bieden instrumenten die de genetische en biochemische dissectie van proteïne functie in vivo en ex vivo mogelijk te maken. Gebouwd op genetisch gemodificeerde muizenstammen, waarvan vele zijn commercieel verkrijgbaar en aantal daarvan stijgt in versneld tempo deze protocol verder verkent de "gereconstitueerde" expressie van wild-type of gemuteerd eiwit van belang door lentivirus. Een mogelijke beperking van de "gereconstitueerde" uitdrukking van aangeboren immuunsysteem componenten is de ongewenste immuun signalering veroorzaakt door exogene expressie, die virale infectie en signaaltransductie daarvan van invloed kunnen zijn. Optimalisatie om lage niveau van expressie vergelijkbaar met endogene niveaus te verwezenlijken kunnen de bijwerkingen verminderen. In het geval van een mutant eiwit uitvoering gerichte "letsels" wordt gebruikt, zal het ons toelaten om de functie van een bepaald domein, post-translationele modificatie, of eiwit-eiwit interacties lokaliseren in immuunregulatie bij virale infectie. Als "gereconstitueerde" cellen worden getransplanteerd in knockout muis, kan in vivo functie van geselecteerde immuun componenten of gerichte mutant worden onderzocht.

Vergeleken met de "knock-in" of transgene expressie van mutante eiwitten, "reconstituted "expressie van wild-type of gemuteerd eiwit van belang door lentivirus is meer kosten-en tijd-efficiënt, waardoor het onderzoek met diverse winst-en verlies-van-functie mutanten. De kritische stap van het hele protocol is dat het opgeloste eiwit vergelijkbaar met endogeen eiwit niveau moet, vooral wanneer het eiwit een enzym of transcriptiefactor. Over-expressie van sommige eiwitten kunnen leiden tot afwijkende activering van de signaalroute en dubbelzinnige resultaten.

Hoewel ons protocol richt zich vooral op muizen fibroblasten, die grotendeels te wijten aan de intrinsieke regulatie van ingeboren immune component op γHV68 replicatie, kunnen soortgelijke toepassingen worden uitgebreid tot andere immuun bestanddelen, waaronder macrofagen en dendritische cellen. Bovendien kunnen deze methoden worden aangepast om mechanistische studies dienden diverse pathogenen. De applicatie is in opkomst ¹² en zal waarschijnlijk meer-centrum opgevoerd rollen in de toekomst te nemen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA