הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

Summary

אנו מתארים פרוטוקול למדוד את ייצור ציטוקינים אנטי בעכברים נגועים בוירוס ההרפס מודל, וירוס ההרפס עכברי גמא 68 (γ HV68) הקשור-הדוק לההרפס של קפוסי האנושי הקשורים סרקומה (KSHV) ווירוס אפשטיין בר (EBV). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי וfibroblasts העכבר העוברי (MEFs), אנחנו הערכנו את ייצור ציטוקינים אנטי גם in vivo לשעבר vivo. "בנייה מחדש" את הביטוי של מרכיבי חיסון מולדים בfibroblasts העוברי בנוקאאוט על ידי התמרה lentiviral, אנחנו עוד לאתר מולקולות חיסון מולדים ספציפיות ולנתח את אירועי איתות מפתח שדיפרנציאלי להסדיר את ייצור ציטוקינים אנטי.

Abstract

בתגובה לזיהום נגיפי, התגובה החיסונית המולדת המארח מופעלת כדי למעלה לווסת ביטוי גנים וייצור של ציטוקינים אנטי. לעומת זאת, וירוסים התפתחו אסטרטגיות מורכבות להתחמק ולנצל את איתות חיסונית מארחת להישרדות ולרבייה. התחמקות חיסונית נגיפית, כרוך הגנת מארחת והעלמת נגיפית, מספקת את אחד הממשקים המרתקים ודינמיים ביותר להבחין באינטראקציה מארח וירוס. מחקרים אלה מקדמים את ההבנה שלנו בויסות מערכת החיסונית מולדת ולסלול את הדרך שלנו לפתח טיפולים אנטי רומן.

Murine γHV68 הוא הפתוגן טבעי של מכרסמים עכבריים. γHV68 זיהום של עכברים מספק מודל חיה קטן צייתן כדי לבחון את התגובה אנטי לKSHV אדם וEBV שהפרעות של in vivo אינטראקציות מארח וירוס אינה ישימות. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לקבוע את ייצור ציטוקינים אנטי. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לvir האחרמשתמש ואיתות מסלולים.

לאחרונה, גילו כי γHV68 חטיפת Mavs וIKKβ, רכיבי מפתח מולדים חיסוניים איתות במורד הזרם של RIG-I cytosolic וMDA5, כדי לבטל את הפעלת NFΚB וייצור ציטוקינים אנטי. באופן ספציפי, זיהום γHV68 מפעיל IKKβ ושIKKβ הופעל phosphorylates רלה להאיץ השפלה רלה. ככזה, HV68 γ יעילות uncouples הפעלת NFΚB מIKKβ הופעל במעלה הזרם שלו, שולל את ביטוי גני ציטוקינים אנטי. מחקר זה מבהיר אסטרטגיה מורכבת לפיה הפעלת מערכת החיסון המולדת במעלה הזרם הוא יורטה על ידי פתוגן ויראלי כדי לבטל את הפעלת תעתיק מורד הזרם המיידית ולהתחמק ייצור ציטוקינים אנטי.

Introduction

מחקרים שנעשו לאחרונה תארו את מפלי איתות הכוללים בהרכבת מערכת חיסונית מולדת מארח. המתגורר בתוך תאים נפרדים, קולטני זיהוי תבניות (PRRs) לזהות דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ממוצא המגוון כדי לעורר חיסון מולדים איתות ^1. הגן רטינואית-Induced חומצתי (RIG-I) ואנטיגן בידול מלנומה 5 חלבונים (MDA5) הם חיישני cytosolic שיכירו מיני RNA עם תכונות מבניות ספציפיות ^2. עם ההפעלה, RIG-I אינטראקציה עם Mavs ההמשך שלה (הידוע גם בIPS-1, ויזה, וCARDIF) מתאם זה, בתורו, מפעיל את IKK (IKKαβγ) וקינאז הקשורות IKK (TBK1 וIKKε, הידוע גם Ikki ) קומפלקסי ^3-6. קינאזות חיסון המולדת מופעלת phosphorylate רגולטורים מפתח של ביטוי גנים, ובם גורמי שעתוק ומעכביהם, ולאפשר הפעלת תעתיק של גנים אנטי מארח (למשל IL6, TNF & #945;, CCL5, וIFNβ). מפלי איתות אלה מהווים תגובות עוצמה פנימיות מולדת חיסונית שלהקים מדינה אנטי מיקרוביאליים להגביל את התפשטות הפתוגן במהלך של זיהום בשלבים מוקדמים.

Murine γHV68 קשור קשר הדוק לKSHV שעור האדם וEBV. לכן, זיהום γHV68 של עכברים מספק מודל חיה קטן צייתן כדי לבחון את התגובה החיסונית המארחת לזיהום בנגיף הרפס גמא in vivo ^7. שימוש γHV68, המעבדה שלנו חשפה אסטרטגיה מורכבת לפי γHV68 חטיפת לארח איתות חיסונית מולדת כדי לאפשר הדבקה בנגיף. מצד אחד, γHV68 מפעיל את מסלול Mavs-IKKβ לקדם הפעלת תעתיק ויראלי באמצעות בימוי IKKβ הופעל לphosphorylate transactivator שכפול (להרכבה עצמית), המפתח גורם שעתוק הנגיפי עבור שכפול γHV68 ^8. מצד השני, זירחון תיווך IKKβ מספרים ראשוני רלה לשפלה וטווחinates NFΚB הפעלת ^9. ככזה, זיהום γHV68 יעיל ימנע ייצור ציטוקינים אנטי. מעניין, הקרנת ניצול ספריית ביטוי של γHV68 זיהתה הרכבה עצמית כאנזים E3 כדי לגרום השפלה רלה ולבטל NFΚB הפעלת ^10. ממצאים אלה לחשוף אסטרטגיית התחמקות חיסונית מורכבת לפיה אירועי איתות חיסוניים נגד הזרם הם רתמו על ידי γHV68 לשלול את ייצור ציטוקינים אנטי האולטימטיבי.

כאן אנו מתארים פרוטוקול למדוד את ייצור ציטוקינים אנטי בעכברים נגועים בγHV68 גם in vivo לשעבר ויו o. בפרוטוקול אנחנו עוד לחקור את הביטוי "מחדש" של רכיבים חיסוניים מולדים בfibroblasts העוברי בנוקאאוט על ידי התמרה lentiviral, אשר מאתרת את הפונקציה של מולקולות חיסון המולדים הספציפיות בויסות ייצור ציטוקינים אנטי. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לviru האחרses ומסלולי איתות.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל העבודה בבעלי החיים בוצעה תחת בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) מאוניברסיטת הדרום קליפורניה.

1. ביטוי גני ציטוקין ידי Real-Time PCR כמותי והפרשה על ידי ELISA בעכברים נגועים ב-γHV68

1. הרדימי, C57BL / 6 להמלטת בהתאמה מגדר 6-8 שבועות בן (B6) (8-12 עכברים / קבוצה) באמצעות הזרקת intraperitoneally 1.5 מ"ג ketamine/0.12 מ"ג xylazine, ולחסן intranasally עם 40 PFU של γHV68 ב40 μl (זיהום מפורט בדונג ^ו11 פנג). בנקודות זמן שונות לאחר פגיעה, להרדים את העכברים באמצעות משאיפת CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם.
2. פתח את החזה עם חתך רוחב שמאל לאורך sternum ולחתוך דרך הצלעות במספריים חדים. לאסוף את רקמות הריאה.
3. לאסוף מחצית מרקמת הריאה (אונה השמאלית) לתוך צינורות 1.5 מיליליטר בורג הכתיר סטרילי המכילים 500 μl חרוזים Zirconia / סיליקה 1.0 מ"מ. הוסף 1 מיליליטר של סרום ללא DMEM הקר לתוך הצינור וhomogenize רקמת הריאה על ידי חרוז הכאה ל30 שניות. צ'יל צינורות על קרח במשך 2 דקות ולחזור על תהליך זה פעם אחת.
4. צנטריפוגה הצינורות (15,000 x גרם ל10 דקות) בשעה 4 ° C, לאסוף את supernatant ולמדוד את ייצור ציטוקינים כמתואר להלן.
5. מדוד ציטוקינים באמצעות ערכות ELISA ציטוקינים זמינות מסחרי על פי הוראות היצרן.
6. לאסוף את החצי השני של רקמת הריאה (אונה ימנית) לתוך צינור המכיל חרוז אחר ולהוסיף TRIzol 1 מיליליטר. Homogenize ולאסוף supernatant כמתואר בשלב 1.3 ו-RNA תמצית על פי ההוראה של הייצור. לקבוע את ריכוז RNA על ידי לקיחת קריאות הספיגה ב 260 ו280 ננומטר. הכן cDNA עם 1 מיקרוגרם של רנ"א הכל ולהפוך טרנסקריפטאז על פי ההוראה של הייצור (הנפח הסופי בסך הכל היה 20 μl). לדלל cDNA 50 פעמים עם DNAse וRNase ללא מים ולבצע בזמן אמת PCR כמוני.
7. לבצע את התכנית על מחשב בזמן אמת PCR כמותית. כל תגובה מכילה 0.5 μl של זוג פריימרים גן ספציפי או פריימרים שליטת GAPDH (ריכוז העבודה של פריימרים היו 10 מיקרומטר, CE 500 ננומטר עבור כל צבע יסוד), 5 μl של מיקס מאסטר SYBR ו4 μl של דילול מלא cDNA. חישוב ΔΔCt כדי לקבוע את הכמות היחסית של תעתיקי mRNA של ציטוקינים אנטי.

2. זיהום MEF נייד וציטוקין כימות על ידי ELISA וqRT-PCR

1. לגדול Mavs ^{+ / +} וMavs ^{- / -} תאי MEF לצפיפות תת מחוברות (כ 80%) לפני תאי ציפוי.
2. פיצול תאי MEF ל12צלחות ll וב100,000 תאים / (צפיפות התאים תהיה סביב 70% ביום השני). לבצע את זיהום γHV68 בtriplicates, עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 5-10 לסנכרון ולמקסם את האינדוקציה ציטוקינים.
3. הכן את ההשעיה γHV68 בינוני מלא DMEM המכיל כמות מתאימה של וירוס (1 מיליליטר לכל טוב).
4. הסר בינוני ולהוסיף השעיה γHV68 המכיל תאי MEF.
5. מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממה, רוק כל 30 דקות, ולאפשר כולל של 2 שעות של דגירה.
6. הסר בינוני המכיל γHV68, לשטוף פעם עם PBS, ולהחליף עם DMEM להשלים טרי.
7. בזמן שונים מציין שלאחר זיהום, בינוני קציר ל1.5 צינורות מיליליטר Eppendorf. שטוף תאים עם PBS הקר ולאסוף תאים נגועים על ידי טריפסין עיכול.
8. מדוד ציטוקינים אנטי במדיום כמתואר בשלב 1.5.
9. חלץ RNA, להכין cDNA ולבצע qRT-PCR כדי לקבוע ביטוי גני ציטוקינים אנטיכפי שמתואר ב1.5-1.7 צעדים.

3. הפקת lentivirus, זיהום, ודור של שורות תאי יציבות

1. פיצול תאי 293T יום אחד לפני transfection ולאפשר לתאים להגיע ~ confluency 40% בזמן של transfection.
2. Transfect 10 צלחת סנטימטר של תאי 293T עם פלסמידים האריזה (1.2 מיקרוגרם של pVSV-G ו6 מיקרוגרם של pDR8.9) ו7.2 מיקרוגרם של pCDH-FLAG-Mavs או pCDH שליטה על ידי משקעים סידן זרחה.
3. החלף בינוני ב6 עד 8 שעות לאחר transfection עם DMEM להשלים טרי.
4. ב72 לאחר transfection שעות, לאסוף lentivirus בינוני המכיל, צנטריפוגות ב 4,000 XG במשך 15 דקות, ומסנן עם 0.22 מיקרומטר הממברנה. כדי להגדיל את כייל lentivirus, אנו צנטריפוגות בינונית המכיל הווירוס ב110,000 XG במשך 2.5 שעות ב 4 ° C. resuspend בזהירות את גלולה נגיפית בנפח קטן של מדיום של עניין.
5. Mavs זרע ^{- / -} תאי MEF או תאי MEF נוקאאוט אחרים יום אחד befoמחדש זיהום ב6 צלחות היטב ב ~ confluency 30-40%.
6. להדביק תאי MEF עם lentivirus 1 מיליליטר ו 2 מיליליטר DMEM השלם טרי, בתוספת polybrene לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
7. צנטריפוגה את הצלחת ב XG 500 ב30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולהעביר את הצלחת לחממה בתרבית רקמה.
8. החלף בינוני ב6 שעות לאחר פגיעה עם DMEM להשלים טרי.
9. פיצול תאי MEF ב24 לאחר זיהום שעה ולהוסיף puromycin לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מיליליטר ב48 לאחר זיהום שעה לבחור תאים ביציבות להביע Mavs.
10. שמור על תאי MEF במדיום המכיל puromycin ולאמת ביטוי חלבון על ידי immunoblotting עם נוגדנים מתאימים.
11. תאים יכולים לשמש לזיהום נגיפי, ביטוי גנים וציטוקינים ניסויי הפרשה כפי שתואר בפרוטוקול 2.

Representative Results

שלוש דמויות נציג מוצגות כאן, כוללים ייצור ציטוקינים בריאות של Mavs נגוע γHV68 ^{+ / + וMavs-/ -} רמת עכבר, הפרשת ציטוקינים וביטוי גנים של Mavs נגוע γHV68 ^{+ / +} וMavs ^{- / -} MEFs, ו רמות ה-mRNA של ציטוקינים Mavs נגוע γHV68 ^{- / -} MEFs "מחדש" עם Mavs. ניסויי נציג אלה לנצל עכברי נוקאאוט גנטיים כדי לחקור ייצור ציטוקינים אנטי in vivo ולחקור MEFs נוקאאוט לנתח את המנגנון של ייצור ציטוקינים המוסדר vivo לשעבר. באופן ספציפי, זיהום γHV68 של Mavs ^{- / -} עכברים הובילו לייצור גבוה יותר באופן משמעותי של CCL5 in vivo. Mavs ^{- / -} MEFs מיוצר ציטוקינים אנטי יותר מ Mavs ^{+ / +} MEFs במהלך זיהום γHV68, המשחזר את הפנוטיפ in vivo. "Reconstituted "ביטוי של Mavs בMavs ^{- / -} MEFs ירידה בייצור CCL5 ביחד, תוצאות אלו מראות כי Mavs הכרחי לγHV68 לדכא ייצור ציטוקינים אנטי גם in vivo לשעבר vivo..

איור 1. γHV68 זיהום חריף הנגרם על ייצור ציטוקינים גבוה יותר של הריאות של Mavs ^{- / -} עכברים מזה בMavs ^{+ / +} עכברים. הגיל וMavs בהתאמה מין ^{+ / +} וMavs ^{- / -} עכברים נדבקו intranasally עם 40 PFU של γHV68 וCCL5 של הריאות נגועות בימים מצויין לאחר הזיהום נמדד על ידי ELISA. γHV68 זיהום של Mavs ^{- / -} עכברים הובילו לייצור גבוה יותר באופן משמעותי של ציטוקין אנטי CCL5, אשר הציע כי Mavs הכרחי לγHV68 לדכא ייצור ציטוקינים אנטי. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית התקן של הממוצע (SEM). המובהקות הסטטיסטיות: *, p <0.05; ** p <0.02. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. על זיהום γHV68, Mavs ^{- / -} MEFs מיוצר ציטוקינים אנטי יותר מ Mavs ^{+ / +} MEFs Mavs ^{+ / +} וMavs ^{-. / -} MEFs היו נגוע בγHV68 ונקטפו בשעות שצוינו שלאחר זיהום (HPI), CCL5 בsupernatant הוערך על ידי ELISA () וביטוי גנים בתאי MEF ידי כמותית PCR בזמן אמת (ב '). התוצאות דואר של Mavs ^{- / -} MEFs נגוע בγHV68 לשחזר אלה של Mavs נגוע γHV68 ^{- / -} עכברים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM של שלושה ניסויים בלתי תלויים. המובהקות הסטטיסטיות:. ** P <0.02, *** p <0.005 לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. "כששב ל" ביטוי של Mavs בMavs ^{- / -} MEFs ירידה בייצור CCL5 () Mavs ^{-. / -} MEFs היו נגוע בשליטה או Mavs-להביע lentivirus והביטוי של Mavs נותחו על ידי immunoblotting. (ב) Mavs ^{- / -} MEFs "מחדש" עם Mavs היו נגוע בγHV68. MEFs נבצרו בשעות שלאחר הזיהום המצוין (HPI) ו-RNA נותח על ידי בזמן אמת PCR כמו עם פריימרים ספציפיים לCCL5. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM של שלושה ניסויים בלתי תלויים. המובהקות הסטטיסטיות:. ** P <0.02 לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

התחמקות חיסונית נגיפית היא אחת האינטראקציות דינמיות ומרתקות ביותר התממשקות עבירה נגיפית ומארח הגנה ^9. מרכיבי החיסון המולדים המארח בנויים כך שהולכים אותות הוא יזם ביעילות ובמועבר בנאמנות. המגדיר את ההיררכיה ופיקוח על איתות מפלים הוא נושא בולט של חסינות מולדת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות תפקידי הרגולציה של מרכיב מולדים חיסוניים, Mavs, בהעלמה ויראלי של ייצור ציטוקינים. הפרוטוקול כולל שיטת קביעת ייצור ציטוקינים בעכבר נגוע בנגיף והערכת ביטוי גני ציטוקינים וייצור בMEFs. MEFs נוקאאוט הגן והעכבר מספקים כלים המאפשרים לנתיחה הגנטית ביוכימיים של תפקוד חלבון in vivo לשעבר vivo. בנוי על זני עכבר המהונדסים גנטי, אשר רבים מהם זמינים באופן מסחרי, ומספר שהולכים וגדלו בקצב מואץ, יחסי ציבור זהotocol נוסף בוחן את הביטוי "מחדש" של wild-type או חלבון שעבר מוטציה של עניין על ידי lentivirus. מגבלה אפשרית אחד של הביטוי "מחדש" של רכיבים חיסוניים מולדים היא האיתות לא רצויה החיסונית מופעלת על ידי ביטוי חיצוני, אשר עשוי להשפיע על זיהום ויראלי והולכים אותותיה. אופטימיזציה כדי להשיג רמה נמוכה של ביטוי דומה לרמות אנדוגני עשויה להפחית את תופעת הלוואי. במקרה חלבון שעבר מוטציה שנשא "נגעים" ממוקדים משמש, זה יאפשר לנו לאתר את הפונקציה של תחום מסוים, שינוי שלאחר translational, או אינטראקציה בין חלבונים בויסות מערכת החיסונית במהלך זיהום ויראלי. אם תאים "מחדש" הם הושתלו בעכבר נוקאאוט, in vivo פונקציה של רכיבים חיסוניים שנבחרו או מוטציה ממוקדת יכולה להיבחן.

לעומת "עקום" או הביטוי מהונדס של חלבוני מוטציה, "reconstitביטוי uted "של wild-type או חלבון שעבר מוטציה של עניין על ידי lentivirus יותר בעלות וזמן יעיל, המאפשר חקירה עם מוטציות רווח או פסד של פונקציה מגוונות. השלב הקריטי של כל הפרוטוקול הוא שהחלבון מחדש צריך להיות דומה לרמת חלבון אנדוגני, במיוחד כאשר החלבון הוא אנזים או גורם שעתוק. על הביטוי של חלבונים מסוימים עשויים להוביל להפעלה חריגה של מסלול האיתות ותוצאות חד משמעיות.

למרות שהפרוטוקול שלנו מתמקד בעיקר בfibroblasts עכבר, שהוא במידה רבה בשל הרגולציה הפנימית של מרכיב חיסון מולדים בשכפול γHV68, ניתן להרחיב יישומים דומים למרכיבים אחרים של מערכת חיסון, כוללים מקרופאג ותאים דנדריטיים. בנוסף, ניתן להתאים הגישות הללו למחקרים מכניסטית הכרוכים פתוגנים שונים. היישום מתגלה ¹² וסביר להניח שייקח יותר תפקידים מבוימי מרכז בעתיד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA