Summary
我々は、ヒトのカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、およびエプスタイン-バーウイルス（EBV）に密接に関連しているモデルヘルペスウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス68（γHV68）に感染したマウスにおける抗ウイルスサイトカイン産生を測定するためのプロトコルを記載している。遺伝的に改変されたマウス系統およびマウス胚線維芽細胞（MEF）を利用して、我々は、in vivoおよびex vivoの両方の抗ウイルス性サイトカイン産生を評価した。レンチウイルス形質導入によるノックアウト胚性線維芽細胞における自然免疫成分の発現を「再構成」、我々はさらに、特定の自然免疫の分子を特定し、差別的な抗ウイルスサイトカイン産生を調節する重要なシグナル伝達事象を分析。
Abstract
ウイルス感染に応答して、宿主自然免疫応答は、抗ウイルス性サイトカインの遺伝子発現および産生をアップレギュレートに活性化される。逆に、ウイルスが生存と繁殖のために宿主の免疫シグナリングを回避し、悪用する複雑な戦略を進化させてきた。ウイルス免疫回避は、宿主防御およびウイルスの回避を伴う、宿主 - ウイルス相互作用を識別するための最も魅力的でダイナミックなインタフェースのいずれかを提供しています。これらの研究は、先天性免疫調節に我々の理解を進め、新たな抗ウイルス療法を開発する私たちの道を開く。
ネズミγHV68は、ネズミ、げっ歯類の自然な病原体である。マウスのγHV68感染は、in vivoでのウイルス-宿主相互作用の摂動が適用されない人間のKSHVおよびEBVに対する抗ウイルス応答を調べるために扱いやすい小型の動物モデルを提供する。ここでは、抗ウイルス性サイトカイン産生を決定するためのプロトコルを記載している。このプロトコルは、他のvirに適合させることができる使用しており、シグナル伝達経路。
最近では、NFκBの活性化および抗ウイルスサイトカイン産生を排除するために、γHV68がMAVSおよびIKKβ、細胞質ゾル、RIG-IとMDA5のダウンストリームキー自然免疫シグナル伝達成分をハイジャックすることを発見した。具体的には、γHV68感染は、IKKβを活性化し、活性化IKKβは、RelAの劣化を加速させるのRelAをリン酸化する。このように、γHV68を効率的に抗ウイルスサイトカイン遺伝子発現を否定、その上流活性化し、IKKβからNFκBの活性化を脱共役。本研究では、上流の先天性免疫活性化はすぐ下流の転写活性化を無効にし、抗ウイルス性サイトカイン産生を回避するためにウイルス病原体によって傍受される複雑な戦略を解明。
Introduction
最近の研究では、ホスト自然免疫応答を実装する際に、全体的なシグナル伝達カスケードを説明してきました。別個の区画内に存在する、パターン認識受容体（PRR）1シグナリング先天性免疫を誘発するために、多様な起源の病原体関連分子パターン（PAMP）を検出する。レチノイン酸誘導遺伝子I（RIG-I）とメラノーマ分化抗原5（MDA5）タンパク質は、特定の構造的特徴2でRNA種を認識し、細胞質ゾルセンサである。活性化されると、RIG-Iには、IKKiはとして知られ、その下流MAVS（また、IPS-1、VISA、およびCARDIFとして知られている）今度は、IKK（IKKαβγ）およびIKK関連キナーゼ（TBK1とIKKεを活性化し、アダプターと対話）3-6錯体。先天性免疫活性化キナーゼは、 例えば、IL6、TNF＆＃（その転写因子および阻害剤を含む、遺伝子発現の重要な調節因子をリン酸化し、宿主の抗ウイルス遺伝子の転写活性化を有効にする945;、CCL5、およびIFNβ）。これらのシグナル伝達カスケードは、感染の初期段階で病原体の伝播を制限する抗微生物状態を確立するための強力な内因性自然免疫応答を構成する。
ネズミγHV68は、人間の発癌KSHVおよびEBVに密接に関連している。従って、マウスのγHV68感染は、インビボ7におけるガンマヘルペスウイルス感染に対する宿主免疫応答を調べるために扱いやすい小動物モデルを提供する。 γHV68がウイルス感染を有効にするには、自然免疫のシグナル伝達をホストするハイジャックすることによりγHV68を使用して、私たちの研究室では、複雑な戦略を明らかにした。一方では、γHV68、複製ベーター（RTA）、γHV68複製8用のウイルス転写因子キーをリン酸化するために活性化IKKβを演出経由のウイルス転写活性化を促進するためのMAVS-IKKβ経路を活性化する。一方、IKKβ媒介リン酸化は劣化と任期のRelAをプライミングNFκB活性化9 inates。このように、γHV68感染を効果的に抗ウイルスサイトカインの産生を回避する。興味深いことに、γHV68の発現ライブラリーを用いたスクリーニングにより、RelAの分解を誘導し、NFκB活性化10を排除するE3リガーゼとして、RTAを同定した。これらの知見は、上流の免疫シグナルイベントは、究極の抗ウイルスサイトカイン産生を否定するγHV68によって利用されることにより、複雑な免疫回避戦略を明らかにします。
ここでは、in vivoおよびEX VIV Oの両方γHV68に感染したマウスにおける抗ウイルスサイトカイン産生を測定するためのプロトコルを記述します。プロトコルでは、我々はさらに、抗ウイルスサイトカイン産生を調節することで特定の自然免疫の分子の機能をピンポイントレンチウイルス形質導入によってノックアウト胚性線維芽細胞における自然免疫成分の「再構成」という表現を探る。このプロトコルは、簡単に他のヴィルに適合させることができるSESとシグナル伝達経路。
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Protocol
倫理声明：すべての動物の作品は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って下で行った。プロトコルは、南カリフォルニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）により承認された。
1。 γHV68感染マウスにおけるELISAによる定量的リアルタイムPCRおよび分泌によりサイトカイン遺伝子発現
- 腹腔内キシラジンのketamine/0.12 Mgを1.5 mgの注射を経由して性別が一致する、6-8週齢のC57BL / 6（B6）同腹仔（8月12日マウス/群）を麻酔し、40μlのγHV68の40 PFUを鼻腔内接種（ドンと風水11で詳述感染症）。異なる時点で、感染後、頸椎脱臼、続いてCO 2吸入を使用して、マウスを安楽死させる。
- STER沿って左横のカットで胸を開きnumと鋭いハサミで肋骨を切断。肺組織を収集します。
- 500μlの1.0ミリメートルジルコニア/シリカビーズを含む滅菌1.5ミリリットルスクリューキャップチューブに肺組織（左葉）の半分を収集します。チューブに冷たい無血清DMEMの1ミリリットルを加え、30秒間ビーズ打つことによって肺組織を均質化する。 2分間氷上にチューブを冷却し、一度このプロセスを繰り返します。
- 遠心管（15000 X 4°Cで10分間グラム）、上清を収集し、下記のようにサイトカイン産生を測定する。
- 製造業者の指示に従って市販のサイトカインELISAキットを使用してサイトカインを測定します。
- 別のビーズを含むチューブに肺組織（右葉）の残りの半分を収集し、1ミリリットルのTRIzolを追加。均質化し、製造者の指示に従って、ステップ1.3、抽出RNAで説明したように、上清を集める。 260および280 nmの吸光度の測定値を取ることによって、RNA濃度を決定します。 1μgの全RNAをcDNAを調製し、（総最終容量は20μlであった）製造者の指示に従って逆転写酵素。 DNアーゼとRNaseフリー水を用いてcDNAを50回希釈し、定量リアルタイムPCRを行う。
- 定量リアルタイムPCR機器上のプログラムを実行します。各反応は、GAPDHの遺伝子特異的プライマーまたはコントロールプライマーの対の0.5μL（プライマーの作業濃度は、各プライマーのためのCE 500 nMの10μMであった）、SYBRマスターミックスおよび希薄化後の4μLの5μLが含まれていますcDNAを。抗ウイルスサイトカインのmRNA転写物の相対量を決定するためにΔΔCTを計算します。
2。 ELISAおよび定量RT-PCRによるMEF細胞感染およびサイトカイン定量
- マーベリック+ / +およびマーベリックを育てる- / -細胞を播種する前に、サブコンフルエント（約80％）密度にMEF細胞。
- 12-WEにMEF細胞を分割うまく100,000細胞/ AT LLプレート（細胞密度は二日目に約70％になります）。サイトカイン誘導を同期して最大化する5月10日の感染多重度（MOI）で、三重でγHV68感染を実施しています。
- ウイルスの適切な量を含有する完全DMEM培地（各ウェル1ml）にγHV68懸濁液を調製する。
- 培地を除去し、MEF細胞にγHV68含有懸濁液を追加します。
- 組織培養インキュベーター中でプレートを置き、30分毎岩、インキュベーションの2時間の合計を可能にする。
- 、γHV68含有培地を外し、PBSで1回洗浄し、新鮮な完全DMEMと交換してください。
- 種々の時点で1.5mlのエッペンドルフチューブに感染後、収穫媒体を指す。冷PBSで細胞を洗浄し、トリプシン消化に感染した細胞を収集します。
- ステップ1.5で説明したように培地中の抗ウイルスのサイトカインを測定します。
- RNAを抽出し、cDNAを調製し、抗ウイルス性サイトカイン遺伝子発現を決定するために、定量RT-PCRを行うことステップ1.5から1.7で説明したように。
3。レンチウイルスの生産、感染症、安定した細胞株の生成
- トランスフェクションの一日前に、スプリット293T細胞、細胞は、トランスフェクションの時点で約40％コンフルエンシーに到達させる。
- パッケージングプラスミド（1.2のpVSV-Gのμgのと6μgのpDR8.9の）および7.2 pCDH-FLAG-MAVSまたはリン酸カルシウム沈殿によるpCDHコントロールのμgの293T細胞の10cmディッシュをトランスフェクト。
- 新鮮な完全DMEMで6から8時間後、トランスフェクションで培地を交換してください。
- 72時間トランスフェクション後に、15分間4000×gでレンチウイルス、遠心分離を含む培地を収集し、0.22μmの膜でろ過する。レンチウイルス力価を増加させるために、我々は、4℃で2.5時間、110,000×gでウイルス含有培地を遠心分離慎重に興味のある少量の培地中のウイルスペレットを再懸濁します。
- シードマーベリック- / - MEF細胞や他のノックアウトMEF細胞1日befo〜30-40％の集密度で6 - ウェルプレートでの感染の再。
- を1mlレンチウイルス及び2mlのMEF細胞に感染を10μg/ mlの最終濃度までポリブレンを補充した新鮮な完全DMEM、。
- 30分間30℃で500×gで遠心分離し、プレートを組織培養インキュベーターにプレートを転送する。
- 新鮮な完全DMEMで6時間感染後で培地を交換してください。
- 24時間の感染後に分割MEF細胞を、安定してMAVSを発現する細胞を選択するために48時間感染後に1μgの/ mlの最終濃度までピューロマイシンを追加する。
- ピューロ含有培地中でMEF細胞を維持し、対応する抗体を用いた免疫ブロッティングによってタンパク質の発現を確認します。
- プロトコール2に記載のように、細胞は、ウイルス感染、サイトカイン遺伝子発現および分泌実験のために使用することができる。
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Representative Results
3つの代表的な数値はγHV68感染マーベリックの肺におけるサイトカイン産生を含め、ここに示されている+ / +およびマーベリック- / - / - - γHV68感染マーベリック + / +およびマーベリックのマウス、サイトカイン分泌および遺伝子発現レベルのMEF、およびγHV68感染マーベリックのサイトカインmRNAレベルを- / - MEFをMAVSで「再構成」。これらの代表的な実験は、 インビボで抗ウイルスサイトカインの産生を調査し、ex vivoで調節されたサイトカイン産生のメカニズムを分析するためにノックアウトMEFのを探索するための遺伝子ノックアウトマウスを利用する。具体的には、 マーベリックのγHV68感染- / -マウスは、 生体内での CCL5の有意に高い生産につながった。マーベリック - / - in vivoでの表現型を再現γHV68感染、中にマーベリック + / + MEFをより多くの抗ウイルス性サイトカインを産生したMEF。 「Reconsti「tuted マーベリックでMAVSの発現- / -のMEFは、CCL5産生の減少まとめると、これらの結果はγHV68はインビボおよびエクスビボの両方の抗ウイルスサイトカイン産生を抑制するためのMAVSが必要であることを実証している。
図1。 - / -マウスマーベリック + / +マウスよりγHV68急性感染は、 マーベリックの肺における高いサイトカイン産生を誘導した 。年齢および性別が一致マーベリック+ / +およびマーベリック- / -マウスは、鼻腔内感染後は、ELISA法により測定した指示された日に感染した肺の中γHV68とCCL5の40 PFUで感染させた。 マーベリックのγHV68感染- / -マウスは、抗ウイルスサイトカインのCの有意に高い生産につながったγHV68抗ウイルスサイトカイン産生を抑制するためのMAVSが必要であることを示唆しCL5。データは平均（SEM）の平均±標準誤差として示す。統計的有意性：*、P <0.05; ** P <0.02。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 - / - MEFのはγHV68に感染し、指示された時間で、感染後（HPI）で回収し、CCL5上清中のマーベリック + / +およびマーベリック マーベリック+ / + MEFをより多くの抗ウイルス性サイトカインを産生したMEF - / - γHV68感染、 マーベリック時に定量的リアルタイムPCR（B）でMEF細胞におけるELISA（A）及び遺伝子発現により評価した。目マーベリックのE結果- / - γHV68に感染したMEFはγHV68感染マーベリックのものを再現- / -マウス。データは3回の独立した実験の平均±SEMとして提示されている。統計的有意性：** P <0.02、** P <0.005 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 マーベリック中MAVSの表現"再構成" - / - MEFをCCL5産生の減少 、（A） マーベリック - / - MEFには、コントロールまたはレンチとMAVSの発現は免疫ブロッティングによって分析したMAVS発現を感染させた。 （B） マーベリック - / - MAVSで"再構成" MEFにはγHVに感染していた68。 MEFを、示された時間の感染後（hpiの）で採取し、RNAを、CCL5に特異的なプライマーを用いて定量的リアルタイムPCRによって分析した。データは3回の独立した実験の平均±SEMとして提示されている。統計的有意性：** P <0.02 、より大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
ウイルス免疫回避は、ウイルス攻撃と宿主防御9をインターフェースする最もダイナミックで魅力的な相互作用の一つです。宿主生来の免疫成分は、シグナル伝達を効果的に開始され、忠実に伝達されるように構成されている。シグナル伝達カスケードの階層と規制の輪郭を描くことは自然免疫の抜群の話題です。ここでは、サイトカイン産生のウイルスの回避における自然免疫成分、MAVSの調節的役割を識別するためのプロトコルを紹介する。プロトコルは、ウイルスに感染したマウスにおけるサイトカイン産生を決定し、MEFにおいてサイトカイン遺伝子発現および産生を評価する方法を含む。遺伝子ノックアウトMEFは、マウスは、in vivoおよび ex vivoでのタンパク質機能の遺伝的および生化学的な解剖を可能にするツールを提供しています。市販されており、数は、加速度的にこのPRを増加して、その多くの遺伝子改変マウス系統、上に構築されたotocolさらに野生型またはレンチウイルスによる関心の変異型タンパク質の「再構成」という表現を探る。先天性免疫成分の「再構成」の表現の一つの潜在的な制限は、ウイルス感染およびシグナル伝達に影響を与える可能性がある外因性発現によって引き起こさ望ましくない免疫シグナル伝達である。内因性レベルに匹敵する低レベルの発現を達成するための最適化は、副作用を減少させることができる。 「標的病変」を担持する変異タンパク質が使用される場合には、それは、私たちは、ウイルス感染の間、免疫調節における特定のドメインの機能は、翻訳後修飾、またはタンパク質 - タンパク質相互作用を特定することを可能にする。 「再構成された」細胞はノックアウトマウスに移植された場合、選択された免疫成分または標的化変異体のインビボでの機能を調べることができる。
「ノックイン」または変異タンパク質のトランスジェニック発現、「reconstitに比べレンチウイルスによる野生型または関心の変異タンパク質の発現は、多様なゲインまたは機能喪失変異体での調査を可能とする、よりコストと時間が効果的である」uted。全体のプロトコルの重要なステップであることが再構成されたタンパク質であるタンパク質が酵素や転写因子である場合は特に、内因性タンパク質レベルに匹敵する必要があります。いくつかのタンパク質の過剰発現は、シグナル伝達経路とあいまいな結果の異常な活性化につながる可能性があります。
我々のプロトコルは、主にγHV68複製に対する自然免疫のコンポーネントの固有の規制に起因して、マウスの線維芽細胞、主に焦点を当てているが、同様のアプリケーションは、マクロファージや樹状細胞を含む他の免疫成分、に拡張することができる。さらに、これらのアプローチは、多様な病原体を伴う機構の研究に適合させることができる。アプリケーションでは、12を浮上している、おそらく将来的にはより多くの中央段の役割になります。
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Disclosures
著者らは、利害の衝突を宣言していません。
Acknowledgments
野生型（ マーベリック+ / +）およびノックアウト（ マーベリック- / - ）マウスは、野生型（ マーベリック+ / +）およびノックアウト（ マーベリック- / - ）のMEFは、親切に博士Zhijian J·チェン（大学から提供されたテキサス南西医療センター）13。この出版物は、NIH（R01 CA134241とR01 DE021445）と米国がん協会（RSG-11から162-01-MPC）からの補助金によって資金を供給作業に基づいています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse CCL5 ELISA kit |  R&D Systems |
DY478 | |
| 1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z | |
| TRIzol | Invitrogen |
15596-018 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| CCL5 quantitative real-time PCR primers | |||
| CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC | |||
| ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA |
References
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