Summary
우리는 인간 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)와 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 밀접하게 관련되는 모델 헤르페스 바이러스, 뮤린 감마 허피스 바이러스 68 (γ HV68)로 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인 생성을 측정하기 위해 프로토콜을 설명한다. 유전자 변형 마우스 종자와 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)를 활용하여, 우리는 항 바이러스 사이토 카인 생산 생체 내 및 생체 모두를 평가. 렌티 바이러스 전달하여 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 구성 요소의 표현을 "재구성", 우리는 더 특정 선천성 면역 분자를 정확하게 지적하고 차등 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 조절하는 중요한 신호 이벤트를 해부하다.
Abstract
바이러스 감염에 응답하여, 호스트 선천성 면역 반응은 바이러스 사이토 카인 유전자 발현 및 생산 조절이 최대 활성화된다. 반대로, 바이러스는 생존과 번식을 위해 숙주 면역 신호를 회피하고 악용하는 복잡한 전략을 진화했다. 바이러스 성 면역 회피는 숙주 방어와 바이러스 회피를 수반하는, 호스트 바이러스 상호 작용을 식별하는 가장 매력적이고 역동적 인 인터페이스 중 하나를 제공합니다. 이러한 연구는 선천성 면역 조절에 대한 우리의 이해를 발전시키고 새로운 항 바이러스 치료를 개발하는 우리의 방법을 포장.
쥐 γHV68는 쥐 설치류의 자연 병원체이다. 마우스의 γHV68 감염은 생체 바이러스 호스트 상호 작용의 교란을 적용하지 않은 인간의 KSHV와 EBV에 대한 바이러스 반응을 조사하기 위해 다루기 쉬운 작은 동물 모델을 제공합니다. 여기서 우리는 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 결정하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 VIR에 적용 할 수있다사용 및 신호 통로.
최근에, 우리는 γHV68는 NFκB 활성화 및 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 폐지하는 MAVS와 IKKβ, 세포질 RIG-I와 MDA5의 다운 스트림 키 선천성 면역 신호 구성 요소를 탈취 것을 발견했다. 특히, γHV68 감염 IKKβ를 활성화하고 활성화 된 IKKβ는 상대적 저하를 가속화하기 위해 상대적를 인산화. 따라서, γ HV68 효율적으로 항 바이러스 사이토 카인 유전자 발현을 부정, 상류 활성화 IKKβ에서 NFκB 활성화를 분리됩니다. 이 연구는 상류 선천성 면역 활성화가 즉시 다운 스트림의 전사 활성화를 무효화 및 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 피하기 위해 바이러스 성 병원체에 의해 차단된다 복잡한 전략을 해명.
Introduction
최근의 연구는 호스트 타고난 면역 반응을 설치에서 전체 신호 폭포를 설명했다. 별개의 구획 내에 거주, 패턴 인식 수용체 (PRRS) 1 신호 선천성 면역을 유발하는 다양한 기원의 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)를 감지합니다. 레티노 산에 의한 유전자 I (RIG-I)과 흑색 종 분화 항원 5 (MDA5) 단백질은 특정 구조적 특징 2 RNA 종을 인식 세포질 센서입니다. 활성화되면, RIG-I 차례도 일기당천로 알려진 IKK (IKKαβγ)와 IKK 관련 키나제 (TBK1 및 IKKε을 활성화 어댑터 (또한 IPS-1 비자 CARDIF라고도 함)의 다운 스트림 MAVS와 상호 작용 )는 3-6의 콤플렉스. 활성화 선천성 면역 키나제는 그 전사 인자와 억제 등의 유전자 발현의 핵심 규제를 인산화 및 호스트 항 바이러스 유전자 (예를 들어, IL6, TNF & #의 전사 활성을 가능하게945;, CCL5 및 IFNβ). 이러한 시그널링 캐스케이드는 감염의 초기 단계에서 병원체의 전파를 제한하는 항균성 상태를 확립 유력한 극한 선천성 면역 반응을 구성한다.
쥐 γHV68 밀접하게 인간의 종양 KSHV와 EBV 관련이있다. 따라서, 쥐의 γHV68 감염 생체 7 감마 헤르페스 바이러스 감염 숙주 면역 반응을 조사하는 온순 작은 동물 모델을 제공한다. γHV68 바이러스 성 감염을 가능하게하는 타고난 면역 신호를 호스트 탈취있다 γHV68을 사용하여, 우리 연구소는 복잡한 전략을 발견했다. 한편, γHV68 복제 transactivator (RTA), γHV68 복제 8 바이러스 전사 인자 키를 인산화 활성화 IKKβ 연출을 통해 바이러스의 전사 활성을 촉진하기 위해 MAVS-IKKβ 경로를 활성화합니다. 한편, IKKβ 매개 인산화 저하 및 용어에 대한 상대적를 준비시킨다NFκB 활성화 9 inates. 이와 같이, γHV68 감염 효과적으로 바이러스 사이토 카인 생성을 피한다. 흥미롭게도, γHV68의 표현 라이브러리를 활용하여 심사는 상대적 저하를 유도하고 NFκB 활성화 (10)를 폐지하는 E3 리가 아제로 RTA을 확인했다. 이러한 연구 결과는 상류 면역 신호 이벤트가 궁극적 인 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 부정하기 γHV68에 의해 무력화되어있다 복잡한 면역 회피 전략을 발견.
여기에서 우리는 생체 내에서와 전 비브 O 모두 γHV68에 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 측정하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜에서 우리는 상기 바이러스 사이토킨 생성 조절에 특정 선천성 면역 분자의 기능을 정확하게 지적 렌티 바이러스 형질 도입에 의해 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 성분 "재구성"표현을 찾아. 이 프로토콜은 쉽게 다른 비루에 적용 할 수있다SES와 신호 전달 경로.
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Protocol
윤리 정책 : 모든 동물의 작업은 건강의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 설치에서 수행 하였다. 프로토콜은 남부 캘리포니아 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았다.
1. γHV68에 감염된 마우스의 ELISA로 정량 실시간 PCR 및 분비에 의한 사이토 카인 유전자 발현
- 복강 자일 라진의 ketamine/0.12 MG 1.5 mg의 주입을 통해 성별을 일치 6-8 주령 C57BL / 6 (B6) 한배 새끼 (8-12 마우스 / 그룹) 마취, 40 μL에 γHV68 40 PFU와 비강 접종 (동과 펭 11에 자세히 감염). 서로 다른 시간 지점에서 후 감염, 자궁 경부 전위 다음 CO 2 흡입을 사용하여 쥐를 안락사.
- 아이돌 마스터를 따라 왼쪽 측면 컷으로 가슴을 열고숫자와 날카로운 가위로 갈비뼈를 잘라. 폐 조직을 수집합니다.
- 500 ㎕의 1.0 mm 지르코니아 / 실리카 비드를 포함하는 멸균 1.5 ML 스크류 캡 튜브에 폐 조직 (왼쪽 엽)의 절반을 수집합니다. 튜브에 차가운 혈청이없는 DMEM의 1 ML을 추가하고 30 초 동안 비드 박동에 의해 폐 조직을 균질화. 2 분 동안 얼음에 튜브를 진정 한 번이 과정을 반복합니다.
- 튜브 (15,000 X를 원심 분리기 4 ° C에서 10 분)에 대한 G는, 상층 액을 수집하고 아래에 설명 된대로 사이토 카인의 생산을 측정합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 시중에서 사이토 카인 ELISA 키트를 사용하여 사이토 카인을 측정합니다.
- 다른 비드 함유 튜브에 폐 조직 (우엽)의 나머지 절반을 수집하고 1 ㎖의 트리 졸을 추가합니다. 균질화 및 제조업체의 지시에 따라 단계 1.3 및 추출 RNA에 설명 된대로 상층 액을 수집합니다. 260 및 280 nm에서 흡광도 판독 값을 고려하여 RNA 농도를 결정합니다. 총 RNA 1 μg과의 cDNA를 준비하고 제조의 명령 (총 최종 부피가 20 μL이었다)에 따라 역전사. DNA 분해 효소 및 RNase가없는 물과 cDNA를 50 배 희석하여 정량 실시간 PCR을 수행합니다.
- 정량적 실시간 PCR 기계에서 프로그램을 수행합니다. 각각의 반응이 GAPDH (프라이머의 작업 농도 각 프라이머 10 μM, CE 500 ㎚ 인이었다)의 유전자 특이 프라이머 또는 제어 한 쌍의 프라이머 0.5 μl를 포함, SYBR 마스터 믹스의 5 μL와의 4 μL는 희석 cDNA를. 항 바이러스 사이토 카인의 mRNA의 성적의 상대적인 양을 결정하는 ΔΔCT을 계산합니다.
2. ELISA와 QRT-PCR에 의한 MEF 세포 감염 및 사이토 카인 정량
- 매버릭스 + / + 및 매버릭스 성장 - / - 세포를 도금하기 전에 하위 합류 (약 80 %) 밀도에 MEF 세포.
- 12 - 우리에 MEF 세포를 분할100,000 개 세포 / (세포 밀도가 두 번째 날에 약 70 %가됩니다)에서 LL 접시. 사이토 카인의 유도를 동기화하고 극대화하기 위해 5 ~ 10의 감염의 다중성 (MOI)와, 삼중의 γHV68 감염을 수행하십시오.
- 바이러스의 적당량 (각 웰에 대한 1 ㎖)를 포함하는 완전한 DMEM 매체에 γHV68 현탁액을 준비합니다.
- 매체를 제거하고 MEF 세포에 γHV68 함유 현탁액을 추가합니다.
- , 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓고 30 분마다 바위, 배양의 2 시간의 총 수 있습니다.
- , γHV68 함유 매체를 제거 PBS로 한번 씻어 신선한 완전한 DMEM으로 교체합니다.
- 다양한 시간에 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 감염 후, 수확 매체를 가리 킵니다. 차가운 PBS로 세포를 세척하고 소화를 트립신에 의해 감염된 세포를 수집합니다.
- 단계 1.5에 설명 된대로 매체에 항 바이러스 사이토 카인을 측정합니다.
- , RNA를 추출하는 cDNA를 준비하고 항 바이러스 사이토 카인 유전자 발현을 결정하기 위해 QRT-PCR을 수행단계 1.5-1.7에서 설명한대로.
3. 안정 세포주의 렌티 바이러스 생산, 감염, 및 생성
- 스플릿 293T 세포 일일 형질 감염 전에 세포가 트랜시 ~ 40 % 포화 상태에 도달하는 것을 허용한다.
- 포장 플라스미드 (1.2 pVSV-G ㎍의 6 μg pDR8.9의) 7.2 pCDH-FLAG-MAVS 또는 인산 칼슘 침전에 의해 pCDH 제어 ㎍의와 293T 세포의 10cm 접시 형질.
- 신선한 완전한 DMEM으로 6 ~ 8 시간의 포스트 형질에 매체를 교체합니다.
- 72 시간 사후 형질에서 0.22 μm의 막 중간 포함 렌티 바이러스, 15 분 4,000 XG에 원심 분리기 및 필터를 수집합니다. 렌티 바이러스 역가를 증가시키기 위해, 우리는 4 ℃에서 2.5 시간 동안 110,000 XG에서 바이러스 함유 배지를 원심 분리 조심스럽게 그 중간의 작은 양의 바이러스 성 펠렛을 재현 탁.
- 시드 매버릭스 - / - MEF 세포 또는 다른 녹아웃 MEF 세포 일일 befo~ 30~40%의 포화 상태에서 6 - 웰 플레이트에 감염 재.
- 1 ㎖의 렌티 바이러스 및 10 ㎍ / ml의 최종 농도로 폴리 브렌이 보충 된 2 ㎖의 신선한 완전 DMEM을 가진 MEF 세포를 감염.
- 30 분 동안 30 ° C에서 500 XG에서 접시를 원심 분리기와 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송합니다.
- 신선한 완전한 DMEM으로 6 시간 후 감염에 매체를 교체합니다.
- 분할 MEF의 24 시간 후 감염의 세포와 안정 MAVS를 발현하는 세포를 선택하기 위해 48 시간 게시물 감염에서 1 μg / ML의 최종 농도로 마이신을 추가합니다.
- 퓨로 마이신 함유 배지에서 MEF 세포를 유지하고 대응하는 항체와 면역 블에 의해 단백질 발현을 확인합니다.
- 세포는 바이러스 감염, 사이토 카인 유전자 발현 및 프로토콜이 설명에 따라 분비 실험에 사용될 수있다.
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Representative Results
세 대표 수치는 γHV68에 감염된 매버릭스의 폐에있는 사이토 카인 생산을 포함하여, 여기에 표시됩니다 + / + 및 매버릭스 - / - / - - γHV68에 감염된 매버릭스 + / +와 매버릭스의 마우스, 사이토 카인의 분비와 유전자 발현 수준 MEFs 및 γHV68에 감염된 매버릭스의 사이토 카인 mRNA 수준은 - / - MEFs는 MAVS에 "재구성". 이 대표 실험은 생체 내에서 항 바이러스 사이토 카인 생산을 조사하고 규제 사이토 카인의 생산을 생체의 메커니즘을 해부 녹아웃 MEFs을 탐구하는 유전자 녹아웃 마우스를 사용합니다. 특히, 매버릭스의 γHV68 감염은 - / - 마우스는 생체 내에서 CCL5의 상당히 높은 생산했다. 매버릭스 - / - 더 많은 항 바이러스 사이토 카인을 생산 MEFs 생체 표현형을 되풀이되었습니다 γHV68 감염, 동안 매버릭스 + / + MEFs보다. "Reconsti"tuted 매버릭스에 MAVS의 표현 - / - MEFs는 CCL5 생산을 감소 종합적으로, 이러한 결과는 γHV68은 생체 내 및 생체 모두 항 바이러스 사이토 카인의 생성을 억제하는 MAVS가 필요하다는 것을 보여줍니다..
그림 1. / - - 마우스 매버릭스 + / + 생쥐에 비해 γHV68의 급성 감염은 매버릭스의 폐에 더 높은 사이토 카인 생산을 유도. 나이와 성별을 일치 매버릭스 + / +와 매버릭스는 - / - 마우스는 비강 후 감염이 ELISA로 측정 하였다 표시된 일에 감염된 폐에 γHV68와 CCL5 40 PFU에 감염되었다. 매버릭스의 γHV68 감염은 - / - 마우스는 항 바이러스 사이토 카인 C의 상당히 높은 생산을 주도γHV68 항 바이러스 사이토 카인 생성을 억제하기 위해 MAVS이 필요하다고 제안 CL5. 데이터는 평균 (SEM)의 표준 오차 ± 평균으로 표시하고 있습니다. 통계적 유의성 : * P <0.05, ** p <0.02. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. γHV68 감염되면 매버릭스 - / -. / - - MEFs가 매버릭스 + / + MEFs보다 매버릭스 + / +와 매버릭스보다 항 바이러스 사이토 카인 생성 된 상층 액의 MEFs가 γHV68에 감염된하고, 지정된 시간 후 감염 (HPI)에서 수확을, CCL5 ELISA 정량 실시간 PCR (B)에 의해 MEF 세포 (A) 및 유전자 발현에 의해 평가 하였다. 일매버릭스의 전자 결과는 - / - / - - 마우스 γHV68에 감염된 MEFs는 γHV68에 감염된 매버릭스의 그 요점을 되풀이. 데이터는 세 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SEM으로 표시하고 있습니다. 통계적 유의성 :. ** p <0.02, *** P <0.005 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 매버릭스의 MAVS의 표현 "재구성 된"- / - MEFs는 CCL5 생산 감소 (A) 매버릭스 -. / - MEFs는 제어 또는 렌티 바이러스 및 MAVS의 발현이 면역 블롯 분석 하였다 MAVS 발현에 감염되었다. (B) 매버릭스 - / - MAVS에 "재구성"MEFs는 γHV 감염된68. MEFs가 지정된 시간 후 감염 (HPI)에서 수확 및 RNA는 CCL5 특정 프라이머를 정량적 실시간 PCR로 분석 하였다. 데이터는 세 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SEM으로 표시하고 있습니다. 통계적 유의성 :. **, P <0.02 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
바이러스 성 면역 회피는 바이러스 공격과 숙주 방어 9 인터페이스에서 가장 역동적이고 매혹적인 상호 작용 중 하나입니다. 호스트 타고난 면역 성분은 신호 전달을 효과적으로 시작하고 충실하게 전달되도록 구성되어있다. 폭포 신호의 계층 구조 및 규제를 서술하는 선천성 면역의 발군의 주제입니다. 여기서, 우리는 사이토 카인 생성의 바이러스 기피에 선천성 면역 성분 MAVS의 규제 역할을 식별하기위한 프로토콜을 소개한다. 프로토콜은 바이러스에 감염된 마우스에서 사이토 카인 생성을 결정하고 MEFs에 사이토 카인 유전자 발현 및 생산을 평가하는 방법을 포함한다. 유전자 녹아웃 MEFs와 마우스 생체 내 및 생체 단백질 기능의 유전 적, 생화학 적 절개를 수있는 도구를 제공합니다. 시판과의 수, 가속 속도로이 홍보를 증가되는 많은 유전자 변형 마우스 종자에 내장otocol 더 야생형 또는 렌티 바이러스에 의한 관심의 변이 단백질의 "재구성"표현을 탐구한다. 선천성 면역 성분의 "재구성"표현의 하나의 잠재적 인 제한은 그 바이러스 감염 및 신호 전달에 영향을 미칠 수있는 외생 적 표현에 의해 트리거 원하지 않는 면역 신호입니다. 내인성 수준에 필적하는 식의 낮은 수준을 달성하기 위해 최적화는 부작용을 감소시킬 수있다. 대상 "병변"을 들고 돌연변이 단백질을 사용하는 경우, 그것은 우리가 바이러스 감염시 면역 조절에 특정 도메인의 기능, 번역 후 변형, 또는 단백질 - 단백질 상호 작용을 정확하게 할 수 있습니다. "재구성"세포가 녹아웃 마우스에 이식하는 경우, 선택한 면역 구성 요소 또는 대상 돌연변이의 생체 내 기능을 검사 할 수 있습니다.
"노크에서"또는 돌연변이 단백질의 유전자 발현, "reconstit에 비해야생 형 또는 렌티 바이러스에 의한 관심의 변이 단백질의 uted "표정이 다양한 이득 또는 손실의 기능 돌연변이와 조사를 허용, 더 많은 비용과 시간이 효과적입니다. 전체 프로토콜의 중요한 단계는 그 재구성 된 단백질 단백질이 효소 또는 전사 인자, 특히 내인성 단백질 수준을 비교해야한다. 신호 전달 경로와 모호한 결과 비정상적인 활성화로 이어질 수 과발현 일부 단백질.
우리의 프로토콜이 크게 때문 γHV68 복제에 대한 선천성 면역 성분의 고유 규제입니다 마우스 섬유 아 세포에 주로 초점을 맞추고 있지만, 유사한 응용 프로그램은 대 식세포와 수지상 세포 등 다른 면역 성분, 확장 할 수 있습니다. 또한 이러한 접근은 다양한 병원균을 수반 역학적 연구에 적용될 수있다. 이 응용 프로그램은 12 대두되고 가능성이 앞으로 더 중심 무대 역할을 할 것이다.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
야생형 (매버릭스 + / +) 및 녹아웃 (매버릭스 - / -) 생쥐는 야생형 (매버릭스 + / +) 및 녹아웃 (매버릭스 - / -) MEFs는 친절 박사 Zhijian J. 첸 (대학에 의해 제공되었다 텍사스 남서부 의료 센터) 13. 이 책은 NIH (R01 CA134241 및 R01 DE021445)와 미국 암 협회 (RSG - 11-162-01-MPC)에서 교부금에 의해 투자 작업을 기반으로합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse CCL5 ELISA kit |  R&D Systems |
DY478 | |
| 1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z | |
| TRIzol | Invitrogen |
15596-018 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| CCL5 quantitative real-time PCR primers | |||
| CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC | |||
| ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA |
References
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