Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

Summary

Nós descrevemos um protocolo para medir a produção de citocinas antiviral em camundongos infectados com um vírus do herpes modelo murino herpesvírus gama 68 (γ HV68) que está intimamente relacionada ao sarcoma-associado herpesvírus de Kaposi humana (SKHV) e vírus Epstein-Barr (EBV). Utilizando linhagens de camundongos geneticamente modificados e fibroblastos de rato embrionárias (MEFs), avaliou-se a produção de citocinas anti-viral in vivo e ex vivo. "Reconstituição" a expressão de componentes da imunidade inata em eliminatórias fibroblastos embrionários de transdução lentiviral, nós identificar mais moléculas imunes inatas específicas e dissecar os principais eventos de sinalização que diferencialmente regulam a produção de citocinas anti-viral.

Abstract

Em resposta a uma infecção virai, a resposta imune inata hospedeiro é activado para sobre-regular a expressão do gene e a produção de citocinas anti-virais. Por outro lado, os vírus evoluíram estratégias complexas para iludir e explorar anfitrião sinalização imune para a sobrevivência e propagação. Evasão imune viral, o que implica a defesa do hospedeiro e evasão viral, fornece uma das interfaces mais fascinantes e dinâmicas para discernir a interação hospedeiro-vírus. Estes estudos avançar nossa compreensão na regulação imune inata e pavimentar o caminho para desenvolver novas terapias antivirais.

Murino γHV68 é um agente patogénico natural de roedores murino. γHV68 infecção de camundongos fornece um modelo animal pequeno tratável para examinar a resposta antiviral para SKHV humana e EBV dos quais perturbação da in vivo interações vírus-hospedeiro não é aplicável. Aqui nós descrevemos um protocolo para determinar a produção de citocinas anti-viral. Este protocolo pode ser adaptado para outros virusa e vias de sinalização.

Recentemente, descobrimos que γHV68 seqüestra MAVS e IKKβ, principais componentes inatos sinalização imunes a jusante da cytosolic RIG-I e MDA5, revogar ativação NFkB e produção de citocinas anti-viral. Especificamente, a infecção activa γHV68 IKKβ e que IKKβ activado fosforila RelA para acelerar a degradação RelA. Como tal, γ HV68 desacopla eficazmente a activação de NFkB do seu montante IKKβ activado, eliminando a expressão do gene de citocinas anti-viral. Este estudo elucida uma estratégia em que o complexo de activação imune inata a montante é interceptado por um agente patogénico virai de anular a activação da transcrição imediatamente a jusante e evitar a produção de citocinas anti-viral.

Introduction

Estudos recentes têm descrito as cascatas de sinalização em geral montagem de acolhimento respostas imune inata. Residindo dentro de compartimentos distintos, os receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) detectar padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) de origem diversa para acionar imune inato sinalização ^1. O gene induzida por ácido retinóico I (RIG-I) e antigénio de diferenciação melanoma 5 proteínas (MDA5) são sensores citosólicas que reconhecem espécies de ARN com características estruturais específicas ^2. Após a ativação, RIG-I interage com seus MAVS jusante (também conhecido como IPS-1, VISA, e CARDIF) adaptador que, por sua vez, ativa a IKK (IKKαβγ) e relacionadas à IKK quinase (TBK1 e IKKε, também conhecido como Ikki ) complexos ^3-6. Quinases imune inata ativadas fosforilam reguladores chave de expressão de genes, incluindo fatores de transcrição e inibidores dos mesmos, e permitir a ativação da transcrição de genes virais de acolhimento (por exemplo, IL6, TNF & #945;, CCL5 e IFNp). Estas cascatas de sinalização constituem respostas inatas intrínsecas potentes imunes que estabelecem um estado anti-microbial para restringir a propagação de patógenos durante os estágios iniciais da infecção.

Murino γHV68 está intimamente relacionado com oncogênico SKHV humana e EBV. Assim, a infecção de ratinhos γHV68 fornece um modelo animal pequeno tratável para examinar a resposta imune do hospedeiro à infecção por vírus de herpes gama in vivo ^7. Usando γHV68, nosso laboratório revelou uma estratégia complexa pela qual γHV68 seqüestra sediar sinalização imune inato para permitir a infecção viral. Por um lado, γHV68 ativa a via MAVS-IKKβ para promover a ativação da transcrição viral via dirigir IKKβ activado para fosforilar transactivadora replicação (RTA), o fator de transcrição chave viral para γHV68 replicação ^8. Por outro lado, a fosforilação IKKβ mediada primos RelA para degradação e termoinates ativação NFkB ^9. Como tal, a infecção γHV68 evita eficazmente a produção de citocinas anti-viral. Curiosamente, uma pesquisa utilizando uma biblioteca de γHV68 expressão identificada RTA como uma ligase E3 para induzir a degradação RelA e revogará ativação NFkB ^10. Estes resultados descobrir uma estratégia de evasão imune complexa em que os eventos de sinalização imunes a montante são aproveitadas por γHV68 para negar o final da produção de citocinas anti-viral.

Aqui nós descrevemos um protocolo para medir a produção de citocinas antiviral em camundongos infectados com γHV68 in vivo e ex viv o. No protocolo que explorar ainda mais a expressão "reconstituído" dos componentes da imunidade inata nos knockout fibroblastos embrionários de transdução lentiviral, que identifica a função das moléculas imunitárias inatas específicos na regulação da produção de citocinas anti-viral. Este protocolo pode ser facilmente adaptada para outras viruses e vias de sinalização.

Protocol

Declaração de Ética: Todo o trabalho animal foi realizada sob estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia.

1. Cytokine Gene Expression quantitativa por PCR em tempo real e da secreção por ELISA em ratinhos infectados γHV68

1. Anestesiar, 6-8 semanas de idade C57BL / 6 (B6) ninhada pareados por sexo (8-12 ratos / grupo) via intraperitoneal injetar 1,5 mg de ketamine/0.12 mg de xilazina e inocular por via intranasal com 40 UFP de γHV68 em 40 mL (infecção detalhado na Dong Feng e ^11). Em diferentes pontos de tempo após a infecção, os ratos eutanásia por inalação de CO ₂ usando seguido por deslocação cervical.
2. Abra o peito com um corte lateral esquerdo ao longo do sternum e cortar as costelas com uma tesoura afiada. Recolha os tecidos pulmonares.
3. Recolha de metade do tecido pulmonar (lobo esquerdo) em tubos de 1,5 ml com tampa de rosca estéreis, contendo 500 ul 1,0 milímetros grânulos zircônia / sílica. Adicionar 1 ml de DMEM isento de soro a frio para dentro do tubo e homogeneizar o tecido pulmonar através do grânulo-batida durante 30 segundos. Descontraia tubos no gelo por 2 min e repetir este processo uma vez.
4. Centrifugar os tubos (15.000 x g durante 10 min) a 4 ° C, recolhe-se o sobrenadante e medem a produção de citocinas, tal como descrito abaixo.
5. Medir citoquinas utilizando estojos de ELISA de citoquinas disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
6. Recolha a outra metade do tecido pulmonar (lobo direito) para outro tubo contendo talão e adicionar 1 ml de Trizol. Homogeneizar e recolher o sobrenadante como descrito no passo 1.3 e de ARN extracto de acordo com instrução do fabricante. Determinar a concentração de ARN por fazer as leituras de absorvância a 260 e 280 nm. Prepare cDNA com 1 ug de ARN total e a transcriptase inversa de acordo com as instruções do fabricante (o volume total final foi de 20 ul). Diluir cDNA 50 vezes com DNAse e água livre de RNase e realizar quantitativa PCR em tempo real.
7. Execute o programa em uma máquina quantitativa PCR em tempo real. Cada reacção contém 0,5 uL de um par de iniciadores específicos para o gene ou os iniciadores de controlo de GAPDH (a concentração de trabalho dos iniciadores foram 10 uM, CE 500 nM para cada iniciador), 5 ul da mistura principal SYBR e 4 ul do diluída cDNA. Calcular ΔΔCt para determinar a quantidade relativa de transcritos de mRNA de citocinas anti-virais.

2. Infecção celular MEF e de citocinas quantificação por ELISA e qRT-PCR

1. Crescer Mavs ^{+ / +} e Mavs ^{- / -} células MEF para sub-confluentes (aproximadamente 80%) Densidade antes do plaqueamento das células.
2. Dividir células MEF em 12 nósplacas de ll a 100.000 células / poço (a densidade de células será de cerca de 70% no segundo dia). Realizar infecção γHV68 em triplicado, com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5-10 para sincronizar e maximizar a indução de citoquinas.
3. Prepare γHV68 suspensão em meio DMEM completo contendo a quantidade apropriada de vírus (1 ml para cada poço).
4. Remover o meio e adicionar γHV68 contendo suspensão de células MEF.
5. Colocar a placa na incubadora de cultura de tecidos, balançar a cada 30 min, e permitir um total de 2 horas de incubação.
6. Remover meio contendo γHV68, lave uma vez com PBS, e substituir por completo DMEM fresco.
7. Em vários pontos de tempo após a infecção, médio safra em 1,5 ml tubos Eppendorf. Lave as células com PBS frio e recolher as células infectadas por digestão com tripsina.
8. Medir citocinas antivirais em meio, tal como descrito na etapa 1.5.
9. Extrair ARN, preparar ADNc e executar qRT-PCR para determinar a expressão de genes de citoquinas antiviralcomo descrito nas etapas 1,5-1,7.

3. Produção Lentivirus, infecção e Geração de linhas celulares estáveis

1. Dividir células 293T um dia antes da transfecção e permitir que as células atingissem a 40% de confluência no momento da transfecção.
2. Transfecção de 10 centímetros prato de células 293T com os plasmídeos de embalagem (1,2 mg de pVSV-G e 6 mg de pDR8.9) e 7,2 mg de pCDH-flag-MAVS ou controle pCDH por precipitação de fosfato de cálcio.
3. Substituir médio em 6 a 8 horas após a transfecção com DMEM completo fresco.
4. Em 72 horas após a transfecção, recolher o meio contendo lentivírus, centrifugar a 4000 xg durante 15 min, e com o filtro de membrana de 0,22 um. Para aumentar o título de lentivírus, que centrifugar o meio contendo o vírus a 110.000 x g durante 2,5 horas a 4 ° C. Ressuspender cuidadosamente o pellet viral em pequeno volume de meio de interesse.
5. Mavs semente ^{- / -} células MEF ou a outras células nocaute MEF um dia before infecção em placas de 6 poços a 30-40% de confluência.
6. Infectar as células MEF com lentivírus 1 ml e 2 ml de DMEM completo fresco, suplementado com polibreno a uma concentração final de 10 ug / ml.
7. Centrifugar a placa a 500 xg a 30 ° C durante 30 minutos e transferir a placa para um incubador de cultura de tecido.
8. Substituir meio às 6 horas pós-infecção com DMEM completo fresco.
9. Dividir células MEF em 24 horas pós-infecção e adicionar puromicina a uma concentração final de 1 ug / ml em 48 horas pós-infecção para seleccionar células que expressam estavelmente MAVS.
10. Manter as células MEF em meio contendo puromicina e verificar a expressão de proteínas por immunoblotting com anticorpos correspondentes.
11. As células podem ser utilizadas para a infecção virai, a expressão de genes de citoquinas e ensaios de secreção, tal como descrito no protocolo 2.

Representative Results

Três figuras representativas são mostradas, incluindo a produção de citocinas nos pulmões de Mavs γHV68 infectadas ^{+ / +} e ^{Mavs-/ -} rato, a secreção de citocinas e a expressão do gene de nível Mavs γHV68 infectadas ^{+ / +} e Mavs ^{- / -} MEFs, e níveis de mRNA das citocinas de Mavs γHV68 infectados ^{- / -} MEFs "reconstituído" com MAVS. Estas experiências representativas utilizam camundongos knockout de genes para investigar a produção de citocinas anti-viral in vivo e explorar MEFs knockout para dissecar o mecanismo de produção de citocinas regulamentada ex vivo. Especificamente, a infecção γHV68 de Mavs ^{- / -} murganhos conduziu à produção significativamente mais elevada de CCL5 in vivo. Mavs ^{- / -} MEFs produzidos citoquina mais antiviral que Mavs ^{+ / +} MEFs durante a infecção γHV68, que recapitula o fenótipo in vivo. "Reconstituiçãotuído "expressão de MAVS em Mavs ^{- / -} MEFs diminuição da produção CCL5 Colectivamente, estes resultados demonstram que é necessário para MAVS γHV68 para suprimir a produção de citocinas anti-viral in vivo e ex vivo..

Figura 1. γHV68 infecção aguda induzida por aumento da produção de citocinas nos pulmões de Mavs ^{- / -} do que ratos que em Mavs ^{+ / +} mice. Mavs ^{+ / +} e Mavs pareados por sexo e idade ^{- / -} ratos foram infectados por via intranasal com 40 UFP de γHV68 e CCL5 nos pulmões infectados em dias indicados pós-infecção foi medido por ELISA. γHV68 infecção do Mavs ^{- / -} ratos levou à significativamente maior produção de citocinas anti-viral CCL5, o que sugere que é necessário para MAVS γHV68 para suprimir a produção de citocina antiviral. Os dados são apresentados como a média ± o erro padrão da média (SEM). A significância estatística: *, p <0,05; **, p <0,02. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2. Após a infecção γHV68, Mavs ^{- / -} MEFs produzido citocina mais antiviral que Mavs ^{+ / +} MEFs Mavs ^{+ / +} e Mavs ^{-. / -} MEFs foram infectados com γHV68 e colhida em horários indicados pós-infecção (IPH), CCL5 no sobrenadante foi avaliada por ELISA (A) e a expressão do gene em células MEF por quantitativa PCR em tempo real (B). The resultados do Mavs ^{- / -} infectados com MEFs γHV68 recapitular os de Mavs γHV68 infectados ^{- / -} ratos. Os dados são apresentados como a média ± SEM de três experiências independentes. A significância estatística:. **, P <0,02, *** p <0.005 Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3. "Reconstituída" expressão de MAVS em Mavs ^{- / -} MEFs diminuição da produção CCL5 (A) Mavs ^{-. / -} MEFs foram infectadas com o controlo ou MAVS expressando lentivírus e a expressão de MAVS foi analisada por imunotransf erência. (B) Mavs ^{- / -} MEFs "reconstituído" com MAVS foram infectados com γHV68. MEFs foram colhidos no indicada infecção horas após (IPH) e RNA foi analisada por quantitativo em tempo real PCR com primers específicos para CCL5. Os dados são apresentados como a média ± SEM de três experiências independentes. A significância estatística:. **, P <0,02 Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Discussion

Evasão imune Viral é uma das interações mais dinâmicas e fascinantes interface ofensa viral e de defesa do hospedeiro ^9. O anfitrião componentes da imunidade inata são estruturados de tal forma que a transdução de sinal é efetivamente iniciado e transmitido fielmente. Delineando a hierarquia e regulação da cascata de sinalização é um tema de destaque da imunidade inata. Aqui, apresentamos um protocolo para identificar as funções de regulação de um componente imunológico inato, MAVS, na evasão viral da produção de citocinas. O protocolo compreende um método que determina a produção de citocinas em camundongos infectados com vírus e avaliar a expressão gênica de citocinas e produção em MEFs. Os MEFs knockout gene e rato fornecer ferramentas que permitem a análise genética e bioquímica da função da proteína in vivo e ex vivo. Construído sobre as linhagens de camundongos geneticamente modificados, muitos dos quais estão disponíveis comercialmente e número de que estão a aumentar a um ritmo acelerado, este protocol explora ainda mais a expressão "reconstituído" de tipo selvagem ou proteína mutada de interesse por lentivírus. Uma limitação potencial da expressão "reconstituído" de componentes da imunidade inata é a sinalização imune indesejada desencadeada pela expressão exógena, o que pode impactar infecção viral e transdução de sinal do mesmo. Optimização para conseguir baixos níveis de expressão comparáveis ​​aos níveis endógenos pode reduzir o efeito colateral. No caso de uma proteína mutante levando "lesões" alvo é usado, ele vai nos permitir identificar a função de um domínio particular, modificações pós-translacionais, ou interação proteína-proteína na regulação imune durante a infecção viral. Se as células "reconstituído" são transplantadas para nocaute rato, in vivo função dos componentes do sistema imunológico selecionados ou mutante alvo pode ser examinado.

Comparado com o "knock-in" ou a expressão transgênica de proteínas mutantes, "reconstitbuiu "expressão do tipo selvagem ou proteína mutada de interesse por lentivírus é mais custo e tempo de efetivo, permitindo a investigação com diversos mutantes ganho ou perda de função. A etapa crítica de todo o protocolo é que a proteína reconstituído deve ser comparável ao nível da proteína endógena, especialmente quando a proteína é uma enzima ou factor de transcrição. sobre-expressão de algumas proteínas pode levar à activação aberrante da via de sinalização e resultados ambíguos.

Embora nosso protocolo se concentra principalmente em fibroblastos de rato, que é em grande parte devido à regulação intrínseca do componente imunológico inato na replicação γHV68, aplicações similares podem ser estendidos para outros componentes do sistema imunológico, incluindo macrófagos e células dendríticas. Além disso, estas abordagens podem ser adaptados para estudos mecanicistas impliquem diversos agentes patogénicos. A aplicação está a emergir ¹² e provavelmente vai levar mais papéis encenado de centro no futuro.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA