Dissekera Innate Immun Signalering i Viral Evasion av cytokinproduktion

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att mäta den antivirala cytokinproduktion hos möss som infekterats med en modell herpesvirus, murina gamma herpesvirus 68 (γ HV68) som är nära relaterad till människans Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV) och Epstein-Barr-virus (EBV). Med användning av genetiskt modifierade musstammar och möss embryonala fibroblaster (MEFs) bedömde vi det antivirala cytokinproduktion både in vivo och ex vivo. "Beredning" ett uttryck för medfödda immun komponenter i knockout embryonala fibroblaster genom lentiviral transduktion, vi ytterligare precisera vissa medfödda immunmolekyler och dissekera de viktigaste signalsystem händelser som på olika sätt reglerar den antivirala cytokinproduktion.

Abstract

Som svar på en virusinfektion, är värd medfödda immunsvaret aktiveras för att uppreglera genexpression och produktion av antivirala cytokiner. Omvänt har virus utvecklat intrikata strategier för att kringgå och utnyttja värd immun signalering för överlevnad och förökning. Viral immun skatteflykt, innebärvärdförsvar och viral skatteflykt, ger en av de mest fascinerande och dynamiska gränssnitt för att urskilja samspelet värd-virus. Dessa studier vår överenskommelse i medfödda immunreglering och bana väg för att utveckla nya antivirala terapier.

Murina γHV68 är en naturlig patogen av murina gnagare. γHV68 infektion av möss ger en lätthanterlig liten djurmodell för att undersöka antiviral respons på mänsklig KSHV och EBV varav störning av in vivo virus-värd interaktioner är inte tillämplig. Här beskriver vi ett protokoll för att fastställa den antivirala cytokinproduktion. Detta protokoll kan anpassas till andra viranvänder och signalvägar.

Nyligen har vi upptäckt att γHV68 kapar MAVS och IKKβ, nyckel innate immune signalerings komponenter nedströms om den cytosoliska RIG-I och MDA5 att upphäva NFkB aktivering och antivirala cytokinproduktion. Specifikt aktiverar γHV68 infektion IKKβ och att aktiverade IKKβ fosforylerar RelA att accelerera RelA nedbrytning. Som sådan, γ HV68 kopplas effektivt NFkB aktivering från dess uppströms aktiverade IKKβ, motverkar antiviral cytokin genuttryck. Denna studie belyser en intrikat strategi där det uppströms medfödda immunaktivering fångas upp av en viral patogen för att upphäva den omedelbara nedströmstranskriptionsaktiveringen och undgå antivirala cytokinproduktion.

Introduction

Nya studier har beskrivit de totala signalkaskader i monterings värd medfödda immunsvar. Bosatta inom olika fack, mönsterigenkänningsreceptorer (PRRs) upptäcka patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) av olika ursprung att utlösa medfödda immun signalering ^1. Den retinoinsyra-inducerad gen I (RIG-I) och melanom differentieringsantigen 5 (MDA5) proteiner är cytosoliska sensorer som känner igen RNA arter med specifika strukturella egenskaper ^2. Vid aktivering, RIG-I interagerar med sina nedströms MAVS (även kallad IPS-1, VISA, och Cardif) adapter som i sin tur aktiverar IKK (IKKαβγ) och IKK-relaterade kinas (TBK1 och IKKε, även känd som Ikki ) komplex ^3-6. Aktiverade medfödda immun kinaser fosforylerar viktiga regulatorer av genuttryck, inklusive transkriptionsfaktorer och inhibitorer därav, och göra det möjligt för transkriptionsaktivering av värd antivirala gener (t.ex. IL6, TNF & #945,, CCL5, och IFN). Dessa signalering kaskader utgör potenta inneboende medfödda immunsvar som etablerar en antimikrobiell tillstånd att begränsa patogen utbredning under tidiga stadier av infektion.

Murina γHV68 är nära besläktat med human onkogena KSHV och EBV. Sålunda γHV68 infektion i möss ger en lätthanterlig liten djurmodell för att undersöka värdimmunsvaret mot gamma herpesvirusinfektion in vivo ^7. Använda γHV68, har vårt labb avslöjat ett intrikat strategi där γHV68 kapar värd medfödda immunsignalering för att möjliggöra virusinfektion. Å ena sidan γHV68 aktiverar MAVS-IKKβ pathway att främja virala transkriptionsaktivering via rikta aktiverad IKKβ att fosforylera replika transaktivator (RTA), den virala transkriptionsfaktor nyckel för γHV68 replika ^8. Å andra sidan, initierar IKKβ-medierad fosforylering RelA för nedbrytning och siktinates NFkB aktivering ^9. Som sådan γHV68 infektion undviker effektivt antivirala cytokinproduktion. Intressant, en screening använder ett uttryck bibliotek av γHV68 identifierade RTA som E3 ligas att framkalla RelA nedbrytning och upphäva NFkB aktivering ^10. Dessa rön avslöja en invecklad immun skatteflykt strategi där uppströms immun signalering händelser utnyttjas av γHV68 att förneka den ultimata antiviral cytokinproduktion.

Här beskriver vi ett protokoll för att mäta den antivirala cytokinproduktion hos möss som infekterats med γHV68 både in vivo och ex viv o. I det protokoll som vi ytterligare utforska "rekonstituerad" uttryck för medfödda immun komponenter i knockout embryonala fibroblaster från Lentiviral transduktion, som preciserar funktionen av specifika medfödda immunmolekyler i regleringen av antivirala cytokinproduktion. Detta protokoll kan lätt anpassas till andra viruSES-och signalsystem.

Protocol

Etik Uttalande: Alla djur arbete utfördes under strikt enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur av National Institutes of Health. Protokollet godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Southern California.

1. Cytokine Gene Expression av kvantitativ realtids-PCR och utsöndring medelst ELISA i γHV68 infekterade möss

1. Bedöva könsmatchade, 6-8 veckor gamla C57BL / 6 (B6) kullsyskon (8-12 möss / grupp) via intraperitoneal injektion av 1,5 mg ketamine/0.12 mg xylazin, och ympa intranasalt med 40 PFU av γHV68 i 40 pl (infektion i detalj i Dong och Feng ^11). Vid olika tidpunkter efter infektion, euthanize möss genom användning av CO ₂ inandning följt av cervikal dislokation.
2. Öppna bröstet med en vänster lateral snitt längs sternum och skära igenom revbenen med vass sax. Samla lungvävnad.
3. Samla hälften av lungvävnaden (vänster lob) i sterila 1,5 ml med skruvkork rör som innehåller 500 mikroliter 1,0 mm Zirconia / Silica pärlor. Tillsätt 1 ml kallt serumfritt DMEM i röret och homogenisera den lungvävnad genom bead-stryk för 30 sek. Chill rören på is i 2 min och upprepa denna process en gång.
4. Centrifugera rören (15.000 x g under 10 min) vid 4 ° C, samla upp supernatanten och mäta cytokinproduktion såsom beskrivs nedan.
5. Mät cytokiner med hjälp av kommersiellt tillgängliga cytokin ELISA kit enligt tillverkarens instruktioner.
6. Samla upp den andra hälften av lungvävnaden (högra loben) till en annan vulst-innehållande rör och tillsätt 1 ml TRIzol. Homogenisera och samla in supernatanten som beskrivs i steg 1,3 och extrakt RNA enligt tillverkares anvisning. Bestäm RNA-koncentration genom att absorbansavläsningar vid 260 och 280 nm. Förbered cDNA med en ^ g av total-RNA och omvänt transkriptas enligt tillverkarens instruktioner (den totala slutliga volymen var 20 pl). Späd cDNA 50 gånger med DNAs-och RNas-fritt vatten och utföra kvantitativ realtids-PCR.
7. Utför programmet på en kvantitativ realtids-PCR-maskin. Varje reaktion innehåller 0,5 | il av ett par av genspecifika primrar eller kontroll primrar av GAPDH (arbetskoncentration av primers var 10 | iM, CE 500 nM för varje primer), 5 ^ il av SYBR-masterblandning och 4 | il av den utspädda cDNA. Beräkna ΔΔCt att bestämma den relativa kvantiteten av mRNA-transkript av antivirala cytokiner.

2. MEF Cell Infektion och Cytokine Kvantifiering med ELISA och QRT-PCR

1. Väx Mavs ^{+ / +} och Mavs ^{- / -} MEF celler till sub-sammanflytande (ca 80%) densitet före plätering celler.
2. Dela MEF celler i 12-vill plattorna vid 100.000 celler / brunn (celldensiteten kommer att vara omkring 70% på den andra dagen). Utför γHV68 infektion i triplikat med en multiplicitet av infektion (MOI) av 5 till 10 för att synkronisera och maximera cytokininduktion.
3. Förbered γHV68 suspension i komplett DMEM-medium innehållande lämplig mängd virus (1 ml för varje brunn).
4. Ta medium och lägga γHV68 innehåller suspensionen till MEF celler.
5. Placera plattan i vävnadsodlingsinkubator gungas varje 30 min, och låta totalt 2 h av inkubation.
6. Ta γHV68-medium, tvätta en gång med PBS, och ersätta med nytt komplett DMEM.
7. Vid olika tidpunkter efter infektion, skörd medium i 1,5 ml Eppendorf-rör. Tvätta cellerna med kall PBS och samla infekterade celler genom trypsin digestion.
8. Mät antivirala cytokiner i medium som beskrivs i steg 1,5.
9. Utdrag RNA, bereda cDNA och utföra QRT-PCR för att bestämma antiviral cytokin genuttryckenligt steg 1,5-1,7.

3. Lentivirus Produktion, infektion och Generering av stabila cellinjer

1. Split 293T celler en dag före transfektion och tillåter cellerna att nå ~ 40% konfluens vid tidpunkten för transfektion.
2. Transfektera 10 cm skål av 293T celler med förpacknings plasmider (1,2 mikrogram av pVSV-G och 6 pg av pDR8.9) och 7,2 pg av pCDH-FLAG-MAVS eller pCDH kontroll genom kalciumfosfatutfällning.
3. Byt medium vid 6-8 h efter transfektion med färskt komplett DMEM.
4. Vid 72 h efter transfektion, samla medium innehållande lentivirus, centrifugera vid 4000 xg under 15 min, och filter med 0,22 | im membran. För att öka lentivirus titer, centrifugera vi den virusinnehållande medium vid 110.000 xg under 2,5 timmar vid 4 ° C. Försiktigt resuspendera virala pelleten i liten volym medium intresse.
5. Seed Mavsen ^{- / -} MEF-celler eller andra knockout MEF celler en dag before infektion i 6-brunnsplattor vid ~ 30-40% sammanflytning.
6. Infect MEF-celler med 1 ml lentivirus och 2 ml färskt komplett DMEM, kompletterat med polybren till en slutlig koncentration av 10 pg / ml.
7. Centrifugera plattan vid 500 x g vid 30 ° C under 30 min och överföra plattan till en vävnadsodlingsinkubator.
8. Byt medium vid 6 timmar efter infektion med färska komplett DMEM.
9. Sträck MEF-celler vid 24 h efter infektion och lägga puromycin till en slutlig koncentration av 1 ^ g / ml vid 48 h efter infektion för att välja celler som stabilt uttrycker MAVS.
10. Behåll MEF celler i puromycin-innehållande medium och kontrollera proteinuttryck genom immun med motsvarande antikroppar.
11. Cellerna kan användas för virusinfektion, cytokin genexpression och sekretionsexperiment såsom beskrivs i protokoll 2.

Representative Results

Tre representativa siffror visas här, inklusive cytokinproduktion i lungan av γHV68-infekterade Mavsen ^{+ / +} och ^{Mavsen-/ -} mus, cytokin sekretion och genexpression nivå γHV68-infekterade Mavsen ^{+ / +} och Mavsen ^{- / - MEF,} och cytokin mRNA-nivåer av γHV68-infekterade Mavs ^{- / -} MEF "rekonstituerad" med MAVS. Dessa representativa experiment utnyttjar gen knockoutmöss för att undersöka antiviral cytokinproduktion in vivo och utforska knockout MEF att dissekera mekanismen för reglerad cytokinproduktion ex vivo. Specifikt γHV68 infektion av Mavsen ^{- / -} möss ledde till markant högre produktion av CCL5 in vivo. Mavs ^{- / - MEF} producerade mer antiviral cytokin än Mavs ^{+ / +} MEF under γHV68 infektion, vilket recapitulates in vivo fenotypen. "Upplösningstats "uttryck av MAVS i Mavsen ^{- / -} MEF minskade CCL5 produktion Tillsammans visar dessa resultat att MAVS är nödvändigt för γHV68 att undertrycka antivirala cytokinproduktion både in vivo och ex vivo..

Figur 1. γHV68 akut infektion inducerad högre produktion cytokin i lungorna hos Mavsen ^{- / -} möss än i Mavs ^{+ / +-möss.} Ålder-och könsmatchade Mavs ^{+ / +} och Mavs ^{- / -} möss intranasalt infekterade med 40 PFU av γHV68 och CCL5 i de infekterade lungorna vid motsvarande dagar efter infektion mättes med ELISA. γHV68 infektion av Mavsen ^{- / -} möss ledde till markant högre produktion av antiviral cytokin CCL5, som föreslog att MAVS är nödvändig för γHV68 att undertrycka antivirala cytokinproduktion. Data presenteras som medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM). Den statistisk signifikans: *, p <0,05, **, p <0,02. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Upon γHV68 infektion, Mavsen ^{- / -} MEF producerade mer antiviralt cytokin än Mavs ^{+ / +} MEF Mavsen ^{+ / +} och Mavsen ^{-. / -} MEF var infekterade med γHV68 och skördades vid olika tider efter infektion (HPI), CCL5 i supernatanten utvärderades med ELISA (A) och genuttryck i MEF celler genom kvantitativ realtids-PCR (B). The resultat Mavs ^{- / -} MEF infekterade med γHV68 rekapitulera de av γHV68-infekterade Mavs ^{- / -} möss. Data presenteras som medelvärdet ± SEM för tre oberoende experiment. Den statistiska signifikans:. **, P <0,02, *** p <0,005 Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. "Rekonstituerad" uttryck av MAVS i Mavsen ^{- / -} MEF minskade CCL5 produktion (A) Mavsen ^{-. / -} MEF var infekterade med kontroll eller MAVS-uttryck lentivirus och uttrycket av MAVS analyserades genom immunoblotting. (B) Mavs ^{- / -} MEF "rekonstituerad" med MAVS var infekterade med γHV68. MEF skördades vid de angivna timmarna efter infektion (HPI) och RNA analyserades med kvantitativ realtids-PCR med primers specifika för CCL5. Data presenteras som medelvärdet ± SEM för tre oberoende experiment. Den statistiska signifikans:. **, P <0,02 Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Viral immun skatteflykt är en av de mest dynamiska och fascinerande samspel gränssnitt viral brott och värdförsvar ^9. Värd medfödda immun komponenter är strukturerade så att signaltransduktion effektivt initieras och troget överförda. Avgränsar hierarkin och reglering av signalkaskader är en framstående ämne av medfödd immunitet. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera de regulatoriska rollerna för en medfödd immun komponent, MAVS, i viral kringgående av cytokinproduktion. Protokollet består av en metod att bestämma cytokinproduktion i virusinfekterade mus och bedöma cytokin genuttryck och produktion i MEF. Den gen knockout MEF och mus tillhandahåller verktyg som gör det möjligt att genetiska och biokemiska dissektion av proteiners funktion in vivo och ex vivo. Byggd på de genetiskt modifierade musstammar, av vilka många är kommersiellt tillgängliga och antalet som ökar i allt snabbare takt, detta protocol utforskar vidare "rekonstituerad" uttryck av vildtyp eller muterat protein av intresse från lentivirus. En potentiell begränsning av "rekonstituerad" uttryck för medfödda immun komponenter är den oönskade immun signalering utlöses av exogen uttryck, vilket kan påverka virusinfektion och signaltransduktion därav. Optimering för att uppnå låga uttrycks jämförbar med endogena nivåer kan minska biverkningar. I händelse av en mutant protein som bär riktade "skador" används, kommer det att ge oss möjlighet att sätta fingret på funktionen av en viss domän, post-translationell modifiering, eller protein-proteininteraktion i immunreglering under virusinfektion. Om "ombildade" celler transplanteras in i knockout-mus, kan in vivo-funktionen av utvalda immun komponenter eller riktad mutant undersökas.

Jämfört med "knock-in" eller transgent uttryck av mutanta proteiner "reconstitgit "uttryck av vildtyp eller muterat protein av intresse från lentivirus är mer kostnads-och tidseffektiv, medger utredningen med olika vinst-eller förlust-av-funktion mutanter. Det kritiska steget i hela protokollet är att det rekonstituerade proteinet bör vara jämförbar med endogent protein nivå, särskilt när proteinet är ett enzym eller en transkriptionsfaktor. Överuttryck av vissa proteiner kan leda till avvikande aktivering av signalväg och tvetydiga resultat.

Även om våra protokoll är främst inriktat på musfibroblaster, vilket till stor del beror på den inneboende regleringen av medfödda immun komponent på γHV68 replikering, kan liknande program utökas till andra immunkomponenter, däribland makrofager och dendritiska celler. Dessutom kan dessa metoder anpassas till mekanistiska studier som medför olika patogener. Ansökan växer fram ¹² och kommer sannolikt att ta flera center-iscensatt roller i framtiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA