Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion in Mäusen mit einem Modell-Herpesvirus, murinen Gammaherpesvirus-68 (γ HV68) infiziert, die für die menschliche Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) eng verwandt ist, zu messen. Mit Hilfe genetisch veränderter Mausstämme und embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF), untersuchten wir die antivirale Zytokin-Produktion in vivo und ex vivo. "Reconstituting" den Ausdruck der angeborenen Immunkomponenten in Knockout embryonale Fibroblasten von lentiviralen Transduktion, weiter wir spezifische angeborene Immunmoleküle erkennen und sezieren die wichtigsten Signalwege, die unterschiedlich regeln die antivirale Zytokin-Produktion.

Abstract

In Reaktion auf eine virale Infektion ist der Host angeborenen Immunantwort zu hoch zu regulieren die Genexpression und die Produktion antiviraler Cytokine aktiviert. Umgekehrt haben Viren komplizierte Strategien, um für das Überleben und die Fortpflanzung zu entziehen und zu nutzen Immun Signalisierung entwickelt. Viral Immunevasion und beinhaltet Abwehr und virale Steuerhinterziehung, bietet eine der faszinierendsten und dynamischen Schnittstellen, um die Wirt-Virus-Interaktion zu erkennen. Diese Studien unser Verständnis der angeborenen Immunregulation und ebnen den Weg zu neuen antiviralen Therapien zu entwickeln.

Murine γHV68 ist eine natürliche Erreger der murinen Nagetiere. γHV68 Infektion von Mäusen eine gefügig Kleintiermodell, um die antivirale Antwort auf menschliche KSHV und EBV, von denen Störung der in-vivo-Virus-Wirt-Wechselwirkungen ist nicht anwendbar zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion zu bestimmen. Dieses Protokoll kann auch auf andere vir angepasst werdenverwendet und Signalwege.

Vor kurzem haben wir entdeckt, dass γHV68 entführt MAVS und IKK, Schlüssel angeborenen Immunsignalkomponenten hinter der cytosolischen RIG-I und MDA5, um NFkB-Aktivierung und antivirale Zytokin-Produktion aufzuheben. Insbesondere γHV68 Infektion aktiviert IKK und die IKK phosphoryliert aktiviert RelA zu RelA Abbau beschleunigen. Als solche γ HV68 effizient entkoppelt NFkB-Aktivierung bei den vorgelagerten aktiviert IKK, negiert antivirale Zytokin-Genexpression. Diese Studie verdeutlicht eine komplizierte Strategie, bei der die vorgeschaltete angeborenen Immunaktivierung wird durch eine virale Erreger abgefangen, die unmittelbar nachgeschalteten Transkriptionsaktivierung zunichte machen und entziehen antivirale Zytokin-Produktion.

Introduction

Jüngste Studien haben die gesamten Signalkaskaden bei der Montage Host angeborenen Immunantwort beschrieben. Wohnen in unterschiedlichen Fächern, pattern recognition receptors (PRR) erkennen pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) unterschiedlicher Herkunft zu angeborenen Immunsignal ¹ auslösen. Die Retinsäure-induzierte Gen I (RIG-I) und Melanom-Differenzierungsantigen 5 (MDA5) cytosolische Proteine ​​sind Sensoren, die RNA-Spezies mit spezifischen Strukturmerkmale ² zu erkennen. Nach der Aktivierung, RIG-I interagiert mit seinem stromabwärts gelegenen MAVS Adapter, der wiederum aktiviert die IKK (IKKαβγ) und IKK-verwandten Kinase (TBK1 und IKKε, auch IKKi bekannt (auch als IPS-1, VISA, und CARDIF bekannt) )-Komplexe ^3-6. Aktiviert angeborenen Immun Kinasen phosphoryliert Schlüsselregulatoren der Genexpression, darunter Transkriptionsfaktoren und deren Inhibitoren und aktivieren Transkriptionsaktivierung von Host-antivirale Gene (z. B. IL-6, TNF & #945;, CCL5 und IFN &bgr;). Diese Signalkaskaden bilden starke intrinsische angeborenen Immunantwort, die eine anti-mikrobielle Staat zu errichten, um Krankheitserreger Ausbreitung während der frühen Stadien der Infektion zu beschränken.

Murine γHV68 ist eng mit der menschlichen onkogenen KSHV und EBV zusammen. Somit γHV68 Infektion von Mäusen eine lenkbar Kleintiermodell, um die Immunantwort des Wirts gegenüber Gammaherpesvirus-Infektion in vivo ⁷ zu prüfen. Mit γHV68 hat unser Labor eine komplizierte Strategie aufgedeckt, wobei γHV68 entführt Gastgeber angeborenen Immun Signalisierung an Virusinfektion zu ermöglichen. Auf der einen Seite aktiviert γHV68 die Mavs-IKK Weg zum viralen Transkriptionsaktivierung über die Leitung aktiviert IKK Replikation Transaktivator (RTA), die virale Transkriptionsfaktor Schlüssel für γHV68 Replikation ⁸ phosphorylieren fördern. Auf der anderen Seite, Primzahlen die IKK-vermittelte Phosphorylierung RelA für Abbau-und Zeitinates NFkB-Aktivierung ^9. Als solche γHV68 Infektion vermeidet effektiv antivirale Zytokin-Produktion. Interessant ist, dass ein Screening unter Verwendung einer Expressionsbibliothek von γHV68 identifiziert RTA als E3-Ligase RelA Abbau zu induzieren, und hebt NFkB-Aktivierung ^10. Diese Ergebnisse enthüllen ein kompliziertes Immunevasion Strategie, bei der die vor-Immunsignalereignisse werden durch γHV68 genutzt, um den ultimativen antivirale Zytokin-Produktion zu negieren.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion in Mäusen mit γHV68 sowohl in vivo und ex viv o infiziert zu messen. In dem Protokoll weiter wir die "wiederhergestellten" Ausdruck der angeborenen Immunkomponenten in der Ko-embryonale Fibroblasten erkunden lentiviralen Transduktion, die die Funktion der spezifischen angeborenen Immunmoleküle in der Regulation des antivirale Zytokin-Produktion lokalisiert. Dieses Protokoll kann leicht auf andere Viru angepasst werdenses und Signalwege.

Protocol

Ethikerklärung: Alle Tier Arbeit wurde unter strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der Universität von Süd-Kalifornien genehmigt.

1. Zytokin-Genexpression durch quantitative Echtzeit-PCR und Sekretion mittels ELISA in γHV68-infizierte Mäuse

1. Anesthetize geschlechtsspezifische, 6-8 Wochen alte C57BL / 6 (B6) Geschwistern (8-12 Mäuse / Gruppe) über intraperitoneale Injektion von 1,5 mg ketamine/0.12 mg Xylazin und impfen intranasal mit 40 PFU γHV68 in 40 ul (Infektion in Dong Feng und ¹¹ beschrieben). Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden die Mäuse euthanize durch Verwendung von CO _2-Inhalation durch Genickbruch folgte.
2. Öffnen Sie die Brust mit einem linken seitlichen Schnitt entlang der sternum und durch die Rippen mit einer scharfen Schere abgeschnitten. Sammeln Sie die Lungengewebe.
3. Sammeln Sie die Hälfte des Lungengewebes (links Keule) in sterile 1,5-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss mit 500 ul 1,0 mm Zirkonia / Silica-Perlen. 1 ml kaltes serumfreies DMEM in das Rohr und homogenisieren das Lungengewebe durch Kugelschlagen für 30 sek. Chill-Röhrchen auf Eis für 2 min und wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.
4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen (15.000 x g für 10 min) bei 4 ° C, Sammeln des Überstandes und Messung der Cytokin-Produktion, wie nachfolgend beschrieben.
5. Messen Sie Zytokine mit kommerziell erhältlichen Zytokin-ELISA-Kits nach der Anleitung des Herstellers.
6. Sammeln Sie die andere Hälfte des Lungengewebes (rechten Lappen) in eine andere Perle haltige Rohr und 1 ml TRIzol. Homogenisieren und sammeln Stand wie in Schritt 1.3 und RNA-Extrakt nach Anweisungen des Herstellers beschrieben. Bestimmen RNA-Konzentration von unter Absorptionswerte bei 260 und 280 nm auf. Bereiten cDNA mit 1 ug Gesamt-RNA und Reverse-Transkriptase nach Anweisungen des Herstellers (die endgültige Gesamtvolumen betrug 20 ul). Verdünnen cDNA 50-mal mit DNAse-und RNAse-freies Wasser und führen quantitative Echtzeit-PCR.
7. Führen Sie das Programm auf eine quantitative Echtzeit-PCR-Maschine. Jede Reaktion enthält 0,5 &mgr; l eines Paares von genspezifischen Primern oder Kontrolle des GAPDH-Primer (der Arbeits Konzentration der Primer waren 10 &mgr; M, CE 500 nM für jeden Primer), 5 &mgr; l des SYBR Master Mix und 4 &mgr; l der verdünnten cDNA. Berechnen ΔΔCt, um die relative Menge der mRNA-Transkripte von antiviralen Zytokinen zu bestimmen.

2. MEF Zellen-Infektion und Zytokin-Quantifizierung mittels ELISA und qRT-PCR

1. Wachsen Mavs ^{+ / +} und Mavs ^{- / -} MEF-Zellen subkonfluente (ca. 80%) Dichte vor dem Beschichten Zellen.
2. Split MEF-Zellen in 12-wirll Platten bei 100.000 Zellen / Well (die Zelldichte etwa 70% am zweiten Tag sein). Durchführung γHV68 Infektion in Triplikaten mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5-10 zu synchronisieren und zu maximieren Cytokin-Induktion.
3. Bereiten γHV68 Suspension in komplettem DMEM-Medium mit entsprechenden Virusmenge (1 ml pro Vertiefung).
4. Medium entfernen und fügen γHV68 haltigen Suspension auf MEF-Zellen.
5. Die Platte wird in Gewebekultur-Inkubator, rocken alle 30 Minuten und lassen insgesamt 2 h Inkubation.
6. Entfernen γHV68-haltigem Medium, einmal mit PBS waschen, und ersetzen mit frischen kompletten DMEM.
7. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, Erntemedium in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen. Waschen der Zellen mit kaltem PBS und sammeln infizierten Zellen durch Trypsin-Verdauung.
8. Messen antiviralen Zytokinen in Medium, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
9. Auszug RNA, cDNA vorzubereiten und durchzuführen, qRT-PCR, um antivirale Zytokin-Genexpression bestimmenwie in den Schritten 1.5-1.7 beschrieben.

3. Lentiviren Produktion, Infektion, und Generierung von stabilen Zelllinien

1. Split-293T-Zellen einen Tag vor der Transfektion und damit die Zellen zu ca. 40% Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen.
2. Transfektion von 10 cm Schüssel von 293T-Zellen mit den Plasmiden Verpackung (1,2 ug pVSV-G und 6 ug pDR8.9) und 7,2 ug PCDH-FLAG-MAVS oder PCDH Kontrolle durch Calciumphosphat-Niederschlag.
3. Medium ersetzen bei 6 bis 8 Stunden nach der Transfektion mit frischem DMEM komplett.
4. Bei 72 Stunden nach der Transfektion, sammeln Medium mit Lentiviren, Zentrifuge bei 4000 g für 15 min und Filter mit 0,22 um-Membran. Um die Lentiviren Titer zu erhöhen, zentrifugieren wir die virushaltige Medium bei 110.000 g für 2,5 h bei 4 ° C Vorsichtig resuspendieren Viruspellet in kleinen Volumen Medium von Interesse.
5. Seed Mavs ^{- / -} MEF-Zellen oder anderen KO-MEF-Zellen 1 Tag befoRe-Infektion in 6-Well-Platten bei ~ 30-40% Konfluenz.
6. Infizieren MEF-Zellen mit 1 ml Lentivirus und 2 ml frisches komplettes DMEM mit Polybren bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml ergänzt.
7. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 × g bei 30 ° C für 30 min und übertragen Sie die Platte an einer Gewebekultur-Inkubator.
8. Medium ersetzen bei 6 Stunden nach der Infektion mit frischem Komplett DMEM.
9. Split MEF-Zellen bei 24 Stunden nach der Infektion und fügen Puromycin zu einer endgültigen Konzentration von 1 pg / ml bei 48 Stunden nach der Infektion auf Zellen auswählen stabil exprimieren MAVS.
10. Pflegen MEF-Zellen in Puromycin-haltigem Medium und überprüfen Proteinexpression durch Immunoblotting mit entsprechenden Antikörpern.
11. Die Zellen können für die Virusinfektion, Zytokin-Genexpression und Sekretion Experimente wie in Protokoll Nr. 2 beschrieben, verwendet werden.

Representative Results

Drei repräsentative Zahlen werden hier gezeigt, darunter Zytokin-Produktion in der Lunge von γHV68-infizierten Mavs ^{+ / +} und ^{Mavs-/ -} Maus, Zytokinsekretion und Gen-Expression von γHV68-infizierten Mavs ^{+ / +} und Mavs ^{- / -} MEFs und Zytokin-mRNA-Spiegel von γHV68-infizierten Mavs ^{- / -} MEFs "wiederhergestellt" mit MAVS. Diese repräsentativen Experimenten nutzen Gen-Knockout-Mäusen, die antivirale Zytokin-Produktion in vivo zu untersuchen und zu erforschen Knockout-MEFs, den Mechanismus der regulierten Zytokin-Produktion ex vivo zu sezieren. Insbesondere γHV68 Infektion der Mavs ^{- / -} Mäusen führte zu deutlich höheren Produktions von CCL5 in vivo. Mavs ^{- / -} MEFs produziert mehrere antivirale Zytokin als Mavs ^{+ / +} MEFs während γHV68 Infektion, die die in-vivo-Phänotyp rekapituliert. "Rekonstitutiontuierten "Ausdruck MAVS in Mavs ^{- / -} MEFs verringert CCL5 Produktion Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass MAVS ist notwendig für γHV68 antivirale Zytokin-Produktion in vivo und ex vivo zu unterdrücken..

Fig. 1 ist. γHV68 akuten Infektion induziert höhere Cytokinproduktion in den Lungen von Mavs ^{- / -} Mäusen als in Mavs ^{+ / +-Mäusen.} Alters-und geschlechtsangepasste Mavs ^{+ / +} und Mavs ^{- / -} Mäuse wurden intranasal mit 40 PFU γHV68 und CCL5 in den infizierten Lunge zu den angegebenen Tagen nach der Infektion wurde durch ELISA gemessen infiziert. γHV68 Infektion der Mavs ^{- / -} Mäusen führte zu deutlich höheren Produktion von antiviralen Zytokins CCL5, die vorgeschlagen, dass MAVS ist notwendig für γHV68 antivirale Zytokin-Produktion zu unterdrücken. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die statistische Signifikanz: *, p <0,05; **, p <0,02. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

2. Nach γHV68 Infektion, Mavs ^{- / -} MEFs produziert mehrere antivirale Zytokin als Mavs ^{+ / +} MEFs Mavs ^{+ / +} und Mavs ^{-. / -} MEFs wurden mit γHV68 infiziert und zu den angegebenen Stunden nach der Infektion (hpi) geerntet, CCL5 im Überstand wurde mittels ELISA (A) und die Genexpression in MEF-Zellen durch quantitative Echtzeit-PCR (B) bewertet. ThE Ergebnisse der Mavs ^{- / -} MEFs mit γHV68 infiziert rekapitulieren denen γHV68-infizierten Mavs ^{- / -} Mäusen. Daten sind als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die statistische Signifikanz:. **, P <0,02, ***, p <0,005 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

3. "Wiederhergestellte" Ausdruck MAVS in Mavs ^{- / -} MEFs verringert CCL5 Produktion (A) Mavs ^{-. / -} MEFs wurden mit Kontroll-oder MAVS-exprimierenden Lentiviren und die Expression von MAVS wurde durch Immunoblotting analysiert infiziert. (B) Mavs ^{- / -} MEFs "wiederhergestellt" mit MAVS wurden mit γHV infiziert68. MEFs wurden bei der angegebenen Stunden nach der Infektion (hpi) geerntet und RNA wurde durch quantitative Echtzeit-PCR mit spezifischen Primern für CCL5 analysiert. Daten sind als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die statistische Signifikanz:. **, P <0,02 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Viral Immunevasion ist einer der dynamischsten und faszinierende Wechselwirkungen Anbindung viralen Angriff und Abwehr ^9. Die Wirts angeborenen Immunkomponenten werden so strukturiert, dass die Signaltransduktion wirksam initiiert und originalgetreu übertragen. Absteckung der Hierarchie und Regulierung von Signalkaskaden ist eine herausragende Thema der angeborenen Immunität. Hier stellen wir ein Protokoll, um die regulatorischen Rolle der angeborenen Immunkomponente, MAVS, der Virushinterziehung von Zytokin-Produktion zu identifizieren. Das Protokoll umfasst ein Verfahren der Bestimmung Zytokin-Produktion in Virus-infizierten Maus und Bewertung Zytokin-Genexpression und Produktion in MEFs. Die Gen-Knockout-MEFs und Maus bieten Werkzeuge, die die genetischen und biochemischen Präparation der Proteinfunktion in vivo und ex vivo zu ermöglichen. Auf die genetisch veränderten Mausstämmen, von denen viele im Handel erhältlich sind und von denen einige in zunehmendem Tempo steigt, diese pr erbauteotocol näher auf die "wiederhergestellten" Expression von Wildtyp-oder mutierte Protein von Interesse durch Lentiviren. Eine mögliche Einschränkung der "Rekonstitution" Ausdruck der angeborenen Immunkomponenten ist die unerwünschte Immun Signalisierung durch exogene Expression ausgelöst, die Virusinfektion und Signaltransduktion davon beeinflussen können. Optimierung auf niedrige Expressionsniveau vergleichbar mit endogenen erreichen, kann die Nebenwirkung zu verringern. Im Falle eines mutierten Proteins Tragen von Ziel "Läsionen" verwendet wird, ermöglicht sie es, die Funktion einer bestimmten Domäne, post-translationale Modifikation, oder Protein-Protein-Wechselwirkung in der Immunregulation während der viralen Infektion zu lokalisieren. Wenn "wiederhergestellt" Zellen werden in Knockout-Maus transplantiert, in vivo-Funktion von Immunkomponenten ausgewählt oder gezielte Mutante untersucht werden.

Im Vergleich zum "Knock-in" oder transgenen Expression von mutierten Proteine ​​", reconstitausgeschüttet "Expression von Wildtyp-oder mutierten Protein von Interesse durch Lentivirus ist kosten-und zeiteffektiv, wodurch die Untersuchung mit unterschiedlichen Verstärkungs oder Loss-of-function-Mutanten. Der entscheidende Schritt des gesamten Protokolls ist, dass die rekonstituierte Protein sollte vergleichbar endogenen Protein-Ebene sein, insbesondere wenn das Protein ein Enzym oder ein Transkriptionsfaktor ist. Überexpression von einigen Proteinen können aberrante Aktivierung des Signalwegs und mehrdeutigen Ergebnissen führen.

Obwohl unser Protokoll konzentriert sich hauptsächlich auf Mausfibroblasten, die weitgehend auf die intrinsische Regulation der angeborenen Immunkomponente auf γHV68 Replikation ist, können ähnliche Anwendungen auf andere Immunbestandteile, einschließlich Makrophagen und dendritische Zellen erweitert werden. Zusätzlich können diese Ansätze zu mechanistischen Untersuchungen Bei Aktivitäts diverse Krankheitserreger anzupassen. Die Anwendung ist im Entstehen ¹² und wird wahrscheinlich mehr Mitte-inszenierten Rollen in die Zukunft.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA