Summary
我们描述了一种协议来测量抗病毒细胞因子的产生在感染了模型疱疹病毒,鼠γ-疱疹病毒68(γHV68)小鼠是密切相关的人类卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)和Epstein-Barr病毒(EBV)。利用转基因小鼠品系和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs细胞)中,我们评估了抗病毒细胞因子的产生在体内和离体 。 “重构”的淘汰赛中胚胎成纤维细胞通过慢病毒转导的天然免疫成分的表达,我们进一步确定具体的固有免疫分子和剖析关键的信号事件差异调节抗病毒细胞因子的产生。
Abstract
响应于病毒感染,宿主先天免疫反应被激活,上调抗病毒细胞因子的基因表达和生产。相反,病毒已经进化复杂的策略,以规避和利用宿主的免疫信号传导的生存和繁殖。病毒免疫逃避,将会导致宿主防御和病毒逃避,提供了最迷人的和动态的接口之一辨别宿主 - 病毒相互作用。这些研究推进我们理解先天免疫调节和我们铺平道路,以开发新的抗病毒治疗。
鼠γHV68鼠是啮齿动物的天然病原体。 γHV68感染小鼠提供了一个听话的小动物模型,研究抗病毒对人类社会的KSHV和EB病毒的体内病毒-宿主相互作用的扰动并不适用。在这里,我们描述了一个协议来确定抗病毒细胞因子的产生。这个协议可以适于其它vir区使用和信号通路。
最近,我们已发现,γHV68劫持MAVS与IKKβ,胞质RIG-I和MDA5的下游键先天免疫信号分量,废除NFκB活化和抗病毒细胞因子的产生。具体来说,γHV68感染激活IKKβ和激活IKKβ磷酸化的RelA加速的RelA退化。因此,γHV68高效解耦从上游激活IKKβNFκB活化,否定了抗病毒细胞因子基因表达。这项研究阐明了一个复杂的策略,即上游先天免疫激活被病毒病原体截获请求撤销的直接下游转录激活和逃避抗病毒细胞因子的产生。
Introduction
最近的研究已经安装在宿主先天免疫反应中概述的整体信号级联。不同的隔间内居住,模式识别受体(的PRRs)检测病原体相关分子模式不同来源的(的PAMP)来触发先天免疫信号1。视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素瘤分化抗原5(MDA5)蛋白是细胞内的传感器能够识别RNA分子具有特定的结构特征2。在激活时,RIG-I与其下游MAVS(也称为IPS-1,VISA和CARDIF)适配器,反过来,激活IKK(IKKαβγ)和IKK-相关激酶(TBK1和IKKε,也称为一骑交互)配合物3-6。激活先天免疫激酶磷酸化的基因表达的关键调节剂,包括转录因子和其抑制剂,以及使宿主的抗病毒基因( 如 IL6,TNF&#转录激活945,CCL5和IFNβ)。这些信号级联构成了建立抗微生物状态,在感染的早期阶段,以限制病原体传播烈性固有先天免疫反应。
鼠γHV68是密切相关的人类致癌KSHV和EB病毒。因此,γHV68感染的小鼠提供了一种易于处理的小动物模型,研究对γ疱疹病毒感染的体内7的宿主免疫应答。使用γHV68,我们的实验室已经发现了一个复杂的策略,即γHV68劫持宿主先天免疫信号,使病毒感染。一方面,γHV68激活MAVS-IKKβ途径通过指导激活IKKβ磷酸化的复制式激活(RTA),该病毒的转录因子密钥γHV68复制8,以促进病毒的转录激活。在另一方面,本IKKβ介导的磷酸化素数的RelA降解和术语inatesNFκB激活9。因此,γHV68感染有效地避免了抗病毒细胞因子的产生。有趣的是,利用γHV68的表达文库筛选鉴定RTA作为一个E3连接酶诱导的RelA退化和废除NFκB激活10。这些发现揭示了复杂的免疫逃避策略,即上游免疫信号事件是由γHV68利用,以否定的终极抗病毒细胞因子的产生。
在这里,我们描述了一个协议来衡量抗病毒细胞因子的产生在体内和前VIVØ感染γHV68小鼠。在协议中,我们通过慢病毒转导,从而精确定位特定的固有免疫分子在调节抗病毒细胞因子产生的作用进一步探讨在淘汰赛胚胎成纤维细胞的天然免疫成分的“复原”的表情。这个协议可以很容易地适应其它维鲁SES和信号通路。
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Protocol
在严格按照指南中的美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用的建议进行的所有动物工作:操守准则 。该方案经南加州大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)。
1。通过实时定量PCR和分泌的ELISA方法γHV68感染小鼠细胞因子基因表达
- 通过腹腔注射1.5毫克ketamine/0.12毫克甲苯噻嗪麻醉性别匹配,6-8周龄的C57BL / 6(B6)窝(8-12只/组),并与40 PFUγHV68的滴鼻接种在40微升(感染及东丰11详细说明)。在不同时间点感染后,用CO 2吸入颈椎脱位安乐死的小鼠。
- 打开胸腔,沿STER左外侧切Num和通过与锋利的剪刀的排骨斩。收集肺组织。
- 收集一半的肺组织(左叶)到含有500微升1.0毫米氧化锆/硅珠的无菌1.5毫升螺旋盖管。加入1毫升冷的无血清DMEM入管和均化肺组织通过珠打浆30秒。冰浴管2分钟,然后重复此过程一次。
- 离心管(15,000× 克,10分钟),在4℃,收集上清液并测定如以下所述的细胞因子产生。
- 根据制造商的说明书使用可商购的细胞因子ELISA试剂盒测量细胞因子。
- 收集肺组织(右叶)的另一半到另一个含珠管,并加入1 ml TRIzol试剂。匀化,并根据制造商的指示,在步骤1.3和提取的RNA作为所述收集上清液。通过利用吸光度读数在260和280nm处测定RNA浓度。 制备cDNA用1μg总RNA,并根据制造商的指令(总终体积为20μl)逆转录酶。稀释的cDNA的50倍与无DNA酶和RNA酶的水并进行定量实时PCR。
- 定量实时PCR机器上执行程序。每个反应含有0.5微升对GAPDH(引物的工作浓度为10μM,CE 500nM的每种引物)的基因特异性引物或引物控制的,取5μlSYBR主混合物和4微升的稀释的cDNA。计算△△Ct法确定抗病毒细胞因子mRNA转录的相对量。
2。 MEF细胞的感染和细胞因子定量ELISA法和定量RT-PCR检测
- 小牛成长+ / +和小牛- / - MEF细胞亚汇合(约80%),电镀前的细胞密度。
- 拆分MEF细胞成12我们LL板以100,000个细胞/孔(细胞密度将是70%左右的第二天)。进行γHV68感染一式三份,以感染复数为5-10(MOI)进行同步并最大化细胞因子诱导。
- 准备γHV68悬浮在含有病毒适量(1毫升每口井)完整的DMEM培养基。
- 去除培养基,加入含γHV68悬浮MEF细胞。
- 将板在组织培养箱,摇滚,每30分钟,并允许共有2小时培养的。
- 删除含有γHV68培养基,用PBS洗一次,并更换新鲜的完全DMEM。
- 在不同时间点感染后,收获培养基进1.5ml离心管中。用冷PBS洗涤细胞,并用胰蛋白酶消化收集被感染的细胞。
- 按照步骤1.5中所述测量抗病毒细胞因子在培养基中。
- 提取的RNA,制备cDNA并进行定量RT-PCR检测,以确定抗病毒细胞因子基因表达按照步骤1.5-1.7中所述。
3。慢病毒制作,病毒感染和产生稳定细胞系
- 分裂293T细胞转染前一天,并允许细胞达到约40%汇合在转染时。
- 转染的293T细胞的10cm皿与包装质粒(1.2微克的pVSV-G和6微克pDR8.9的)和7.2 PCDH-FLAG-MAVS或PCDH控制由磷酸钙沉淀的微克。
- 在6至8小时转染后更换培养基用新鲜完全DMEM。
- 在72小时转染后,收集含介质慢病毒,离心机在4000×g离心15分钟,用0.22μm的膜过滤器过滤。以提高慢病毒滴度,我们离心含病毒介质在110000×g离心2.5小时,在4℃下小心重悬病毒颗粒的体积的兴趣介质的小。
- 种子小牛- / - MEF细胞或其它基因敲除的MEF细胞1天befo再感染6孔板在〜30-40%汇合。
- 感染MEF细胞用1ml的慢病毒和2ml新鲜完全DMEM,补充用聚凝胺至10微克/毫升的最终浓度。
- 离心板在500×g离心,在30℃30分钟,并在板传送到组织培养箱中。
- 在6小时后感染更换培养基用新鲜完全DMEM。
- 分裂MEF细胞在24小时后的感染,并加入嘌呤霉素的1微克/毫升按48小时后的感染的终浓度来选择稳定表达细胞MAVS。
- 保持MEF细胞中含有嘌呤霉素的培养基,并通过与相应的抗体免疫印迹验证蛋白的表达。
- 细胞可用于病毒感染,细胞因子基因表达和分泌实验,在方案2中描述。
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Representative Results
三个有代表性的人物都在这里显示,包括细胞因子产生的γHV68感染小牛肺+ / +和小牛 -/ - / - - γHV68感染的小牛 + / +和小牛的鼠标,细胞因子的分泌和基因表达水平的MEF和γHV68感染小牛的细胞因子mRNA水平- / - MEFs细胞“再造”与MAVS。这些代表性实验利用基因敲除小鼠的研究抗病毒药细胞因子的产生在体内和探索基因敲除的MEF解剖调节细胞因子产生的离体的机构。具体地说,γHV68感染的小牛 - / -小鼠导致显著更高的生产CCL5的体内。小牛 - / -产生更多的抗病毒细胞因子的MEF比γHV68感染,这概括在体内表型在小牛 + / + MEFs细胞。 “Reconstituted“在小牛 MAVS的表达- / - MEFs细胞减少CCL5生产总的来说,这些结果表明,MAVS是必要的γHV68抑制体内和体外的抗病毒细胞因子的产生。
图1。 γHV68急性感染诱导的更高的细胞因子产生的小牛的肺- / -小鼠相比,在小牛 + / +小鼠 。年龄和性别匹配的小牛+ / +和小牛- / -小鼠滴鼻感染40 PFUγHV68和CCL5在感染后ELISA法检测受感染的肺部在指定的日子。 γHV68感染小牛的- / -小鼠导致了显著更高的生产抗病毒细胞因子的CCL5,这表明,MAVS是必要的γHV68抑制的抗病毒细胞因子的产生。数据表示为平均值±平均值(SEM)的标准误差。统计意义:*,P <0.05; **,P <0.02。 点击这里查看大图 。
图2。当γHV68感染, 小牛 - / - MEFs细胞产生更多的抗病毒细胞因子比小牛+ / + MEFs细胞 小牛 + / +和小牛 - / - MEFs细胞感染了γHV68和收获指示小时后感染(HPI),CCL5在上清用ELISA在MEF细胞(A)和基因表达的实时定量PCR(B)进行评估。钍小牛电子商务成果- / -感染γHV68的MEF复述那些γHV68感染小牛的- / -小鼠。数据表示为平均值±三个独立实验的SEM。统计意义:**,P <0.02,*** P <0.005 点此查看大图 。
图3。 “再造”MAVS在小牛的表达- / - MEFs细胞减少CCL5生产 (一) 小牛 - / - MEFs细胞感染了控制或MAVS表达慢病毒和MAVS的表达,免疫印迹分析。 (B) 小牛 - / - MEFs细胞“再造”与MAVS感染了γHV68。 MEFs细胞收获在所指示的小时感染后(HPI)和RNA的定量实时PCR分析,与特异于CCL5引物。数据表示为平均值±三个独立实验的SEM。统计意义:**,P <0.02 点击这里查看大图 。
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Discussion
病毒免疫逃避是最有活力和迷人的交互接口病毒进攻和宿主防御9之一。宿主先天免疫成分的结构,使得信号转导被有效地启动和忠实传送。划定信号级联的层次结构和调控是先天免疫的一个主要话题。在这里,我们介绍一个协议,以确定一种天生的免疫成分,MAVS,在细胞因子产生的病毒逃避的调控作用。该协议包括一种方法确定细胞因子产生的病毒感染的小鼠和评估的MEF细胞因子基因表达和生产。基因敲除的MEF和鼠标提供工具,使蛋白质的功能在体内和体外的遗传和生化解剖。构建在转基因小鼠品系,其中许多是市售的,其数目正在增加以加快的速度,这公关otocol进一步探讨野生型或感兴趣的慢病毒突变蛋白的“再造”的表情。先天免疫成分的“复原”表达的一个潜在限制是不想要的免疫信号通过外源表达触发,这可能会影响病毒感染和信号转导物。优化以实现表达可比内源性水平的低的水平可减少副作用。在一个突变体蛋白进行有针对性的“病灶”用于该事件,它使我们能够在病毒感染时查明特定域的功能,翻译后修饰,或蛋白质 - 蛋白质相互作用在免疫调节。如果“复原”细胞移植到小鼠基因敲除,所选择的免疫组分或靶向突变体的体内功能进行检查。
相比,“敲入”或突变蛋白的转基因的表达,“reconstit野生型或感兴趣的慢病毒突变蛋白的uted“表达的是更具成本和时间效益,允许与增益或丧失功能的突变体不同的调查。整个协议的关键步骤是,重组蛋白应与内源蛋白的水平,特别是当蛋白质是酶或转录因子。过表达某些蛋白质可导致信号转导通路和不明确的结果的异常活化。
虽然我们的协议主要集中在小鼠成纤维细胞,这在很大程度上是由于对γHV68复制先天免疫组分的极限调节,类似的应用可以扩展到其他免疫成分,包括巨噬细胞和树突状细胞。此外,这些方法可适应机理研究将会导致不同的病原体。该应用程序是新兴的12,并可能在将来采取更为中心上演的角色。
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Disclosures
作者宣称没有利益冲突。
Acknowledgments
野生型( 小牛+ / +)和基因敲除( 小牛- / - )小鼠,野生型( 小牛+ / +)和基因敲除( 小牛- / - )的MEF由李志坚陈军大学博士(友情提供得克萨斯大学西南医学中心)13。本出版物是基于由美国国立卫生研究院(R01 CA134241和R01 DE021445)和美国癌症协会(RSG-11-162-01-MPC)赠款资助的工作。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse CCL5 ELISA kit | R&D Systems | DY478 | |
1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z | |
TRIzol | Invitrogen | 15596-018 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
CCL5 quantitative real-time PCR primers | |||
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC | |||
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA |
References
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