Dissekere medfødte immunforsvar signalering i Viral Evasion af cytokinproduktion

Summary

Vi beskriver en protokol til måling af den antivirale cytokinproduktion i mus inficeret med en model herpesvirus murin gamma herpesvirus 68 (γ HV68), som er nært beslægtet med human Kaposis sarkom-associeret herpesvirus (KSHV) og Epstein-Barr virus (EBV). Ved hjælp af genetisk modificerede mus stammer og muse embryonale fibroblaster (MEF), vurderede vi det antivirale cytokinproduktion både in vivo og ex vivo. "Tilberedning" udtryk for medfødte immunforsvar komponenter i knockout embryofibroblaster ved lentiviral transduktion, vi yderligere lokalisere specifikke medfødte immunforsvar molekyler og dissekere de centrale signalsystemer begivenheder, der differentielt regulerer det antivirale cytokin produktion.

Abstract

Som svar på en viral infektion, er svartiden værten medfødte immunsystem aktiveres til at opregulere genekspression og produktion af antivirale cytokiner. Omvendt har vira udviklet indviklede strategier til at unddrage sig og udnytte vært immun signalering for overlevelse og formering. Viral immun unddragelse, medfører vært forsvar og viral svig, giver en af ​​de mest fascinerende og dynamiske grænseflader at skelne samspillet host-virus. Disse undersøgelser fremme vores forståelse medfødte immunsystem regulering og bane vores måde at udvikle nye antivirale behandlinger.

Murine γHV68 er en naturlig patogen af ​​murine gnavere. γHV68 infektion af mus giver en medgørlig lille dyremodel til at undersøge det antivirale respons på menneskelig KSHV og EBV som forstyrrelse af in vivo virus-værts interaktioner er ikke relevant. Her beskriver vi en protokol til at bestemme det antivirale cytokin produktion. Denne protokol kan tilpasses til andre virbruger og signalveje.

For nylig har vi opdaget, at γHV68 kaprer Mavs og IKKβ, centrale medfødte immun signalering komponenter nedstrøms for den cytosoliske RIG-I og MDA5 at ophæve NFkB aktivering og antivirale cytokin produktion. Specifikt γHV68 infektion aktiverer IKKβ og aktiveret IKKβ phosphorylerer RelA at fremskynde RelA nedbrydning. Som sådan γ HV68 effektivt afkobler NFkB aktivering fra sin upstream aktiveret IKKβ, at bevirke antivirale cytokin genekspression. Denne undersøgelse belyser en indviklet strategi, hvorved det opstrøms medfødte immun aktivering opfanges af en viral patogen at ophæve den umiddelbare downstream transkriptionsaktivering og unddrage antiviral cytokinproduktion.

Introduction

Nylige undersøgelser har skitseret de overordnede signalleringskaskader i montering vært medfødte immunrespons. Bosat i særskilte rum, mønstergenkendelse receptorer (PRRS) opdage patogen-associerede molekylære mønstre (PAMPs) af forskellig oprindelse til at udløse medfødte immunforsvar signalering ^1. Den retinsyre-induceret gen I (RIG-I) og modermærkekræft differentiering antigen 5 (MDA5) proteiner er cytosoliske sensorer, der genkender RNA arter med særlige strukturelle træk ^2. Ved aktivering RIG-I interagerer med sine downstream Mavs (også kendt som IPS-1, VISA, og Cardif) adapter, der til gengæld aktiverer IKK (IKKαβγ) og IKK-relateret kinase (TBK1 og IKKε, også kendt som IKKI )-komplekser ^3-6. Aktiveret medfødte immunforsvar kinaser phosphorylerer vigtige regulatorer af genekspression, herunder transkriptionsfaktorer og inhibitorer deraf og muliggøre transkriptionsaktivering vært antivirale gener (f.eks IL6, TNF & #945,, CCL5 og IFNp). Disse signaleringskaskader udgør potente iboende medfødte immunrespons, der etablerer en anti-mikrobiel tilstand for at begrænse patogen udbredelse i de tidlige stadier af infektionen.

Murine γHV68 er nært beslægtet med den menneskelige onkogene KSHV og EBV. Således γHV68 infektion af mus giver en medgørlige lille dyremodel til at undersøge værtens immunrespons gamma herpes virus infektion in vivo ^7. Brug γHV68 har vores laboratorium afsløret en indviklet strategi, hvorved γHV68 kaprer vært medfødte immunforsvar signalering at aktivere virusinfektion. På den ene side γHV68 aktiverer Mavs-IKKβ vej til fremme viral transkriptionel aktivering via dirigere aktiveret IKKβ phosphorylere replikation transaktivator (RTA), den virale transkriptionsfaktor nøgle til γHV68 replikation ^8. På den anden side IKKβ-medieret phosphorylering primer RelA for nedbrydning og sigtinates NFkB aktivering ^9. Som sådan γHV68 infektion effektivt undgår antiviral cytokinproduktion. Interessant, en screening udnytte et udtryk bibliotek af γHV68 identificerede RTA som en E3 ligase at fremkalde RelA nedbrydning og ophæver NFkB aktivering ^10. Disse resultater afdække en indviklet immun unddragelse strategi, hvor upstream immun signalering begivenheder er udnyttet af γHV68 at negere den ultimative antivirale cytokin produktion.

Her beskriver vi en protokol til at måle det antivirale cytokin produktion i mus inficeret med γHV68 både in vivo og ex viv o. I protokollen vi yderligere at udforske "rekonstitueret" ekspression af medfødte immun komponenter knockout embryofibroblaster af lentiviral transduktion, som belyser funktionen af ​​de specifikke medfødte immunmolekyler regulere antivirale cytokinproduktion. Denne protokol kan let tilpasses til andre ViruSES og signalveje.

Protocol

Etik Statement: Alle dyr blev udført under nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledning til pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of Southern California.

1.. Cytokine Gene Expression af kvantitativ real-time PCR og sekretion ved hjælp af ELISA i γHV68-inficerede mus

1. Bedøver kønsmatchede, 6-8 uger gamle C57BL / 6 (B6) søskende (8-12 mus / gruppe) via intraperitonealt at injicere 1,5 mg ketamine/0.12 mg xylazin, og podes intranasalt med 40 PFU γHV68 i 40 ul (infektion beskrevet i Dong og Feng ^11). På forskellige tidspunkter efter infektion aflive musene ved hjælp af CO _2-inhalation efterfulgt af cervikal dislokation.
2. Åbn brystet med en venstre lateral snit langs STERnum og skære igennem ribbenene med en skarp saks. Saml lungevæv.
3. Saml halvdelen af ​​lungevævet (venstre lap) i sterile 1,5 ml rør med skruelåg indeholdende 500 ul 1,0 mm Zirconia / Silica beads. Tilsæt 1 ml koldt serum-frit DMEM i røret og homogeniseres lungevævet ved perle-slag for 30 sek. Chill rør på is i 2 minutter og gentag denne proces en gang.
4. Centrifuger rørene (15.000 x g i 10 minutter) ved 4 ° C opsamles supernatanten og måling af cytokinproduktion som beskrevet nedenfor.
5. Mål cytokiner anvendelse af kommercielt tilgængelige cytokine ELISA kits ifølge producentens anvisninger.
6. Saml den anden halvdel af lungevævet (højre lap) til en anden perle-indeholdende rør og der tilsættes 1 ml TRlzol. Homogeniseres og indsamle supernatanten som beskrevet i trin 1.3 og ekstrakt RNA ifølge fremstilling instruktion. Bestem RNA-koncentrationen ved at tage absorbanslæsninger ved 260 og 280 nm. Forbered cDNA med 1 ug af total RNA og revers transkriptase ifølge fremstilling instruktion (det samlede slutvolumen var 20 ul). Fortynd cDNA 50 gange med DNAse-og RNAse-frit vand og udføre kvantitativ real-time PCR.
7. Udfør programmet på en kvantitativ real-time PCR-maskine. Hver reaktion indeholder 0,5 ul af et par af genspecifikke primere eller kontrol primere GAPDH (koncentrationen bearbejdning af primerne var 10 uM, CE 500 nM for hver primer), 5 pi af SYBR stamblanding og 4 pi af den fortyndede cDNA. Beregn ΔΔCt at bestemme den relative mængde af mRNA-transkripter af antivirale cytokiner.

2. MEF Cell Infektion og cytokin Kvantificering af ELISA og QRT-PCR

1. Grow Mavs ^{+ / +} og Mavs ^{- / -} MEF celler til sub-sammenflydende (ca. 80%) tæthed før plating celler.
2. Split MEF celler i 12-vill plader på 100.000 celler / brønd (celledensiteten vil være omkring 70% på den anden dag). Foretag γHV68 infektion i tre eksemplarer, med en mangfoldighed af infektion (MOI) på 5-10 til at synkronisere og maksimere cytokininduktion.
3. Forbered γHV68 suspension i komplet DMEM-medium indeholdende en passende mængde af virus (1 ml for hver brønd).
4. Fjern mediet og tilsæt γHV68-holdige suspension til MEF celler.
5. Pladen anbringes i vævskultur inkubator, rokkes hver 30 min, og muliggøre en i alt 2 timers inkubation.
6. Fjern γHV68 medium, vaskes en gang med PBS, og erstatte med frisk komplet DMEM.
7. På forskellige tidspunkter efter infektion, høst medium til 1,5 ml Eppendorf-rør. Vask cellerne med kold PBS og indsamle inficerede celler med trypsin fordøjelse.
8. Mål antivirale cytokiner i medium som beskrevet i trin 1.5.
9. Uddrag RNA, fremstille cDNA og udføre QRT-PCR til at bestemme antivirale cytokin-genekspressionsom beskrevet i trin 1.5-1.7.

3. Lentivirus Produktion, Infektion, og Generering af stabile cellelinjer

1. Split 293T celler en dag før transfektion og tillader cellerne at nå ~ 40% konfluens ved transfektion.
2. Transfektion 10 cm skål af 293T celler med emballage plasmider (1,2 ug pVSV-G og 6 ug pDR8.9), og 7,2 ug pCDH-flag-Mavs eller pCDH kontrol calciumphosphatudfældning.
3. Udskift mediet på 6 til 8 timer efter transfektion med frisk komplet DMEM.
4. Ved 72 timer efter transfektion, indsamle medium indeholdende lentivirus, centrifugeres ved 4.000 xg i 15 minutter og filter med 0,22 um membran. For at øge lentivirus titer vi centrifugeres virusholdige medium ved 110.000 x g i 2,5 timer ved 4 ° C. Resuspender forsigtigt den virale pellet i lille mængde medium af interesse.
5. Seed mavs ^{- / -} MEF-celler eller andre knockout MEF celler en dag before-infektion i 6-brønds plader ved ~ 30-40% konfluens.
6. Infect MEF-celler med 1 ml lentivirus og 2 ml frisk komplet DMEM, suppleret med polybren til en slutkoncentration på 10 ug / ml.
7. Centrifugeres pladen ved 500 x g ved 30 ° C i 30 minutter og overføre pladen til en vævskultur-inkubator.
8. Udskift medium ved 6 timer efter infektion med frisk komplet DMEM.
9. Split MEF-celler ved 24 timer efter infektion og tilføje puromycin til en endelig koncentration på 1 mg / ml ved 48 timer efter infektion til at selektere celler, der stabilt udtrykker mavs.
10. Vedligehold MEF celler i puromycin medium og kontrollere protein udtryk ved immunoblotting med tilsvarende antistoffer.
11. Celler kan anvendes for viral infektion, cytokin-genekspression og sekretion eksperimenter som beskrevet i protokol 2.

Representative Results

Tre repræsentative tal er vist her, herunder cytokinproduktion i lungen af γHV68-inficerede Mavs ^{+ / +} og ^{Mavs-/ -} mus, cytokinsekretion og genekspression niveau γHV68-inficerede Mavs ^{+ / +} og Mavs ^{- / -} MEF'er, og cytokin mRNA niveauer af γHV68-inficerede Mavs ^{- / -} MEF'er "rekonstitueret" med Mavs. Disse repræsentative eksperimenter udnytter gen knockout-mus til at undersøge antivirale cytokin produktion in vivo og udforske knockout MEF at dissekere den mekanisme af regulerede cytokinproduktion ex vivo. Specifikt γHV68 infektion Mavs ^{- / -} mus medførte signifikant højere produktion af CCL5 in vivo. Mavs ^{- / -} MEF'er produceret mere antivirale cytokin end Mavs ^{+ / +} MEF'er løbet γHV68 infektion, som gengiver in vivo fænotype. "Reconstituted "ekspression af mavs i Mavs ^{- / -} MEF'er faldt CCL5 produktion Tilsammen viser disse resultater, at Mavs er nødvendig for γHV68 at undertrykke antiviral cytokinproduktion både in vivo og ex vivo..

Figur 1. γHV68 akut infektion induceret højere cytokinproduktion i lungerne hos Mavs ^{- / -} mus end det i Mavs ^{+ / +-mus.} Alders-og køns-matchede Mavs ^{+ / +} og Mavs ^{- / -} mus blev intranasalt inficeret med 40 PFU γHV68 og CCL5 i de inficerede lungerne ved angivne dage efter infektion blev målt ved ELISA. γHV68 infektion Mavs ^{- / -} mus førte til betydeligt højere produktion af antiviral cytokin CCL5, der foreslog, at Mavs er nødvendig for γHV68 at undertrykke antivirale cytokin produktion. Data er præsenteret som middelværdi ± standardfejlen på middelværdien (SEM). Den statistiske signifikans: *, p <0,05, ** p <0,02. Klik her for at se større billede .

Figur 2. Ved γHV68 infektion, Mavs ^{- / -} MEF'er produceret mere antivirale cytokin end Mavs ^{+ / +} MEF'er Mavs ^{+ / +} og Mavs ^{-. / -} MEF'er blev inficeret med γHV68 og høstet ved angivne timer efter infektion (HPI), CCL5 i supernatanten blev vurderet ved ELISA (A) og genekspression i MEF-celler ved hjælp af kvantitativ real-time PCR (B). The resultater af Mavs ^{- / -} MEF'er inficeret med γHV68 rekapitulere de γHV68-inficerede Mavs ^{- / -} mus. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM for tre uafhængige eksperimenter. Den statistiske signifikans:. ** P <0,02, *** p <0,005 Klik her for at se større billede .

Figur 3. "Kunstigt" udtryk for Mavs i Mavs ^{- / -} MEF'er faldt CCL5 produktion (A) Mavs ^{-. / -} MEF'er blev inficeret med kontrol eller Mavs udtrykker lentivirus og udtryk for Mavs blev analyseret ved immunoblotting. (B) Mavs ^{- / -} MEF'er "rekonstitueret" med Mavs blev smittet med γHV68.. MEF'er blev høstet på det angivne timer efter infektion (HPI) og RNA blev analyseret ved kvantitativ real-time PCR med primere specifikke for CCL5. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM for tre uafhængige eksperimenter. Den statistiske signifikans:. ** P <0,02 Klik her for at se større billede .

Discussion

Viral immun unddragelse er en af de mest dynamiske og fascinerende samspil interface viral lovovertrædelse og vært forsvar ^9. Værten medfødte immunforsvar komponenter er struktureret sådan, at signaltransduktion effektivt initieres og trofast videregivet. Afgrænse hierarkiet og regulering af signalering kaskader er en fremtrædende emne for medfødte immunitet. Her introducerer vi en protokol til at identificere de regulatoriske roller en medfødt immun komponent, Mavs, i viral unddragelse af cytokin produktion. Protokollen omfatter en fremgangsmåde bestemmelse af cytokin produktion i virus-inficerede mus og vurdere cytokin genekspression og produktion i MEF. Genet knockout MEF og mus giver værktøjer, der giver den genetiske og biokemiske dissektion af protein funktion in vivo og ex vivo. Bygget på de genetisk modificerede mus stammer, hvoraf mange er kommercielt tilgængelige og antal, som er stigende i et accelererende tempo, dette PRotocol yderligere udforsker "rekonstitueret" udtryk for vildtype eller muteret protein af interesse ved lentivirus. En mulig begrænsning af "rekonstitueret" ekspression af medfødte immun komponenter er uønsket immunrespons signalering udløses af exogene ekspression, som kan have indflydelse virusinfektion og signaltransduktion deraf. Optimization for at opnå et lavt niveau af ekspression sammenlignes med endogene niveauer kan reducere bivirkning. I tilfælde af en mutant protein bærer målrettede "læsioner" anvendes, vil det give os mulighed for at lokalisere funktionen af ​​et bestemt domæne, post-translationel modifikation eller protein-protein interaktion i immun regulering i løbet af virusinfektion. Hvis "rekonstitueret" celler transplanteres ind knockout-mus, kan in vivo-funktion af udvalgte immune komponenter eller målrettet mutant undersøges.

Sammenlignet med "knock-in" eller transgen ekspression af mutantproteiner "reconstituted "ekspression af vildtype eller muteret protein af interesse ved lentivirus er mere omkostnings-og tidseffektiv, hvilket tillader undersøgelse med forskellige gevinster eller tab af funktion mutanter. Det kritiske trin i hele protokollen er, at den rekonstituerede protein skal være sammenlignelig med endogent protein niveau, især når proteinet er et enzym eller transkriptionsfaktor. Over-ekspression af nogle proteiner kan føre til afvigende aktivering af signalvejen og tvetydige resultater.

Selvom vores protokol fokuserer primært på musefibroblaster, hvilket i høj grad skyldes den iboende regulering af medfødte immunforsvar komponent på γHV68 replikation, kan lignende programmer udvides til andre immun bestanddele, herunder makrofager og dendritiske celler. Derudover kan disse metoder tilpasses til mekanistiske undersøgelser med forskellige patogener. Ansøgningen er ved at opstå ¹² og vil sandsynligvis tage flere centrum-iscenesatte roller i fremtiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA