Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

Summary

Nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez les souris infectées par un virus de l'herpès modèle murin gamma herpèsvirus 68 (γ HV68) qui est étroitement liée à associé au sarcome de virus de l'herpès de Kaposi humain (KSHV) et le virus d'Epstein-Barr (EBV). L'utilisation de souches de souris génétiquement modifiées et les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), nous avons évalué la production de cytokines antivirales la fois in vivo et ex vivo. "Reconstitution" de l'expression des composants immunitaires innées à élimination directe des fibroblastes embryonnaires de transduction lentiviral, nous Pinpoint en outre des molécules immunitaires innées spécifiques et disséquer les événements de signalisation clés qui régulent différemment la production de cytokines antiviral.

Abstract

En réponse à une infection virale, l'hôte une réponse immunitaire innée est activé pour réguler à la hausse l'expression des gènes et la production de cytokines antivirales. Inversement, les virus ont développé des stratégies complexes pour échapper à exploiter et signalisation immunitaire de l'hôte pour la survie et la propagation. Évasion immunitaire virale, entraînant défense de l'hôte et l'évasion virale, fournit l'une des interfaces les plus fascinants et les plus dynamiques de discerner l'interaction hôte-virus. Ces études progresser notre compréhension de la régulation immunitaire innée et ouvrent notre façon de développer de nouveaux traitements antiviraux.

Murin γHV68 est un agent pathogène naturel des rongeurs murins. γHV68 infection de souris fournit un modèle animal docile pour examiner la réponse antivirale de KSHV humaine et EBV qui perturbation des interactions in vivo dans virus-hôte n'est pas applicable. Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer la production de cytokines antiviral. Ce protocole peut être adapté à d'autres virutilise et les voies de signalisation.

Récemment, nous avons découvert que γHV68 détourne MAVS et IKKß, innés principaux composants de signalisation en aval de l'immunitaires cytosolique RIG-I et MDA5, d'abroger l'activation de NFkB et la production de cytokines antivirales. Plus précisément, l'infection active γHV68 IKKß et que IKKß activée phosphoryle RelA à accélérer la dégradation de RelA. En tant que tel, γ HV68 découple efficacement l'activation de NFkB de son amont IKKß activé, la négation de l'expression antiviral de gène de cytokine. Cette étude met en lumière une stratégie complexe de sorte que l'activation immunitaire innée en amont est interceptée par un agent pathogène viral d'annuler l'activation de la transcription en aval immédiat et soustraire la production de cytokines antivirales.

Introduction

Des études récentes ont souligné les cascades de signalisation dans l'ensemble de montage réponses immunitaires innées de l'hôte. Résidant dans des compartiments distincts, les récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) de détecter des modèles moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) d'origines diverses pour déclencher immunitaire inné de signalisation ^1. Le gène induite par l'acide rétinoïque I (RIG-I) et de l'antigène de différenciation des mélanomes (5 protéines de MDA5) sont des capteurs qui reconnaissent cytosoliques espèces d'ARN avec des caractéristiques structurales spécifiques ^2. Lors de l'activation, RIG-I interagit avec son MAVS aval (également connu sous le IPS-1, VISA, et CARDIF) adaptateur qui, à son tour, active la IKK (IKKαβγ) et kinase liée IKK (TBK1 et IKKε, également connu sous le IKKi ) complexes ^3-6. Kinases activées phosphorylent immunitaires innées des régulateurs clés de l'expression de gènes, y compris les facteurs de transcription et leurs inhibiteurs, et permettent l'activation transcriptionnelle de gènes antiviraux de l'hôte (par exemple IL6, TNF & #945;, CCL5, et IFNß). Ces cascades de signalisation constituent les réponses innées intrinsèques puissants immunitaires qui établissent un état anti-microbienne de limiter la propagation de l'agent pathogène au cours des premiers stades de l'infection.

Murine γHV68 est étroitement liée à KSHV oncogène humain et EBV. Ainsi, l'infection de souris γHV68 fournit un petit modèle animal traitable à examiner la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par le virus de l'herpès gamma in vivo ^7. Utilisation γHV68, notre laboratoire a découvert une stratégie complexe dans lequel γHV68 détourne accueillir signalisation immunitaire innée à permettre à l'infection virale. D'une part, γHV68 active la voie MAVS-IKKß, de promouvoir l'activation de la transcription virale via diriger IKKß activé pour phosphoryler la réplication transactivateur (RTA), la clé virale du facteur de transcription pour la réplication γHV68 ^8. D'autre part, la phosphorylation médiée par amorce IKKß RelA pour la dégradation et la duréeInates activation de NFkB ^9. En tant que tel, l'infection γHV68 évite efficacement la production de cytokines antiviral. Fait intéressant, un dépistage utilisant une bibliothèque d'expression de γHV68 identifié RTA comme une ligase E3 pour induire la dégradation des RelA et abroger activation de NFkB ^10. Ces résultats dévoilent une stratégie d'évasion immunitaire complexe dans lequel les événements de signalisation en amont immunitaires sont mobilisées par γHV68 à nier l'ultime production de cytokines antiviral.

Ici, nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez des souris infectées avec γHV68 la fois in vivo et ex viv o. Dans le protocole, nous explorons encore la "reconstitué" expression des composants de l'immunité innée dans les fibroblastes embryonnaires knock-out par transduction lentivirus, qui met en évidence la fonction des molécules immunitaires innées spécifiques dans la régulation de la production de cytokines antiviral. Ce protocole peut être facilement adaptée à d'autres virusession et les voies de signalisation.

Protocol

Déclaration éthique: Tous les travaux de l'animal a été réalisé sous stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) de l'Université de Californie du Sud.

Une. Cytokine expression génique par quantitative PCR en temps réel et la sécrétion par ELISA chez des souris infectées par γHV68

1. Anesthésier, 6-8 semaines d'âge C57BL / 6 (B6) littermates genre identifié (8-12 souris / groupe) par injection intrapéritonéale de 1,5 mg de ketamine/0.12 mg de xylazine, et inoculer par voie intranasale avec 40 PFU de γHV68 dans 40 pi (infection détaillé dans Dong Feng et ^11). A différents moments après l'infection, euthanasier les souris en utilisant inhalation de CO ₂ suivie par dislocation cervicale.
2. Ouvrez le coffre avec une coupe latérale gauche le long de la sternum et couper à travers les côtes avec des ciseaux pointus. Recueillir les tissus pulmonaires.
3. Recueillir la moitié du tissu pulmonaire (lobe gauche) dans 1,5 ml tubes à bouchon à vis stériles contenant 500 ul de 1,0 mm perles zircon / de silice. Ajouter 1 ml de DMEM sans sérum froid dans le tube et homogénéiser les tissus pulmonaires de bourrelet battement pendant 30 sec. Refroidir les tubes sur de la glace pendant 2 min et répéter ce processus une fois.
4. Centrifuger les tubes (15 000 x g pendant 10 min) à 4 ° C, recueillir le surnageant et à mesurer la production de cytokine tels que décrits ci-dessous.
5. Mesurer cytokines aide disponibles dans le commerce cytokines kits ELISA selon les instructions du fabricant.
6. Recueillir l'autre moitié du tissu pulmonaire (lobe droit) dans un autre tube contenant de perles et ajouter 1 ml TRIzol. Homogénéiser et recueillir le surnageant, comme décrit dans l'étape 1.3 et de l'ARN extrait selon les instructions du fabricant. Déterminer la concentration d'ARN par des lectures de l'absorbance à 260 et 280 nm. Préparer l'ADNc avec 1 ug d'ARN total et la transcriptase inverse selon les instructions de la fabrication (le volume final était de 20 pl au total). Diluer ADNc 50 fois à la DNAse et de l'eau sans RNAse et effectuer la PCR quantitative en temps réel.
7. Effectuer le programme sur une machine quantitative PCR en temps réel. Chaque réaction contient 0,5 ul d'une paire d'amorces spécifiques d'un gène ou d'amorces de contrôle de GAPDH (la concentration de travail des amorces étaient de 10 uM, CE 500 nM de chaque amorce), 5 pi de mélange maître SYBR et 4 pl de la dilution ADNc. Calculer ΔΔCt pour déterminer la quantité relative de transcrits d'ARNm de cytokines antivirales.

2. MEF infection cellulaire et des cytokines quantification par ELISA et qRT-PCR

1. Cultivez Mavs ^{+ / +} et Mavs ^{- / -} cellules MEF à sous-confluence (environ 80%) densité avant l'étalement des cellules.
2. Diviser les cellules MEF en 12 nousoutes les plaques à 100 000 cellules / puits (la densité cellulaire sera d'environ 70% le deuxième jour). Effectuer infection γHV68 en triple, avec une multiplicité d'infection (MOI) de 5 à 10 pour synchroniser et optimiser l'induction de cytokines.
3. Préparer γHV68 suspension dans du milieu complet DMEM contenant la quantité appropriée de virus (1 ml pour chaque puits).
4. Retirer moyen et ajouter γHV68 suspension contenant les cellules MEF.
5. Placer la plaque dans le tissu incubateur de culture, le rock toutes les 30 minutes, et permettre à un total de 2 heures d'incubation.
6. Retirez milieu contenant γHV68, laver une fois avec du PBS, et les remplacer par du DMEM complet frais.
7. À divers moments après l'infection, le milieu de la récolte dans 1,5 ml tubes Eppendorf. Laver les cellules avec du PBS froid et de recueillir les cellules infectées par digestion à la trypsine.
8. Mesurer cytokines antivirales dans un milieu tel que décrit dans l'étape 1.5.
9. Extraire l'ARN, l'ADNc de préparer et d'effectuer qRT-PCR pour déterminer l'expression des gènes de cytokines antiviralescomme décrit dans les étapes 1.5 à 1.7.

3. La production de lentivirus, infection, et la génération de lignées cellulaires stables

1. Division des cellules 293T Un jour avant la transfection et permettent aux cellules d'atteindre environ 40% de confluence au moment de la transfection.
2. Transfecter de 10 cm de cellules 293T avec les plasmides d'emballage (1,2 ug de pVSV-G et 6 pg de pDR8.9) et 7,2 ug de PCDH-drapeau-MAVS ou contrôle PCDH par précipitation au phosphate de calcium.
3. Remplacer moyenne de 6 à 8 heures après la transfection avec du DMEM complet frais.
4. A 72 heures après la transfection, un milieu contenant du lentivirus collecter, centrifuger à 4000 g pendant 15 min, et le filtre à membrane de 0,22 um. Pour augmenter le titre lentivirus, nous centrifuger le milieu contenant le virus à 110 000 g pendant 2,5 heures à 4 ° C. Remettre en suspension avec précaution le culot viral dans un petit volume de milieu d'intérêt.
5. Mavs de semences ^{- / -} cellules MEF ou d'autres cellules knock-out MEF un jour Before infection dans des plaques à 6 puits à ~ 30-40% de confluence.
6. Infecter les cellules avec 1 ml MEF lentivirus et 2 ml de DMEM complet frais, additionné de polybrène à une concentration finale de 10 pg / ml.
7. Centrifuger la plaque à 500 x g à 30 ° C pendant 30 min et à transférer la plaque à un incubateur de culture tissulaire.
8. Remplacer moyenne à 6 heures après l'infection avec du DMEM complet frais.
9. Fractionner les cellules MEF à 24 heures après l'infection et ajouter puromycine à une concentration finale de 1 pg / ml à 48 heures après l'infection pour sélectionner les cellules exprimant de façon stable MAVS.
10. Maintenir les cellules MEF dans un milieu contenant la puromycine et vérifier l'expression des protéines par immunoblot avec des anticorps correspondants.
11. Les cellules peuvent être utilisées pour l'infection virale, l'expression des gènes des cytokines et des expériences de sécrétion tel que décrit dans le protocole 2.

Representative Results

Trois figures représentatives sont présentés ici, y compris la production de cytokines dans le poumon de Mavs γHV68 infectés ^{+ / +} et ^{Mavs-/ -} souris, la sécrétion de cytokines et l'expression des gènes niveau de Mavs ^{+ / +} et Mavs γHV68 infectés ^{- / -} MEF, et les niveaux d'ARNm de cytokines Mavs γHV68 infectés ^{- / -} FAE "reconstitués" avec MAVS. Ces expériences représentatives utilisent des souris knock-out de gènes pour étudier la production de cytokines antivirales in vivo et explorer les MEF KO pour disséquer le mécanisme de la production de cytokines ex vivo réglementé. Plus précisément, l'infection γHV68 de Mavs ^{- / -} souris a conduit à la production significativement plus élevée de CCL5 in vivo. Mavs ^{- / -} MEF produits cytokine plus antiviral que Mavs ^{+ / +} FAE lors de l'infection γHV68, qui récapitule le phénotype in vivo. "Reconstitutiontituée "expression de MAVS dans Mavs ^{- / -} MEF diminution de la production de CCL5 Collectivement, ces résultats démontrent que MAVS est nécessaire pour γHV68 pour supprimer la production de cytokines antivirales la fois in vivo et ex vivo..

Figure 1. γHV68 infection aiguë induite augmentation de la production de cytokines dans les poumons des Mavs ^{- / -} souris que dans ^{+ / +} souris Mavs. L'âge et le Mavs ^{+ / +} et Mavs genre identifié ^{- / -} souris ont été infectées par voie intranasale avec 40 PFU de γHV68 et CCL5 dans les poumons infectés à jours indiqués après l'infection a été mesurée par ELISA. γHV68 infection des Mavs ^{- / -} souris a conduit à la production significativement plus élevé de cytokine antiviral CCL5, ce qui suggère que MAVS est nécessaire pour γHV68 à supprimer la production de cytokine antivirale. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± l'erreur standard de la moyenne (SEM). La signification statistique: * p <0,05; **, p <0,02. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2. Lors de l'infection γHV68, Mavs ^{- / -} FAE produites cytokine plus antiviral que Mavs ^{+ / +} FAE Mavs ^{+ / +} et Mavs ^{-. / -} FAE ont été infectées par γHV68 et récoltées à des heures post-infection (hpi) indiqués, CCL5 dans le surnageant a été évaluée par ELISA (A) et l'expression de gènes dans des cellules MEF par quantitative PCR en temps réel (B). ThRésultats de la e de Mavs ^{- / -} infectées par le MEF γHV68 récapitulent ceux des Mavs γHV68 infectés ^{- / -} souris. Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. La signification statistique. **, P <0,02, ***, p <0,005 Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3. "Reconstitué" expression de MAVS dans Mavs ^{- / -} FAE diminution de la production de CCL5 (A) Mavs ^{-. / -} FAE ont été infectées par le contrôle ou MAVS exprimant lentivirus et l'expression de MAVS ont été analysées par immuno. (B) Mavs ^{- / -} FAE "reconstitué" avec MAVS ont été infectés par γHV68. MEF ont été récoltés à l'infection heures de poste indiqué (HPI) et de l'ARN a été analysée par PCR quantitative en temps réel avec des amorces spécifiques pour CCL5. Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. La signification statistique. **, P <0,02 Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Évasion immunitaire virale est l'une des interactions les plus dynamiques et les plus fascinants d'interface infraction virale et défense de l'hôte ^9. Les composants de l'immunité innée de l'hôte sont structurés de telle sorte que la transduction du signal est effectivement lancé et fidèlement transmis. La délimitation de la hiérarchie et de la réglementation des cascades de signalisation est un sujet prééminent de l'immunité innée. Ici, nous introduisons un protocole pour identifier les rôles de réglementation d'un composant immunitaire inné, MAVS, l'évasion virale de la production de cytokines. Le protocole comprend un procédé de détermination de la production de cytokines chez la souris infectée par un virus et l'évaluation de l'expression des gènes des cytokines et la production dans les MEF. Les FAE knock-out de gène et de la souris sont des outils qui permettent la dissection génétique et biochimique de la fonction des protéines in vivo et ex vivo. Construit sur les lignées de souris génétiquement modifiées, dont beaucoup sont disponibles dans le commerce et dont plusieurs sont en augmentation à un rythme accéléré, ce protocole explore en outre le "reconstitué" expression de type sauvage ou protéine mutée d'intérêt par lentivirus. Une des limites potentielles de la "reconstitué" expression des composants de l'immunité innée est la signalisation immunitaire indésirable déclenchée par l'expression exogène, ce qui peut avoir un impact infection virale et la transduction du signal de celui-ci. Optimisation pour atteindre un faible niveau d'expression comparable à des niveaux endogènes peut réduire l'effet de côté. Dans le cas d'une protéine mutante portant «lésions» ciblées est utilisé, il nous permettra d'identifier les fonctions d'un domaine particulier, la modification post-traductionnelle, ou de l'interaction protéine-protéine dans la régulation immunitaire lors d'une infection virale. Si les cellules "reconstitués" sont transplantées dans souris knock-out, la fonction in vivo de composants immunitaires sélectionnés ou mutant ciblé peut être examiné.

Par rapport à la "knock-in" ou l'expression transgénique de protéines mutantes, "reconstitbué "expression de type sauvage ou protéine mutée d'intérêt par lentivirus est plus économique et plus efficace dans le temps, permettant l'enquête avec des mutants diverses gain ou de la perte de fonction. L'étape critique de l'ensemble du protocole est que la protéine reconstituée devrait être comparable au niveau de la protéine endogène, en particulier lorsque la protéine est une enzyme ou d'un facteur de transcription. surexpression de certaines protéines peut conduire à une activation aberrante de la voie de signalisation et des résultats ambigus.

Bien que notre protocole se concentre principalement sur des fibroblastes de souris, ce qui est largement dû à la régulation intrinsèque du composant immunitaire innée sur la réplication γHV68, applications similaires peuvent être étendues à d'autres constituants du système immunitaire, y compris les macrophages et les cellules dendritiques. En outre, ces approches peuvent être adaptées pour des études mécanistiques impliquant divers agents pathogènes. L'application est en train de ¹² et prendra probablement plusieurs rôles de centre-mise en scène à l'avenir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA