Dissekere medfødte immunsignalisering i Viral Evasion av cytokinproduksion

Summary

Vi beskriver en protokoll for å måle den antivirale cytokin produksjon i mus infisert med en modell herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (γ HV68) som er nært beslektet med humant Kaposis sarkom assosiert herpesvirus (KSHV) og Epstein-Barr virus (EBV). Utnytte genmodifiserte mus stammer og mus embryonale fibroblaster (MEFs), vurderte vi de antivirale cytokin produksjon både in vivo og ex vivo. "Rekonstitusjon" uttrykk for medfødte immun komponenter i knockout embryonale fibroblaster ved lentiviral transduksjon, vi videre finne spesifikke medfødte immun molekyler og dissekere de viktigste signal hendelser som differentially regulerer antiviral cytokin produksjon.

Abstract

Som reaksjon på en virusinfeksjon, er verten medfødte immunrespons aktiveres for å opp-regulerer genekspresjon og produksjon av antivirale cytokiner. Omvendt har virus utviklet intrikate strategier for å omgå og utnytte vertens immunsignalisering for overlevelse og formering. Viral immune evasion, innebærer host forsvar og viral unndragelser, gir en av de mest fascinerende og dynamiske grensesnitt for å skjelne verts-virus interaksjon. Disse studiene fremme vår forståelse i medfødte immunregulering og bane vei for å utvikle nye antivirale behandlingsformer.

Murine γHV68 er et naturlig patogen av murine gnagere. γHV68 infeksjon i mus gir en medgjørlig liten dyremodell for å undersøke den antiviral respons på menneskelig KSHV og EBV som forstyrrelse av in vivo-virus-vert interaksjoner er ikke aktuelt. Her beskriver vi en protokoll for å bestemme den antivirale cytokinproduksjon. Denne protokollen kan tilpasses andre virbruker og signalveier.

Nylig, har vi oppdaget at γHV68 kaprer MAVS og IKKβ, viktige medfødte immunsignalkomponenter nedstrøms cytosoliske RIG-I og MDA5, å oppheve NFΚB aktivering og antiviral cytokin produksjon. Spesielt γHV68 infeksjon aktiverer IKKβ og som aktiveres IKKβ phosphorylates forhold til å akselerere forhold degradering. Som sådan, γ HV68 effektivt kobler seg NFΚB aktivering fra sin oppstrøms aktivert IKKβ, benektende antiviral cytokin genuttrykk. Denne studien belyser en intrikat strategi der oppstrøms medfødte immunaktivering blir snappet opp av en viral patogen å oppheve den umiddelbare nedstrøms transcriptional aktivering og unngå antiviral cytokin produksjon.

Introduction

Nyere studier har skissert den samlede signal kaskader i monterings vert medfødte immunresponser. Bosatt innenfor forskjellige avdelinger, mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) oppdage patogen-assosiert molekylære mønstre (PAMPs) av diverse opprinnelse å utløse medfødte immun signaliserer ^en. Den retinsyre-indusert gen I (RIG-I) og melanom differensiering antigen 5 (MDA5) proteiner er cytosoliske sensorer som gjenkjenner RNA arter med spesifikke strukturelle egenskaper ^to. Ved aktivering, samhandler RIG-I med sine nedstrøms MAVS (også kjent som IPS-en, VISA, og CARDIF) adapter som i sin tur aktiverer IKK (IKKαβγ) og IKK-relaterte kinase (TBK1 og IKKε, også kjent som Ikki ) komplekser ^3-6. Aktivert medfødte immun kinaser phosphorylate viktige regulatorer av genuttrykk, inkludert transkripsjonsfaktorer og hemmere av dette, og gjøre det mulig transcriptional aktivering av vertsantivirale gener (f.eks IL6, TNF & #945;, CCL5, og IFNβ). Disse signal kaskader utgjør potente iboende medfødte immunresponser som etablerer en anti-mikrobiell staten å begrense patogen forplantning i tidlige stadier av infeksjon.

Murint γHV68 er nært knyttet til menneskelig onkogene KSHV og EBV. Således γHV68 infeksjon i mus gir en medgjørlig liten dyremodell for å undersøke vertens immunrespons til gamma herpesvirus-infeksjon in vivo ^7.. Bruke γHV68, har vår lab avdekket et intrikat strategi der γHV68 kaprer vert medfødte immunsignalisering for å muliggjøre virusinfeksjon. På den ene siden, γHV68 aktiverer MAVS-IKKβ veien å fremme viral transcriptional aktivering via dirigere aktivert IKKβ å phosphorylate replikering transactivator (RTA), viral transkripsjonsfaktor nøkkel for γHV68 replikering ^åtte. På den annen side, klargjør IKKβ-mediert fosforylering rela for nedbrytning og terminates NFΚB aktivering ^ni. Som sådan, γHV68 infeksjon effektivt unngår viral cytokinproduksjon. Interessant, identifisert en screening utnytte et uttrykk bibliotek av γHV68 RTA som en E3 ligase å indusere forhold fornedrelse og oppheve NFΚB aktivering ^10. Disse funnene avdekke en intrikat immune evasion strategi der oppstrøms immunsignal hendelser tøyles av γHV68 å negere den ultimate antiviral cytokin produksjon.

Her beskriver vi en protokoll for å måle antiviral cytokin produksjon i mus infisert med γHV68 både in vivo og ex viv o. I protokollen vi videre utforske "rekonstituert" uttrykk for medfødte immun komponenter i knockout embryonale fibroblaster ved lentiviral transduksjon, som peikt funksjon av de spesifikke medfødte immun molekyler i å regulere den antivirale cytokin produksjon. Denne protokollen kan lett tilpasses andre Viruses og signalveier.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle dyr arbeidet ble utført under strengt samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Southern California.

En. Cytokin Gene Expression av kvantitativ real-time PCR og sekresjon av ELISA i γHV68-infiserte mus

1. Anesthetize kjønns matchet, 6-8 uker gamle C57BL / 6 (B6) kullsøsken (8-12 mus / gruppe) via intraperitonealt injisere 1,5 mg ketamine/0.12 mg xylazin, og vaksinere intranasalt med 40 PFU av γHV68 i 40 mL (infeksjon beskrevet i Dong og Feng ^11). På forskjellige tidspunkter etter infeksjon, avlive musene ved hjelp av _{CO2-innånding,} etterfulgt av cervical dislokasjon.
2. Åpne brystet med en venstre lateral kutt langs sternum og skjære gjennom ribber med skarp saks. Samle lunge vev.
3. Samle halvparten av lungevev (venstre lapp) i sterile 1,5 ml skrukork-rør inneholdende 500 ul 1.0 mm zirkonia / silika-perler. Tilsett 1 ml kald serum-fri DMEM i røret og homogenlungevevet ved perle-juling i 30 sek. Chill rørene på is i 2 min og gjenta denne prosessen en gang.
4. Sentrifuger rør (15 000 x g i 10 min) ved 4 ° C, samle supernatanten og måle cytokinproduksjon, som beskrevet nedenfor.
5. Mål cytokiner bruker kommersielt tilgjengelige cytokin ELISA kits i henhold til produsentens anvisninger.
6. Samle den andre halvparten av lungevev (høyre lapp) inn i en annen perle-inneholdende rør og tilsett 1 ml TRIzol. Homogen og samle supernatanten som beskrevet i trinn 1.3 og ekstrakt RNA i henhold til fabrikantens instruksjon. Bestem RNA konsentrasjon ved å ta avlesninger ved 260 og 280 nm. Forbered cDNA med 1 pg av total RNA og revers transkriptase i henhold til fabrikantens instruksjoner (total sluttvolumet var 20 ul). Fortynn cDNA 50 ganger med DNAse-og RNase-fritt vann og utføre kvantitativ real-time PCR.
7. Utfør programmet på en kvantitativ real-time PCR maskin. Hver reaksjon inneholder 0,5 pl av et par av gen-spesifikke primere eller primere kontroll av GAPDH (arbeids konsentrasjonen av primerne var 10 uM, CE 500 nM for hver primer), 5 pl av SYBR konsentrat-blanding, og 4 pl av den fortynnede cDNA. Beregn ΔΔCt for å bestemme den relative mengde av mRNA-transkripsjoner av antivirale cytokiner.

2. MEF Cell Infeksjon og cytokin Kvantifisering av ELISA og QRT-PCR

1. Grow Mavs ^{+ / +} og Mavs ^{- / -} MEF celler til sub-konfluent (ca. 80%) tetthet før plating celler.
2. Splitte MEF celler i 12-vill plater på 100 000 celler / brønn (celletettheten vil være rundt 70% på den andre dagen). Gjennomføre γHV68 infeksjon i triplicates, med et mangfold av infeksjon (MOI) på 5-10 for å synkronisere og maksimere cytokin induksjon.
3. Forbered γHV68 suspensjon i fullstendig DMEM medium inneholdende passende mengder virus (1 ml for hver brønn).
4. Fjern medium og legge γHV68 holdig suspensjon til MEF celler.
5. Sett platen i vevskultur inkubator, stein hvert 30 min, og tillate i alt 2 timer med inkubasjon.
6. Fjern γHV68-holdig medium, vaske en gang med PBS, og erstatte med frisk komplett DMEM.
7. Ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon, innhøsting medium i 1,5 ml Eppendorf-rør. Vask cellene med kald PBS og samle infiserte celler ved trypsin fordøyelsen.
8. Mål antivirale cytokiner i et medium som beskrevet i trinn 1.5.
9. Pakk RNA, forberede cDNA og utføre QRT-PCR for å bestemme antiviral cytokin genuttrykksom beskrevet i trinn 1.5 til 1.7.

Tre. Lentivirus Produksjon, Infeksjon, og Generation of Stabile Cell Lines

1. Split 293T-celler én dag før transfeksjon og tillate cellene å nå ~ 40% konfluens ved transfeksjon.
2. Transfektere 10 cm rett av 293T celler med emballasje plasmider (1,2 mikrogram av pVSV-G og 6 mikrogram pDR8.9) og 7,2 mikrogram pCDH-Flag-MAVS eller pCDH kontroll av kalsiumfosfat nedbør.
3. Skift medium ved 6 til 8 timer post-transfeksjon med friskt komplett DMEM.
4. Ved 72 timer post-transfeksjon, samle mediet som inneholder lentivirus, sentrifuger ved 4000 xg i 15 min, og filter med 0,22 um membran. For å øke lentivirus titer, sentrifuger vi den virusinneholdende medium ved 110.000 xg i 2,5 timer ved 4 ° C. Resuspendere viral pelleten forsiktig i små volum av medium av interesse.
5. Seed Mavs ^{- / -} MEF celler eller andre knockout MEF celler en dag before-infeksjon i 6-brønners plater på ~ 30-40% konfluens.
6. Infect MEF-celler med en lentivirus ml og 2 ml friskt komplett DMEM, supplert med polybren til en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml.
7. Sentrifuger plate ved 500 x g ved 30 ° C i 30 min og overfører platen til en vevskultur-inkubator.
8. Erstatt medium på 6 timers post-infeksjon med frisk komplett DMEM.
9. Split MEF-celler ved 24 timer etter infeksjon og legge puromycin til en endelig konsentrasjon på 1 mikrogram / ml ved 48 timer etter infeksjon for å velge celler stabilt uttrykker MAVS.
10. Oppretthold MEF celler i puromycin holdig medium og verifisere protein uttrykk ved immuno med tilsvarende antistoffer.
11. Cellene kan anvendes for viral infeksjon, cytokin genekspresjon og sekresjon eksperimenter som er beskrevet i protokoll 2.

Representative Results

Tre representative tallene er vist her, inkludert cytokin produksjon i lungene av γHV68-infiserte Mavs ^{+ / +} og ^{Mavs-/ -} mus, cytokin sekresjon og genuttrykk nivå av γHV68-infiserte Mavs ^{+ / +} og Mavs ^{- / -} MEFs, og cytokin mRNA nivåer av γHV68-infiserte Mavs ^{- / -} MEFs "rekonstituert" med MAVS. Disse representative eksperimentene utnytte genet knockout mus for å undersøke antiviral cytokin produksjon in vivo og utforske knockout MEFs å dissekere mekanismen av regulert cytokin produksjon ex vivo. Konkret γHV68 infeksjon av Mavs ^{- / -} mus førte til betydelig høyere produksjon av CCL5 in vivo. Mavs ^{- / -} MEFs produsert mer antiviral cytokin enn Mavs ^{+ / +} MEFs under γHV68 infeksjon, som sammenfatter in vivo fenotype. "Rekondisjoneres "ekspresjon av MAVS i mavs ^{- / -} MEFs redusert CCL5 produksjon Sammen er disse resultater viser at MAVS er nødvendig for å undertrykke γHV68 antiviral cytokin produksjon både in vivo og ex vivo..

Figur 1. γHV68 akutt infeksjon indusert høyere cytokin produksjon i lungene til Mavs ^{- / - mus} enn at i Mavs ^{+ / +} mus. Alders-og kjønns matchet Mavs ^{+ / +} og Mavs ^{- / -} mus ble intranasalt smittet med 40 PFU av γHV68 og CCL5 i de infiserte lunger på angitte dager etter smitte ble målt med ELISA. γHV68 infeksjon av Mavs ^{- / -} mus førte til betydelig høyere produksjon av antiviral cytokin CCL5, noe som antydet at MAVS er nødvendig for å undertrykke γHV68 viral cytokinproduksjon. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien (SEM). Den statistisk signifikans: *, p <0,05; **, p <0,02. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2. Ved γHV68 infeksjon, Mavs ^{- / -} MEFs produsert mer antiviral cytokin enn Mavs ^{+ / +} MEFs Mavs ^{+ / +} og Mavs ^{-. / -} MEFs ble smittet med γHV68 og høstet på angitte timer etter infeksjon (HPI), CCL5 i supernatanten ble målt ved ELISA (A) og genekspresjon i MEF-celler ved kvantitativ real-time PCR (B). The resultatene av Mavs ^{- / -} MEFs smittet med γHV68 rekapitulere de av γHV68-infiserte Mavs ^{- / -} mus. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. Den statistisk signifikans:. **, P <0.02, ***, p <0,005 Klikk her for å se større bilde .

Figur 3. "Rekonstituert" uttrykk for MAVS i Mavs ^{- / -} MEFs redusert CCL5 produksjon (A) Mavs ^{-. / -} MEFs ble smittet med kontroll eller MAVS-uttrykke lentivirus og uttrykk for MAVS ble analysert ved immunoblotting. (B) Mavs ^{- / -} MEFs "rekonstituert" med MAVS ble smittet med γHV68. MEFs ble høstet ved den angitte timer etter infeksjon (hpi) og RNA ble analysert ved hjelp av kvantitativ real-time PCR med primere som er spesifikke for CCL5. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. Den statistisk signifikans:. **, P <0,02 Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Viral immune evasion er en av de mest dynamiske og spennende interaksjoner grensesnitt viral krenkelser og vert forsvar ^ni. Verts medfødte immun komponenter er strukturert slik at signaltransduksjon er effektivt initiert og trofast overført. Opptegning av hierarki og regulering av signalanlegg kaskader er en fremragende tema av medfødt immunitet. Her introduserer vi en protokoll for å identifisere de regulatoriske roller en medfødt immun komponent, MAVS, i viral unndragelse av cytokin produksjon. Protokollen omfatter en metode å bestemme cytokin produksjon i virusinfiserte mus og vurdere cytokin genuttrykk og produksjon i MEFs. Genet knockout MEFs og mus tilby verktøy som muliggjør den genetiske og biokjemiske disseksjon av protein funksjon in vivo og ex vivo. Bygget på genmodifiserte mus stammer, hvorav mange er kommersielt tilgjengelig, og antall som øker i akselererende tempo, dette protocol utforsker videre på "rekonstituert" uttrykk for villtype eller mutert protein av interesse ved lentivirus. En mulig begrensning av "rekonstituert" uttrykk for medfødte immun komponenter er uønsket immunsignal utløst av eksogene uttrykk, noe som kan påvirke viral infeksjon og signaltransduksjon derav. Optimalisering for å oppnå lavt nivå av ekspresjon sammenlignes med endogene nivåer kan redusere den bivirkning. I tilfelle en mutant protein bærer målrettede "lesjoner" er brukt, vil det gi oss mulighet til å finne funksjonen til et bestemt domene, post-translasjonell modifikasjon, eller protein-protein interaksjon i immunregulering under virusinfeksjon. Dersom "rekonstituert" celler kan transplanteres inn i knockout mus, kan in vivo-funksjonen av valgte immunologiske komponenter eller målrettet mutant undersøkes.

Sammenlignet med "knock-in" eller transgene uttrykk for muterte proteiner, "reconstituted "ekspresjon av vill-type eller mutert protein av interesse ved lentivirus er mer kostnadseffektiv og tidseffektiv, tillater undersøkelse med forskjellige gevinst-og tap-av-funksjon-mutanter. det kritiske trinn av hele protokoll er at det rekonstituerte protein bør være sammenlignbart med endogene proteinnivå, spesielt når proteinet er et enzym eller transkripsjonsfaktor. Over-ekspresjon av noen proteiner kan føre til avvikende aktivering av signalveien og tvetydige resultater.

Selv om vår protokoll fokuserer primært på musefibroblaster, som er i stor grad på grunn av den iboende regulering av medfødte immun komponenten på γHV68 replikering, kan lignende programmer bli utvidet til andre immun bestanddeler, inkludert makrofag og dendrittiske celler. I tillegg kan disse metodene tilpasses mekanistiske undersøkelser som medfører forskjellige patogener. Søknaden fremstår ¹² og vil trolig ta flere sentrum-iscenesatt roller i fremtiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA