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Engineering

Ottimizzazione delle dimensioni e minimizzando il rumore di stato solido Nanopori

doi: 10.3791/51081 Published: October 31, 2013

Summary

Una metodologia per la preparazione di nanopori a stato solido in soluzione per esperimenti di traslocazione biomolecolari è presentato. Applicando brevi impulsi di campi elettrici elevati, il diametro nanoporo può essere ampliata in modo controllabile con precisione subnanometer e le sue caratteristiche di rumore elettrico significativamente migliorata. Questa procedura viene eseguita in situ utilizzando apparecchiature di laboratorio standard in condizioni sperimentali.

Abstract

Nanopori a stato solido sono emersi come uno strumento versatile per la caratterizzazione di biomolecole singoli come acidi nucleici e proteine ​​1. Tuttavia, la creazione di un nanoporo in una membrana sottile isolante rimane difficile. Metodi di fabbricazione che coinvolgono sistemi a fascio di elettroni focalizzato specializzati in grado di produrre nanopori ben definiti, ma la resa dei nanopori affidabili e bassa rumorosità in membrane disponibili in commercio rimane basso 2,3 e controllo dimensione è banale a 4,5. Qui, l'applicazione di campi elettrici elevati per ottimizzare la dimensione del nanoporo pur garantendo prestazioni ottimali a basso rumore è dimostrata. Questi brevi impulsi di campo elettrico elevato sono utilizzati per produrre un segnale elettrico incontaminato e consentire l'ampliamento di nanopori con precisione subnanometer per esposizione prolungata. Questo metodo viene eseguito in situ in un ambiente acquoso utilizzando apparecchiature di laboratorio standard, migliorando la resa e riproducibilità di sOlid-stato nanopore fabbricazione.

Introduction

Nanopori biologica e allo stato solido forniscono un mezzo di rilevamento analiti biomolecolari a livello di singola molecola 1. Nanopori individuali sono tipicamente incorporati in membrane isolanti sottili, fornendo l'unico canale per corrente ionica per passare tra due serbatoi di liquidi. Utilizzando i principi della scala ingrandita Coulter contatori, esperimenti nanoporo riguardano variazioni di corrente ionica per determinare la lunghezza, dimensioni, carico e conformazione di biomolecole cariche come sono elettroforeticamente guidati attraverso un nanoporo in presenza di un campo elettrico esterno.

Mentre nanopori biologici come α-emolisina offrono in genere una maggiore sensibilità e le proprietà a basso rumore 3, il supporto doppio strato lipidico è fragile e di dimensione fissa, limitando la loro applicabilità. Nanopori a stato solido, d'altra parte, sono fabbricati in sottile (10-50 nm) di nitruro di silicio o ossido di silicio e membrane possono essere di diversa sizes, essere facilmente integrate con tecnologie wafer scala 6,7, e sono più robusti, consentendo una più ampia gamma di condizioni sperimentali. Nonostante questi vantaggi, tecnologie nanoporo a stato solido soffrono di alcuni inconvenienti pratici che limitano la loro utilità per gli studi biomolecolari. Mentre è possibile il controllo di dimensioni nanoporo, è tipicamente costoso e laborioso da realizzare, richiede attrezzature specializzate e personale specializzato. Ad esempio, nanopori forato da fascio focalizzato di litio sono stati recentemente dimostrato di ridurre in specifiche condizioni sperimentali in un microscopio elettronico a scansione (SEM) 5. In altri approcci, nanopori perforati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) possono ampliare o ridurre a seconda delle condizioni di fascio e successiva esposizione a solventi acquosi 8. In questi casi, la gamma di dimensioni nanopori ottenibile è limitata, difficile da controllare e persino inaffidabile come la dimensione del nanoporo può cambiare dopo il trattamento chimico oquando immerso in un particolare ambiente liquido 9.

La corrente ionica attraverso nanopori a stato solido può anche soffrire di rumore, le fonti di cui sono un tema intensamente studiato in nanopore letteratura 2,3,10,11. Mentre i vari metodi sono stati proposti per ridurre il rumore elettrico, il rendimento di affidabili nanopori stabile a bassa rumorosità è in genere basso. La deposizione di residui carboniosi durante la perforazione e l'imaging può avere effetti negativi sulla qualità del segnale elettrico, rendendo spesso una completa bagnatura una sfida e causando la formazione di nanobolle che possono essere difficili da rimuovere 12. Inoltre, intasamento del nanoporo da nuove molecole di rendering degrada la qualità del segnale pori inutilizzabile per ulteriori esperimenti 13,14. Complessivamente, questi effetti riducono notevolmente il rendimento dei dispositivi nanoporo funzionali e aumentano i costi associati con la ricerca nanoporo a stato solido.

L'applicazionezione di una tensione con elettrodi Ag / AgCl per produrre campi elettrici elevati nell'intervallo 0,15-0,3 V / nm presenta una soluzione sorprendentemente semplice per queste sfide. Attraverso l'applicazione ciclica di impulsi di breve tensione, un ambiente pulito, a basso rumore di superficie nanopore ideale per studi di singola molecola viene prodotta. L'esposizione prolungata a campi elettrici elevati avvia la rimozione del materiale della membrana che costituisce la parete del poro, con un conseguente aumento del diametro nanopore. Questa crescita può essere controllata con precisione ruotando la resistenza e la durata dell'impulso. Come tracce correnti degradano nel corso di un esperimento a causa intasamento del nanoporo come molecole assorbiti alla superficie nanoporo, questo processo può essere ripetuto per recuperare dispositivi ostruiti che sarebbe stato altrimenti scartati. Come tale, la resa di nanopori funzionali è ulteriormente incrementata dalla possibilità di utilizzare lo stesso dispositivo più volte. Questo metodo fornisce diversi vantaggi come viene eseguito rapidamente in liquido sotto sperimentalecondizioni, richiede solo apparecchiature di laboratorio standard, possono essere automatizzati con software, e produce funzionali nanopori di alta qualità, con un rendimento di oltre il 95%.

Protocol

1. Nanopore Fabrication e pulizia

Nota: Una volta che un nanoporo esiste in una membrana isolante, può essere montato direttamente nella cella liquido senza ulteriore trattamento o pulizia, come descritto nel passaggio 2. Tuttavia, se è necessario rimuovere le tracce di contaminanti tra esperimenti, chip nanoporo possono essere puliti utilizzando soluzione Piranha 3,15,16 (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) o per esposizione all'ossigeno plasma 2. Come tale, i passaggi 1,2-1,9 nel seguente protocollo sono opzionali se prepulitura dall'esposizione a soluzione Piranha non è necessario.

  1. Degas filtrata deionizzata (DI) ponendo sotto vuoto in un sonicatore per 30 min a 40 ° C.
  2. Preparare la soluzione Piranha in un becher da 10 ml aggiungendo con precauzione 3 ml di acido solforico seguita da 1 ml di perossido di idrogeno. Mescolare accuratamente riflusso nella pipetta. ATTENZIONE: soluzione Piranha è estremamente pericoloso. Si prega di ta ke tutte le precauzioni.
  3. Con una pinzetta antiacide inserire delicatamente il chip membrana nanopore contenente bordo-prima nella soluzione piranha per sommergere completamente il chip ed evitare che galleggia sulla superficie.
  4. Sciacquare abbondantemente pinzette in acqua filtrata.
  5. Porre il bicchiere su un preset piastra riscaldante a 90 ° C e lasciarla pulita per almeno 30 minuti.
  6. Rimuovere con attenzione la soluzione piranha dal bicchiere con una pipetta di vetro pulito e gettare in abbondante acqua.
  7. Usando una pipetta di vetro pulito aggiungere 5 ml di acqua deionizzata degasata dal punto 1.1 nel bicchiere per sciacquare. Rimuovere l'acqua e ripetere almeno 5x.
  8. Rimuovere con attenzione il chip nanoporo dal bicchiere con pinzette pulite sharp-punta. Maneggiare con cura estrema, come la membrana nanoporo è molto fragile.
  9. Essiccare il chip applicando delicatamente aspirazione al suo bordo utilizzando un aspiratore. Conservare il chip in una scatola di Petri pulita fino al momento dell'uso.
ve_title "> 2. Montaggio del nanoporo

  1. Pulire la cella nanoporo Teflon (Figura 1) mettendo in soluzione al 20% di acido nitrico e bollente per 10 minuti. ATTENZIONE: utilizzare tutte le necessarie attrezzature di protezione individuale e maneggiare gli acidi con cura.
  2. Rimuovere con cautela la cella da acido nitrico e posto in acqua DI bollente per 10 min.
  3. Bollire la cella in acqua deionizzata per altri 10 min per assicurare la rimozione completa di acido nitrico. Togliere il bicchiere dalla piastra calda e lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere la cella dal bicchiere e asciugare con aria filtrata o N 2. Conservare la cella in una scatola di Petri pulita.
  5. Degas filtrato soluzione KCl (tamponata con HEPES a pH 8) ponendo sotto vuoto in un sonicatore per 30 min a 40 ° C.
  6. Pulire le due guarnizioni in elastomero di silicone per ogni chip nanoporo da sonicating in etanolo per almeno 10 min.
  7. Posizionare il chip nanoporo su una superficie pulita guarnizione in elastomero essere careful per allineare la finestra membrana con l'apertura guarnizione. Posizionare e allineare una seconda guarnizione in cima al chip.
  8. Posizionare il chip e guarnizioni in ingresso serbatoio di una metà della cella nanoporo pulita. Montare la cella avvitando l'altra metà in posto. Una vista esplosa dei componenti cellulari nanoporo è mostrato in Figura 1.
  9. Bagnare il chip nanoporo pipettando etanolo nei serbatoi delle celle e l'immissione in una camera a vuoto fino a poche bolle sono visti per uscire dalle bocche di porto.
  10. Rimuovere l'etanolo irrigando i serbatoi con almeno 3 ml degassificati soluzione KCl filtrata. Fate attenzione a rimuovere troppo pieno con un aspiratore.

3. Nanopore Caratterizzazione

  1. Posizionare la cella nanopore nel setup sperimentale schermati elettricamente e posizionare gli elettrodi Ag / AgCl in ciascun serbatoio. Questa configurazione è simile a quella mostrata in Figura 2, ad eccezione della alimentazione esterna e amplificatore di corrente che sonosostituita con una retroazione resistiva amplificatore a basso rumore.
  2. Utilizzando l'amplificatore a basso rumore in modalità voltage-clamp, applicare le potenzialità spazzare da -200 mV a +200 mV e registrare le caratteristiche IV.
  3. Adattare la curva IV avere nanoporo conduttanza, che può essere utilizzato per calcolare il diametro in soluzione 17. Se il diametro calcolato è molto più piccolo del previsto da immagini TEM, il poro è probabile non completamente bagnate e / o contiene detriti o contaminazioni.
  4. Applicare un potenziale mV 200 di tutti i nanopore e registrare la corrente ionica per 30 sec.
  5. Eseguire una densità spettrale di potenza (PSD) analisi della corrente ionica e integrare quantificare le caratteristiche di rumore elettrico del nanoporo. Se il rumore è superiore a 15 pA RMS a 5 kHz di banda, allora il poro è probabile non completamente bagnate e / o contiene contaminazione e non può essere utilizzato in modo affidabile in esperimento.

4. Condizionata Nanopori Utilizzo alta Fie elettricolds

Nota: Se la curva IV generato asimmetria esposte o meno del previsto conduttanza, o la traccia corrente mostrato livelli di instabilità e di rumore alle basse frequenze, è necessario condizionare nanoporo con campi elettrici elevati per rimuovere la contaminazione sulla pori superficie e / o bagnare il poro. Mentre questo metodo non influisce il rumore ad alta frequenza causata dalla capacità di membrana o qualsiasi capacità parassita accoppiata all'ingresso dell'amplificatore corrente utilizzate per le misurazioni, il rumore a bassa frequenza (detto anche rumore 1 / f) 18 può essere notevolmente ridotto. Uno schema della configurazione utilizzata per eseguire questo condizionamento è mostrato in Figura 2.

  1. Scollegare gli elettrodi dall'amplificatore patch-clamp.
  2. Collegare uno degli elettrodi a un alimentatore controllato da computer in grado di generare> 6 V (> 0,2 V / nm intensità di campo elettrico per le membrane di spessore 30 nm utilizzati qui) e l'altra di una notificaESTERNA amplificatore di corrente che può essere monitorato in tempo reale.

    Nota: l'applicazione di campi elettrici elevati può essere utilizzata per il condizionamento nanopori in vari materiali di membrana e spessori. Mentre entrambe le membrane di 30 nm e 10 nm sono discussi qui, le tensioni descritte si riferiscono a quelli utilizzati per le membrane di spessore di 30 nm, se non diversamente indicato.

  3. Applicare una differenza di potenziale di 400 mV (tensione di misura) di tutti i nanoporo per almeno 5 sec.
  4. Calcolare il valore medio di corrente dalla finale 1 sec di dati per determinare la conduttanza del nanoporo. Calcolare il diametro del nanoporo basato su questa conduttanza, che dovrebbe essere fatto automaticamente usando il software e il modello conduttanza nanoporo di scelta in base alla geometria più probabile. Esso dovrebbe corrispondere al diametro misurato dalla curva IV.
  5. Applicare un impulso di 200 msec di 6 V (tensione di bagnatura) di tutti i nanoporo per produrre un campo elettrico di 0,2 V / nm seguito da un periodo di misurazione 5 seca 400 mV. Anche in questo caso, calcolare il diametro del nanoporo utilizzando la finale 1 sec di dati e confrontare con il valore previsto dalle misure TEM per garantire che il nanoporo è completamente bagnato. Se necessario ripetere più volte.
  6. Se necessario, ripetere l'applicazione di impulsi di campo elettrico elevato con l'aumentare della tensione finché il segnale di corrente durante il periodo di misurazione è stabile e mostra la conduttanza previsto. Si raccomanda di non superare i 10 V (cioè> 0,3 V / nm), in quanto questo può significativamente aumentare o danneggiare rapidamente il nanoporo.

5. Ingrandimento Nanopori Utilizzo di campi elettrici

Nota: Il diametro del nanoporo è cruciale nel determinare la sua funzionalità per una particolare applicazione di rilevamento biomolecolare. A tal fine, un nanoporo creata usando un TEM può essere allargata alla dimensione desiderata applicando campi elettrici elevati finché il diametro appropriato è realizzato con la stessa installazione utilizzato per pulire e bagnare lananopore (Figura 2).

  1. Utilizzando la stessa configurazione elettronica come nella parte 4, applicare una polarizzazione 200-500 mV tutti i pori per ottenere una misurazione del diametro. Mentre meno preciso sagomata una curva IV, una misura unica può essere utilizzato per stimare approssimativamente rapidamente la dimensione nanoporo.
  2. Applicare un impulso di 2 secondi di 8 V attraverso il nanoporo seguita da un periodo di misurazione di almeno 5 sec a 400 mV. Calcolo del nuovo diametro mostrerà tipicamente un aumento molto piccolo di dimensioni nanopore (<0.1 nm).
  3. Ripetere questo processo ciclicamente, alternando tra le tensioni di ampliamento e di misura per ottenere in situ e misurazioni in tempo reale di diametro crescente nanoporo.
  4. Se il tasso di crescita più rapida è auspicabile aumentare l'entità della tensione applicata in modo incrementale fino a 10 V. Crescita tipicamente accelerare il poro allarga con il tasso di aumento della conduttanza vanno da 0,03 nS / s ec & #160, a 10 nS / sec, a seconda delle dimensioni del nanoporo, la forza del campo elettrico e proprietà delle soluzioni elettrolitiche.
  5. Quando viene raggiunto il diametro desiderato, interrompere l'applicazione di campi elettrici elevati. Questo può essere fatto automaticamente usando il programma per computer.
  6. Ricollegare l'amplificatore patch-clamp agli elettrodi.
  7. Acquisire nuovi IV e dati di traccia corrente a 200 mV per confermare il diametro del nanoporo e verificare segnali di corrente a bassa rumorosità, come nei passaggi 3,2-3,5 sopra. Se necessario, ripetere condizionata e il protocollo di allargamento (passi 4,1-5,5).

6. Translocation DNA

  1. Prima di aggiungere un campione biomolecolare, eseguire un esperimento di controllo per garantire che non vi è alcuna contaminazione nel serbatoio. Acquisire una traccia corrente con un potenziale applicato di 150-300 mV in assenza di qualsiasi campione per verificare che non blocchi correnti vengono rilevate dopo 2 min.
  2. Aggiungi λ DNA (48,5 kbp a doppio filamento) alla <em> serbatoio cis per una concentrazione finale di 0,5-2 ng / ml. Reflusso delicatamente pipetta per almeno 10 secondi per assicurare una distribuzione omogenea del campione durante il serbatoio.
  3. Per un nanoporo spessore di 30 nm, applicare un potenziale di polarizzazione di 150-300 mV al serbatoio trans e misurare la corrente ionica che passa attraverso il nanoporo. Per eventi di traslocazione molto brevi, è opportuno campionare ad una frequenza elevata (250 kHz o superiore) con una frequenza relativamente alta filtraggio passa-basso (100 kHz).
  4. Monitorare la corrente ionica utilizzando il software per rilevare blocchi correnti transitori come molecole di traslocare attraverso il nanoporo. Le tracce correnti ioniche di traslocazione molecolare possono essere analizzati per determinare la profondità blocco, la durata e la frequenza di dedurre informazioni sul campione di interesse. Al contrario, se le informazioni sulle molecole translocating è noto, questi dati possono essere utilizzati per studiare le proprietà del nanoporo stesso.

Representative Results

I nanopori utilizzati in questo studio sono stati perforati in 10-nm finestre membrana di nitruro di silicio di spessore di 30 nm o. Mentre il protocollo descritto può essere applicato a nanopori a stato solido di materiale vario fabbricate utilizzando qualsiasi metodo, sono comunemente forati mediante TEM utilizzando protocolli precedentemente stabiliti 11,14. Nanopori forati mediante TEM sono tipicamente tra 4-8 nm di diametro (Figura 2). Mentre entrambe le membrane di spessore di 30 nm e 10 nm possono essere montati e condizionati utilizzando il protocollo di cui sopra, pregiudizi tensione descritti si riferiscono a quelli richiesti per le membrane di spessore di 30 nm, se non diversamente indicato. Per membrane di diverse dimensioni, la tensione applicata deve essere regolato per generare un campo elettrico nell'intervallo 0,15-0,3 V / nm all'interno del nanoporo.

Figura 3a mostra due tipiche tracce conduttanza di un nanoporo 10 nm in una membrana di spessore 30 nm prima e dopo trattamento con campi elettrici elevati. Dopo il montaggio di un nuovo driempì nanopore, la probabilità di ottenere un segnale di corrente ionica instabile e rumoroso, mostrano un alto grado di oscillazione a bassa frequenza, è generalmente elevato. Il nanopore mostrato in Figura 3a evidenzia questo comportamento. La sua conduttanza è notevolmente inferiore a quella prevista per un nanoporo delle sue dimensioni, molto probabilmente a causa di bagnatura incompleta. In seguito all'applicazione di elevati campi elettrici di 0,27 V / nm in grandezza prodotta da 8 V impulsi (90 impulsi di durata 2 sec), il nanoporo diventa completamente bagnato ed è successivamente ampliato a 21 nm di diametro. A questo punto, il poro presenta una conduttanza stabile con proprietà basso rumore. L'analisi quantitativa del rumore in nanopori simili è mostrato come il potere spettrali grafici della densità in Figura 3b. L'ampiezza del rumore a bassa frequenza di pori unwet e / o intasati è molto elevato (> 20 pA RMS), rendendole inutilizzabili in esperimento. Su condizionata con alti campi elettrici, potenza di rumore a bassa frequenza (<10 kHz) è diminished fino a 3 ordini di grandezza e pronti per esperimenti a basso rumore.

La Figura 4a mostra una misura tipica corrente come potenziale applicato è a impulsi tra campi elettrici elevati per ingrandire e periodi di misurazione bassi di campo elettrico. Dopo ogni impulso successivo, la corrente ionica risultante attraverso il nanoporo alla tensione di misura (cioè la conduttanza nanoporo) aumenta di una quantità finita. Questo dimostra che il nanoporo vengono aumentate le dimensioni, come il diametro d può essere dedotta dalla sua conduttanza G in una soluzione di conducibilità σ, approssimando nanoporo come avente geometria cilindrica di lunghezza efficace l eff. Mentre esistono vari altri modelli per il relativo nanopore conduttanza alla sua geometria 17,19-21, la seguente relazione, che incorpora un termine geometrico e un termine resistenza di accesso, è stato dimostrato valido per nanopori TEM-forati in alto saleconcentrazioni, oltre ad un'ampia gamma di diametri di interesse per dsDNA traslocazione 17,22.

Una volta raggiunto il diametro desiderato, il processo viene interrotto automaticamente dal software. Il diametro nanopore risultante può essere confermata usando misurazioni precise IV, come mostrato in Figura 4b.

È importante notare che nanopori trattati usando campi elettrici elevati sono completamente funzionali. Ciò è convalidato dal rilevamento di DNA λ traslocazione, come mostrato nelle tracce conduttanza presentati nella figura 5a. In questa figura, dsDNA è guidato attraverso due nanopori che sono stati ingranditi di 11 nm e 32 nm con il metodo descritto. In ogni caso, la conduttanza basale è estremamente stabile e blocchi chiari sono osservate come molecole di dsDNA traslocano attraverso il nanoporo, visualizzando elevato rapporto segnale-Rumore singola molecola eventi traslocazione, rispetto a pori non trattati che presentano elevata rumorosità. Come mostrato nella inserti di Figura 5a, livelli multipli di bloccaggio discreti sono osservati come singole molecole piegate traslocare, come previsto per nanopori di queste dimensioni. Istogrammi della conduttanza nanoporo durante eventi di traslocazione attraverso ogni poro sono mostrati in Figura 5b. Le proprietà a basso rumore dei nanopori rivelano distinte, picchi facilmente risolvibili corrispondenti al basale (senza DNA), singolo (un filamento di DNA - spiegato) e stati doppi bloccaggio (due filamenti di DNA - piegate). Di nota è il fatto che la variazione di conduttanza corrispondente ad una singola molecola di dsDNA occupando il poro è diversa per i grandi e piccoli nanopori. Ciò fornisce una prova indiretta che l'applicazione di campi elettrici elevati è infatti allargando nanopori esistenti, come la stessa ampiezza blocco sarebbe osservata se altri pori o fessure sono stati creati in tegli membrana durante il processo 17.

Analogamente, la figura 6 illustra l'efficacia di campi elettrici elevati per ingrandimento nanopori fabbricati in membrane di diverso spessore. Qui, un nanoporo creato in un SiNx membrana 10-nm è inizialmente parzialmente unwet, visualizzando instabile e relativamente piccola conduttanza. Quando vi si applica alternata ± 3 V (± 0,3 V / nm) impulsi di durata 4 sec (30 in totale), nanoporo si bagna e presenta caratteristiche ideali IV per un poro 3 nm. La metodologia è stata poi ripetuta per 400 impulsi successivi e il nanoporo è stata allargata a 8 nm. Questo allargamento, eseguita a campi elettrici comparabili ma polarizzazione tensione applicata inferiore a quello di nanopori fabbricati in membrane 30-nm, mostra che il processo è il campo elettrico principalmente guidato. Poiché il blocco corrente prodotta da traslocazione attraverso una membrana più sottile è più grande di quella prodotta in più spessi pori, nanopori in membrane sottilitrattati in questo modo possono essere utilizzati per studiare molecole più brevi come proteine ​​con maggiore sensibilità.

Figura 1
Figura 1. Gruppo della cella nanoporo. Una membrana di nitruro di silicio contenente un nanoporo è posto tra guarnizioni in elastomero di silicone, che sono a loro volta compresso da due teflon mezze celle contenenti serbatoi elettrolita. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2
Figura 2. Nanopore condizionata e ampliando la configurazione. Un nanopore forato in una membrana di nitruro di silicio di spessore 30 nm (a sinistra) collega due serbatoi di elettroliti. Lacomputer viene utilizzato per controllare sia un amplificatore patch-clamp o alimentazione esterna (scheda DAQ) che applica una polarizzazione potenziale attraverso il nanoporo tramite elettrodi Ag / AgCl immersi nei serbatoi di elettrolita. L'amplificatore di corrente trasmette la corrente ionica misurata da monitorare in tempo reale utilizzando il software del computer. Questa cifra è stata modificata da [11]. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3
Figura 3. Tracce correnti prima e dopo l'applicazione di campi elettrici elevati. (A) Dopo il montaggio, e anche dopo pulizia con soluzione Piranha, la conduttanza del nanoporo è instabile e meno del previsto per un poro cilindrico 10-nm (blu). Dopo l'applicazione di 2 sec impulsi di 8 V, lananoporo è completamente bagnata e allargata, esibendo una conduttanza stabile e può essere utilizzato per esperimenti di rilevamento biomolecolari (verde). (B) terreni densità spettrale di potenza di un nanoporo non completamente bagnato e intasato (blu e arancione, rispettivamente). All'applicazione di 200 impulsi msec di 8 V, nanopori sono stati bagnati e detriti rimossi (verde e rosso, rispettivamente). Questa cifra è stata modificata da [11]. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 4
Figura 4. Nanopore allargando utilizzando campi elettrici elevati. (A) alternanza tra allargamento e la misurazione potenziali errori (rossi) rivela che la corrente ionica attraverso il nanoporo (blu) aumenta a passi finiti. La condotta risultantemisurazione zione può essere utilizzata per dedurre diametro nanoporo. Una volta che il diametro desiderato è stato raggiunto, il processo viene interrotto. (B) misurazioni precise IV di conduttanza confermano che le dimensioni nanopori sono aumentate. Tali terreni forniscono una stima migliore della dimensione dei pori di valori correnti single-point in quanto possono essere in forma e il loro comportamento simmetrico e resistivo può essere confermata. Questa cifra è stata modificata da [11]. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 5
Figura 5. Traslocazione DNA attraverso nanopori condizionata. (A) L'aggiunta di dsDNA (48,5 kbp) ad un lato del nanoporo ad una polarizzazione di 150 mV produce blocchi transitori delle tracce conduttanza di 11 nm (blu) e 32-nm pores (rosso). (B) istogrammi della conduttanza di ciascuno dei nanopori mostrano picchi discreti corrispondenti al basale, singole e doppie eventi traslocazione. Questa cifra è stata modificata da [11]. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 6
Figura 6. L'allargamento del nanopori in 10 membrane nm. Un nanopore in una membrana 10 nm originariamente mostre molto poco conduttanza e le caratteristiche IV asimmetrici (arancione). In seguito all'applicazione di 30 impulsi di alternanza tra ± 3 V (durata 4 sec), la bagna nanoporo e presenta proprietà ideali IV con una conduttanza consistente con quello atteso per un poro 3 nm (blu). Un ulteriore 400 impulsi di ± 3 V allarga il nanoporo ad un diametro di 8 nm(Verde). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

Controllo delle dimensioni nanoporo è di fondamentale importanza in applicazioni di rilevamento biomolecolari. Diametri nanoporo devono essere dell'ordine delle dimensioni delle molecole viene esplorata, ma devono essere sufficientemente ampia da accogliere il campione ma abbastanza piccolo per realizzare rumore segnale-ottimale. Mentre il controllo della dimensione utilizzando il metodo presentato di applicare campi elettrici elevati è unidirezionale in quanto diametri nanoporo sono aumentati solo durante tutto il processo, nanopores con diametri compresi tra 3-100 nm possono essere stile, con una precisione subnanometer. Come pori 3-4 nm possono essere facilmente fabbricati usando un TEM 23, questo permette la realizzazione affidabile di nanopori a stato solido per un'ampia gamma di applicazioni di tastatura struttura ssDNA all'interazione di ingombranti complessi proteina-ligando. Mentre la crescita nanopore di sopra di 100 nm può essere molto veloce e meno preciso, allargando le condizioni più moderate possono essere impiegati per ottenere un migliore controllo sul processo. Come sUCH, il passo più importante per ottenere il controllo della dimensione effettiva è la scelta di resistenza e durata dell'impulso per bilanciare efficienza di ingrandimento e il livello di precisione richiesto per ottenere un diametro dei pori desiderato. Questo è ulteriormente evidenziato dall'allargamento dei nanopori sottili (spessore 10 nm), dove l'ampliamento è osservato un bias inferiore ma comparabile intensità di campo elettrico. A seconda della dimensione finale, è generalmente possibile ingrandire un nanoporo per diametri inferiori a 100 nm in pochi minuti.

Allo stesso modo, le grandi fluttuazioni di corrente a bassa frequenza precludono studi di singola molecola in quanto è quasi impossibile distinguere i segnali traslocazione dal rumore di fondo. Incompleto bagnando 24, la presenza di residui carboniosi rimanenti dopo la fabbricazione iniziale 25 e l'adsorbimento di detriti sulla parete nanoporo 13 può degradare la qualità del segnale, che richiede ulteriore pulizia con trattamenti chimici aggressivi che spesso inefficacious. È interessante notare, è comune per i protocolli nanopori a stato solido per sottolineare l'importanza della pulizia del nanoporo in soluzione piranha o con plasma di ossigeno prima di montare per aiutare bagnatura o rimuovere eventuali contaminazioni lasciati dai processi di perforazione, di imaging e movimentazione. Anche con questo trattamento, però, nanopores spesso non lo fanno bagnato o continuano a mostrare al rumore, e la soluzione suggerita per i tentativi falliti è quello di eseguire la pulizia supplementare che può essere molto tempo 14. Con l'applicazione di campi elettrici elevati, questi protocolli lunghi potrebbero non essere necessari a seconda dell'applicazione. Si è constatato che la maggior parte dei dispositivi potrebbero essere riparati in situ utilizzando il metodo qui descritto, riducendo di conseguenza il tempo di preparazione e la necessità di trattare con sostanze chimiche aggressive. I passi più importanti nella mitigazione del rumore elettrico è un semplice aumento della tensione e / o la durata dell'impulso di bagnare completamente i pori e rimuovere i detriti vagamente legato.Nanopori trattati in questo modo possono essere utilizzati in modo affidabile in esperimenti di traslocazione di biomolecole, quali il passaggio di DNA e proteine. Se queste molecole aderiscono alle pareti dei pori che porta ad un segnale elettrico intasato e rumoroso, impulsi alti campi elettrici possono essere riapplicati per rimuovere l'ostacolo e recuperare le proprietà a basso rumore per ulteriori sperimentazioni, senza smontare del chip nanoporo dalla cella fluidica.

L'applicazione di campi elettrici elevati utilizzando la configurazione descritta è limitata dalla necessità di un alimentatore esterno che si possono applicare fino a 10 V e amplificatore di corrente, che non hanno la sensibilità e proprietà basso rumore a banda larga (> 1 kHz) per rilevamento singola molecola. Mentre gli esperimenti tipici biomolecolari si basano su un amplificatore di corrente a basso rumore che è limitato a ± 1 V, è semplice progettare un unico sistema in grado di realizzare sia ad alto campo elettrico e di condizionamento misura di corrente sensibile con un adjuguadagno stabile. Nonostante questa limitazione, il passaggio da una configurazione all'altra è rapido e semplice. In confronto con le tecniche esistenti per controllare dimensioni nanopore come l'uso di SEM 5, ossidazione termica e membrana rimodellare 8, campi elettrici elevati offrono una metodologia più veloce, più preciso e meno costoso che può essere eseguita sul banco di laboratorio utilizzando apparecchiatura standard e fornire una gamma più ampia di formati nanoporo. La capacità di ridurre rapidamente e riproducibile rumore a bassa frequenza rende anche la realizzazione iniziale più affidabile e prolunga la durata di nanopori a stato solido, come i pori utilizzati in precedenza può essere ringiovanito per ulteriori esperimenti. Complessivamente, oltre il 95% dei nanopori di spessore variabile condizionata con campi elettrici ad alta espone molto poco caratteristico rumore a bassa frequenza, rendendoli adatti per il rilevamento biomolecole. Fabrication è quindi più semplice e affidabile, facendo esperimenti nanopori a stato solido più accessiblé ai ricercatori e potenzialmente permettendo un percorso verso la commercializzazione di tecnologie nanoporo attraverso processi di fabbricazione più robusti.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Noi riconosciamo il sostegno da parte delle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada, la Fondazione canadese per l'innovazione, e il Fondo di ricerca Ontario. Ringraziamo Y. Liu per gli aiuti in nanopore fabbricazione e la caratterizzazione, L. Andrzejewski per le discussioni importanti e il supporto tecnico, e A. Marziali aiuto con il software nanopore e il design della strumentazione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM-2100F TEM JEOL Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card National Instruments PCI-6351 Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software National Instruments Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier Keithley Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005X Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005Z Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings Marian Chicago HT6135 Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes In Vivo Metric E255
Nitric acid Fisher Scientific 52004P Used for cleaning cells - handle with caution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H323 Used for piranha solution - handle with caution
Sulfuric acid Fisher Scientific A300 Used for piranha solution - handle with caution
Potassium chloride Fisher Scientific P335
HEPES Fisher Scientific BP310 Buffering KCl solution
Primary Faraday cage Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate VWR Heating piranha solution

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References

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Ottimizzazione delle dimensioni e minimizzando il rumore di stato solido Nanopori
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Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).More

Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).

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