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Medicine

चिकित्सकीय प्रासंगिक पशु मॉडल और 3 डी इम्यूनोकेमिस्ट्री में उपयोग के लिए सर्जिकल नमूनों से उच्च ग्रेड ग्लियोमा सेल संस्कृति का अनुकूलन

Published: January 7, 2014 doi: 10.3791/51088
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurosurgery, Henry Ford Hospital

Summary

कैंसर स्टेम सेल फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए सीरम मुक्त न्यूरोस्फीयर माध्यम में वियोजन उच्च ग्रेड ग्लियोमा सर्जिकल नमूनों के प्रचार के लिए प्रोटोकॉल। उन नमूनों के लिए जो न्यूरोस्फीयर के रूप में विकसित होने में विफल रहते हैं, एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल का सुझाव दिया जाता है। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए 3डी न्यूरोस्फीयर आर्किटेक्चर को बनाए रखने के लिए पैराफिन एम्बेडिंग तकनीक का वर्णन किया गया है।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा, एस्ट्रोसाइटोमा का सबसे आम और आक्रामक रूप, चिकित्सा के लिए रिफ्रैक्टरी हैं, और आणविक रूप से विषम हैं। कोशिका संस्कृतियों कि माता पिता के ट्यूमर के जीनोमिक प्रोफ़ाइल की रक्षा करने की क्षमता, रोगी विशिष्ट इन विट्रो में उपयोग के लिए और वीवो मॉडल में, प्रत्येक ट्यूमर की आणविक विशेषताओं के अनुरूप ग्लियोब्लास्टोमा के लिए नए उपचार के पूर्व नैदानिक विकास में क्रांतिकारी बदलाव करने की क्षमता है ।

ताजा उच्च ग्रेड एस्ट्रोसाइटोमा ट्यूमर एकल कोशिकाओं में अलग के साथ शुरू, हम तंत्रिका स्टेम सेल फेनोटाइप पेश कोशिकाओं के लिए एक संवर्धन विधि के रूप में न्यूरोस्फीयर परख का उपयोग करते हैं, जिसमें तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति, विट्रो मेंदीर्घकालिक आत्म-नवीकरण और ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्रैफ्ट ट्यूमर बनाने की क्षमता शामिल है। इस विधि को पहले प्रस्तावित किया गया है, और अब कई जांचकर्ताओं द्वारा उपयोग में है। 125 ग्लियोब्लास्टोमा नमूनों को अलग करने और बनाने के हमारे अनुभव के आधार पर, हम यहां मौजूद विस्तृत प्रोटोकॉल पर पहुंचे, जो उच्च ग्रेड एस्ट्रोसाइटोमा के नियमित न्यूरोस्फीयर संस्कृति और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए ट्यूमरजेनिक कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर विस्तार के लिए उपयुक्त है। हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सफल दीर्घकालिक संस्कृतियों की दक्षता पर रिपोर्ट करते हैं और अलग-अलग ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को बनाने के लिए किफायती विकल्प सुझाते हैं जो न्यूरोस्फीयर के रूप में विकसित होने में विफल रहते हैं। हम इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए न्यूरोस्फीयर 3 डी आर्किटेक्चर के संरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं। सीएससी में समृद्ध सेल संस्कृतियां, जो आणविक हस्ताक्षर और जीबीएमएस की विषमता को संरक्षित करने वाले ऑर्थोटोपिक ज़ेनोबेड़ा मॉडल पैदा करने में सक्षम हैं, जीबीएमएस के जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए और संभावित उपचारों के पूर्व नैदानिक परीक्षण के बेहतर डिजाइन के लिए तेजी से लोकप्रिय हो रही हैं।

Introduction

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), एक डब्ल्यूएचओ ग्रेड चतुर्थ एस्ट्रोसाइटोमा, सबसे प्रचलित और आक्रामक प्राथमिक ब्रेन ट्यूमर है । विविध विकासात्मक फेनोटाइप जीबीएम ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा अपनाए जाते हैं, जिनमें "कैंसर स्टेम सेल" (सीएससी) विशेषताओं का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाएं शामिल हैं, जैसे तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) मार्कर की अभिव्यक्ति, दीर्घकालिक आत्म-नवीकरण, और अधिक विभेदित कोशिकाओं को एस्ट्रोसाइटिक मार्कर व्यक्त करने और ट्यूमर1-3के थोक बनाने की क्षमता। हालांकि सीएससी आणविक पहचान और नैदानिक प्रभावों के बारे में स्पष्टीकरण अभी भी आवश्यक है, वर्तमान कार्य का ध्यान सीएससी की परिचालन परिभाषा पर है: दीर्घकालिक स्व-नवीकरण इन विट्रो और इम्यूनोकोम वादा किए गए कृंतक में ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण पर मूल ट्यूमर को अलग और पुन: पेश करने की क्षमता।

ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को पारंपरिक माध्यम में दशकों से सुसंस्कृत किया गया है जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और कई उच्च मार्ग वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध सीरम सुसंस्कृत जीबीएम सेल लाइनें इम्यूनोकॉम् वादा किए गए कृंतक में ट्यूमरजेनिक हैं, लेकिन मूल ट्यूमर4से काफी जीनोमिक और आणविक विचलन है, जो उनके उपयोग को चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मॉडल के रूप में सीमित करता है। हाल ही में, जीईएफ और बीएमजीएफ के प्रति उत्तरदायी स्टेम/प्रोजेनिटर फेनोटाइप वाली कोशिकाओं की पहचान जीबीएमएस2में की गई थी । इसके बाद, एक सीरम-मुक्त माध्यम3में अलग-अलग जीबीएम ट्यूमर के नमूनों को सुसंस्कृत किया गया था, जो मूल रूप से वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क5से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के चयन और विस्तार के लिए तैयार किया गया था। ये संस्कृति की स्थिति अधिकांश गैर-नीरस और अधिक विभेदित ट्यूमर सेल आबादी के विकास में बाधा डालती है, जबकि फ्लोटिंग मल्टीसेलुलर स्फेरॉइड, या न्यूरोस्फेर3के रूप में स्टेम और प्रोजेनिटर कोशिकाओं के विकास के पक्ष में, वयस्क स्तनधारी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के व्यवहार की नकल करतेहुए 5। प्राथमिक जीबीएम कोशिकाओं की तुलना में व्यापक साथ-साथ विकास कारकों (एनएमजीएफ) के साथ पूरक या 10% एफबीएस के साथ पूरक पारंपरिक विकास माध्यम में, पता चला कि जीबीएम न्यूरोस्फेर्स ट्यूमरजेनिक थे, मल्टीलाइनेज भेदभाव क्षमता प्रस्तुत करते थे, और मूल ट्यूमर के जीनोटाइप को संरक्षित करते थे, 10% एफबीएस संस्कृतियों के विपरीत जो कम मार्ग पर ट्यूमरजेनिक नहीं थे और देर से मार्ग4पर मूल ट्यूमर से काफी हट गए थे।

ख्यात सीएससी मार्कर सीडी 133 की अभिव्यक्ति के आधार पर सेल छंटाई द्वारा अलग GBM ट्यूमर से सीएससी के अलगाव भी6,7प्रस्तावित किया गया है, लेकिन आगे काम संकेत दिया है कि सीएससी फेनोटाइप निश्चित रूप से इस तरह के मार्कर8-10की अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ नहीं है, इस रणनीति के लिए प्रारंभिक उत्साह कम है, जबकि नए मार्कर अभी भी10परीक्षण किया जा रहा है । सीएससी को परिभाषित करने वाले मार्कर के एक मान्य सेट की तारीख तक अनुपलब्धता, पूर्व नैदानिक अध्ययनों के लिए इन कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर प्रवर्धन के लक्ष्य के साथ, नियमित सीएससी-समृद्ध संस्कृतियों के लिए अव्यावहारिक कोशिका छंटाई का उपयोग प्रदान करता है। एनएमजीएफ में न्यूरोस्फीयर के रूप में विकसित होने की क्षमता द्वारा चयनित जीबीएम कोशिकाएं निरपवाद रूप से तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर व्यक्त करती हैं। हमने देखा है कि Sox2 और nestin सर्वव्यापी रूप से न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों में व्यक्त किए जाते हैं, जबकि CD133 प्रोटीन जीबीएम न्यूरोस्फीयर (अप्रकाशित डेटा और संदर्भ11)के सबसेट में मौजूद है।

कई प्रयोगशालाएं 3,4,11-14के विकास कारकों के साथ पूरक सीरम-मुक्त माध्यम में एंजाइमेटिक वियोजन और संस्कृति के समान सामान्य दृष्टिकोण का उपयोग करके ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर से न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों का पीछा कर रही हैं, जबकि अन्य सहयोगियों ने सफलता के बिना जीबीएमनमूनोंसे दीर्घकालिक न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों को विकसित करने के प्रयासों की सूचना दी है। यहां प्रस्तुत उच्च ग्रेड ग्लियोमास की एंजाइमेटिक वियोजन और न्यूरोस्फीयर संस्कृति के लिए सामान्य विधि उपरोक्त प्रकाशनों में उल्लिखित की गई है। हमने 100 जीबीएम नमूनों पर अलग और खेती के हमारे अनुभव के आधार पर प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल लागू करने वाले ताजा जीबीएम नमूनों से दीर्घकालिक न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों को प्राप्त करने की दक्षता 40% से अधिक है, जो दक्षता डेटा3,15दिखाने वाली कुछ रिपोर्टों के समान है, जिससे वैकल्पिक प्रोटोकॉल जैसे सीईएफ और बीएफजीएफ की उपस्थिति में सीरम-मुक्त माध्यम में लगातार या आंतरायिक रूप से ईसीएम प्रोटीन16 17के साथ लेपित सतहों पर मोनोलेयर जैसे वैकल्पिक प्रोटोकॉल की खोज की जा रही है। न्यूरोस्फीयर संस्कृतियां अभी भी जीबीएम ट्यूमर आणविक विशेषताओं और ट्यूमरजनित क्षमता3, 4, 11-14को संरक्षित करने के लिए सबसे मान्य और तेजी से लोकप्रिय दृष्टिकोण हैं, इस प्रकार हमारा दृष्टिकोण पहले न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों का प्रयास करना है, जीबीएम कोशिकाओं को बनाने के लिए वैकल्पिक तरीकों का समान रूप से परीक्षण करते हुए जो दीर्घकालिक स्व-नवीनीकरण न्यूरोस्फीयर(चित्रा 1)बनाने में विफल रहते हैं, ताकि पशु मॉडलों में उपयोग किए जा सकते हैं। यहां हम जीबीएम से न्यूरोस्फीयर को बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। उन कोशिकाओं के लिए जो न्यूरोस्फीयर बनाने में विफल रहते हैं, हम विकास माध्यम में एक सरल संशोधन दिखाते हैं, क्योंकि गैर-न्यूरोस्फीष से ट्यूमरजन्य कोशिकाओं को जीबीएमएस बनाने का पहला प्रयास है, जिसमें आशाजनक परिणाम हैं और अभी भी व्यापक सत्यापन के दौर से गुजर रहे हैं।

Protocol

1. न्यूरोस्फीयर संस्कृति के लिए ताजा सर्जिकल ग्लियोब्लास्टोमा नमूने से एकल सेल निलंबन

  1. रोगियों से लिखित सहमति के साथ और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार, उच्च ग्रेड ग्लियोमा की रिसेक्शन सर्जरी के तुरंत बाद सेल संस्कृति के लिए ट्यूमर के नमूने एकत्र करें।
  2. हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा ट्यूमर के नमूने के निदान की पुष्टि करें। सर्जरी से 1 घंटे के भीतर प्रसंस्करण के लिए, तुरंत ऑपरेशन रूम से लैमिनार प्रवाह ऊतक संस्कृति हुड के लिए नमूना परिवहन।
    नोट: एक दूरदराज के स्थल पर सर्जरी के लिए, छोटे टुकड़ों में ट्यूमर के नमूने में कटौती और DMEM युक्त ट्यूब में जगह/ ट्यूमर को सर्जरी के कई घंटे बाद प्रोसेस किया जा सकता है।
  3. ऊतक के 200-500 मिलीग्राम (इष्टतम) के साथ शुरू, एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर ट्यूमर नमूना कीमा, और एक 15 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर DMEM/F12 सीरम मुक्त माध्यम युक्त ट्यूब में स्थानांतरित । कई बार उलटा करके मिलाएं, ट्यूमर के टुकड़ों को गुरुत्वाकर्षण द्वारा तलछट दें, मध्यम को हटा दें, और आवश्यक के रूप में दोहराएं।
  4. एंजाइमेटिक टिश्यू डिससोशेशन सॉल्यूशन और स्टॉप सॉल्यूशन को फ्रेश तैयार करें।
    1. एंजाइमेटिक टिश्यू डिसोशिएशन सॉल्यूशन: 5 मिली 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए, 2.5 मिली है हैंक का बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (एचबीबीएस) कैल्शियम और मैग्नीशियम-फ्री, 2.5 मिली कोलेजनेस चतुर्थ स्टॉक सॉल्यूशन (कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ एचबीएसएस में 2,000 यू/एमएल)।
    2. समाधान बंद करो: 5 मिलीलीटर ट्रिप्सिन अवरोधक समाधान, 5 मिली DMEM/F12, 5,000 यू/एमएल DNAse I के 2 माइक्रोन (HBSS कैल्शियम में बनाया- और मैग्नीशियम मुक्त) ।
  5. मध्यम निकालें और कीमा बनाया हुआ ट्यूमर नमूने के लिए एंजाइमेटिक ऊतक वियोजन समाधान जोड़ें, प्रत्येक 0.5 ग्राम ऊतक के लिए 2 मिलीलीटर का उपयोग कर। धीरे-धीरे उलटा करके मिलाएं।
  6. 30 मिनट के लिए रोटेशन के तहत एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान में ऊतक इनक्यूबेट।
  7. 2 मिली लीटर पिपेट के साथ ट्राइटरेट करें और पाचन के स्तर के आधार पर पाचन को रोकें या 15-30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए इनक्यूबेटर पर लौटें।
  8. स्टॉप सॉल्यूशन के 2 वॉल्यूम जोड़कर पाचन बंद करें और 5 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ यांत्रिक रूप से ट्राइटेट करें।
  9. एक 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से अपाच्य सामग्री को फ़िल्टर करें। कमरे में अस्थायी पर 5 मिनट के लिए ८०० x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मार, 10 मिलीलीटर DMEM/F12 में 3x धोने के बाद ।
  10. 5 मिलीलीटर DMEM/F12 में अंतिम सेल गोली को फिर से खर्च करें ।
  11. धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 1,300 x ग्राम पर लिम्फोलाइट-एम और गोली के 5 मिलीलीटर से अधिक सेल निलंबन को परत करें।
  12. न्यूक्लियेटेड कोशिकाओं वाली इंटरफेस लेयर को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 10 मिलीलीटर डीएमईएम/एफ12 होता है।
  13. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली दें। DMEM/F12 2x अधिक के साथ धोने दोहराएं ।
  14. क्रायोप्रिजर्वरी सेल फ्रीजिंग माध्यम में गोली को फिर से खर्च करके, क्रायोवियल में एलिकोटिंग, धीमी ठंड और तरल नाइट्रोजन में भंडारण करके आगे के उपयोग के लिए परिणामी एकल कोशिकाओं को तैयार करें।
  15. संस्कृति के लिए, न्यूरोस्फीयर मीडियम में कोशिकाओं को ग्रोथ फैक्टर्स (एनएमजीएफ) के साथ पूरक किया जाता है, और मानक परिस्थितियों में नियमित टी-25 टिश्यू कल्चर फ्लास्क में अपेक्षाकृत कम घनत्व (<1 x10 5 कोशिकाओं/एमएल) पर प्लेट, 5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस, आर्द्र ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर(चित्रा 1A)।
    1. निम्नलिखित नुस्खा का उपयोग कर एनएमजीएफ तैयार करें
      DMEM/F12 के 500 मिलीलीटर के लिए
      स्टॉक समाधान आयतन अंतिम एकाग्रता
      N2 पूरक (10x) 5 मिलीलीटर 1x
      250 मिलीग्राम/एमएल बीएसए स्टॉक समाधान 1 मिलीलीटर 0.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर
      10 मिलीग्राम/मिलीलीटर Gentamicin अभिकर्मक 1.25 मिलीलीटर 25 माइक्रोग्राम/एमएल
      100x एंटीबायोटिक/एंटीमाइकॉटिक 2.5 मिलीलीटर 0.5x
      100 मिलीग्राम/एमएल टीएफजीएफ 0.1 मिलीलीटर 20 एनजी/एमएल
      100 मिलीग्राम/मिलीलीटर ईजीएफ 0.1 मिलीलीटर 20 एनजी/एमएल
  16. संलग्न कोशिकाओं और मलबे से अलग करने के लिए, ताजा फ्लास्क के लिए1-3 सप्ताह (आंकड़े 1B-ई)से अधिक बनाने वाले न्यूरोस्फीयर स्थानांतरित करें। हर 3-4 दिनों में आंशिक मीडिया परिवर्तन करें।
    नोट: यदि ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग कर आर्थोटोपिक ज़ेनोबेड़ा ट्यूमर को अलग करते हैं, तो चरण 1.11-1.13 को छोड़ा जा सकता है।

2. ग्लियोब्लास्टोमा न्यूरोस्फीयर कल्चर मेंटेनेंस और डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस

  1. वियोजन:न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों की निगरानी करें और हर 3-4 दिनों में आंशिक मध्यम परिवर्तन करें। जब फ्लास्क में अधिकांश बहुकोशिकीय न्यूरोस्फीयर व्यास में 100 माइक्रोन तक पहुंचते हैं, तो एकल कोशिका निलंबन में अलग हो जाते हैं:
    1. न्यूरोस्फीयर युक्त माध्यम को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, गुरुत्वाकर्षण लगभग 5 मिनट के लिए न्यूरोस्फीयर को तलछट दें, माध्यम को हटा दें और सेल पेलेट को 10 मिलीलीटर कैल्शियम और मैग्नीशियम-मुक्त डीपीबीएस में फिर से खर्च करें।
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मिश्रण और इनक्यूबेट, गुरुत्वाकर्षण द्वारा कोशिकाओं तलछट के रूप में ।
    3. डीपीबीएस के 7-8 मिलीलीटर निकालें फिर न्यूरोस्फीयर को यांत्रिक रूप से एक प्रीवेटेड सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ अलग करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अलग कोशिकाओं को गोली।
  2. पासेजिंग:एनएमजीएफ में अलग कोशिकाओं (चरण 2.1.) को फिर से उठाया जाता है और आवश्यक संख्या में फ्लास्क (1:3) में विभाजित होता है, और मानक परिस्थितियों में इनक्यूबेट करता है। माध्यमिक न्यूरोस्फीयर बनेगी, और बाद में तृतीयक क्षेत्रों के गठन के लिए अलग किया जाना चाहिए।
  3. दीर्घकालिक आत्म-नवीकरण का आकलन करना:जब तक न्यूरोस्फीयर संस्कृति कम से कम 10 मार्ग प्राप्त न हो जाए, संस्कृति में न्यूनतम 2 महीने के बराबर न हो जाए, तब तक वियोजन प्रक्रिया दोहराएं।
  4. ठंड: न्यूरोस्फीयर को क्रायोप्रिजर्वेट करने के लिए, न्यूरोस्फीयर (चरण 2.1.) को अलग करें और रिकवरी सेल फ्रीजिंग माध्यम में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें, क्रायोवियल्स में एलिकोट, स्लो फ्रीज, और तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें।
    1. एक जमे हुए स्टॉक से न्यूरोस्फीयर कोशिकाओं को संस्कृति में लाने के लिए: कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं और तुरंत 10 मिलीलीटर डीएमईएम/एफ 12 युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को धीरे-धीरे मिलाएं और फिर कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर स्पिन करें। सेल पेलेट को एक बार और धोएं और एनएमजीएफ में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और एक टी-25 टिश्यू कल्चर फ्लास्क में ट्रांसफर करें ।
  5. इम्यूनोसमझौता माउस में इंट्राक्रैनियल इंप्लांट के लिए सेल निलंबन:
    1. न्यूरोस्फीयर (चरण 2.1.) को अलग करें और कैल्शियम और मैग्नीशियम-मुक्त डीपीबीएस में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। हीमोसाइटोमीटर और ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    2. प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या की गणना करें, आम तौर पर 3 x 105 कोशिकाओं/माउस, कोशिकाओं की वांछित संख्या को एक शीशी में स्थानांतरित करें, और कोशिकाओं को 1,000 x ग्राम पर गोली दें।
    3. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को धीरे-धीरे टैप करके प्रत्यारोपण (5 माइक्रोल/माउस) के लिए उपयुक्त मात्रा में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ट करें। बर्फ पर सेल निलंबन रखें और 2 घंटे के भीतर उपयोग करें।

3. ट्यूमरजेनिक ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को बनाने के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल (उन मामलों के लिए जहां न्यूरोस्फीयर संस्कृति विफल होती है)

  1. 2% FBS/NMGF की अंतिम एकाग्रता के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ एनएमजीएफ माध्यम को पूरक करें।
  2. एनएमजीएफ संस्कृति में कोशिकाओं के साथ शुरू: एनएमजीएफफ्लास्क (चित्रा 1F)से हार्वेस्ट व्यवहार्य कोशिकाएं, 2% एफबीएस/एनएमजीएफ में पुनर्सीम व्यय और अपेक्षाकृत कम घनत्व पर प्लेट (<1 x 10 5 कोशिकाएं/एमएल) नियमितटी-25 ऊतक संस्कृति फ्लास्क में, और मानक परिस्थितियों में संस्कृति, 5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रीकृत ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर(चित्रा 1G)।
  3. जमे हुए कभी सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ शुरू (कदम १.१४.): कोशिकाओं गल, सीरम मुक्त माध्यम और थाली में धोने के रूप में 2% FBS/NMGF और संस्कृति के रूप में कदम ३.२ में वर्णित है । 2% एफबीएस/एनएमजीएफ को व्यवहार्य कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से पहले 3 दिनों के लिए एनएमजीएफ में खेती करना विभेदित कोशिकाओं को पूर्वचयनित करने का एक विकल्प है ।

4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा न्यूरोस्फीयर का रूपात्मक और आणविक विश्लेषण

  1. संस्कृति जब तक सबसे अस्थायी बहुकोशिकीय स्फेरॉइड 100 माइक्रोन व्यास तक नहीं पहुंच जाते हैं।
  2. इनक्यूबेटर से संस्कृति फ्लास्क निकालें और तुरंत न्यूरोस्फीयर को गोली दें, मध्यम को हटा दें और गोली को परेशान किए बिना 10 मिलीलीटर डीपीबीएस जोड़ें। डीपीबीएस निकालें, 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन में पुनर्व्यवस व्यय करें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. स्फेरॉइड को गोली दें, 30% इथेनॉल में रीसस्लपेंड करें और 30-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 30% इथेनॉल को 50% इथेनॉल के साथ बदलें, 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और ताजा 50% इथेनॉल के साथ बदलें, एक और 30 मिनट को इनक्यूबेट करें।
  5. 70% इथेनॉल के साथ दोहराएं (चरण 4.4.)।
  6. 95% इथेनॉल के साथ बदलें दो परिवर्तन 10-20 मिनट प्रत्येक, और पूर्ण इथेनॉल के साथ दोहराएं जब तक कि गोलाकार उज्ज्वल सफेद और गाढ़ा न हो जाएं।
  7. लेंस पेपर से एक छोटा फिल्टर पेपर शंकु बनाएं और इसे एक बीकर में एक छोटी कीप में रखें। पूर्ण शराब के साथ लेंस पेपर गीला।
  8. ताजा 100% इथेनॉल के साथ गोली को थोड़ा ढीला करें, अतिरिक्त इथेनॉल डालें और लेंस पेपर शंकु के माध्यम से गोलाकार डालें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि वे शंकु की नोक पर जाएं। अतिरिक्त निरपेक्ष इथेनॉल के साथ ट्यूब कुल्ला और लेंस कागज शंकु के माध्यम से किसी भी शेष गोलाकार डालना।
  9. कीप से पेपर कोन निकालें और सावधानी से स्पेरोइड्स को शंकु के नीचे ले जाएं। कागज को एक वर्ग में मोड़ें और सुनिश्चित करें कि स्फेरॉइड यथासंभव सुरक्षित रूप से संलग्न हैं।
  10. पैकेज्ड न्यूरोस्फीयर को एक कैसेट में स्थानांतरित करें और एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर में स्थानांतरित करें।
  11. इस प्रकार स्वचालित ऊतक प्रोसेसर को प्रोग्राम करें: निरपेक्ष इथेनॉल, 10 मिनट, जाइलीन, 15 मिनट (2x), पैराफिन, 10 मिनट (4x)।
  12. प्रोसेसर से कैसेट निकालें और पैराफिन एम्बेडिंग सिस्टम के गर्म हिस्से पर रखें। सुनिश्चित करें कि पूरी सतह टुकड़ों, धूल या अन्य मलबे से मुक्त है और संदंश वार्मिंग कुओं से सभी पैराफिन बाहर साइफन। गर्म साफ पैराफिन मुक्त संदंश और एक गर्म आधार मोल्ड के लिए पैराफिन की एक छोटी राशि जोड़ें।
  13. कैसेट खोलें, पैकेट निकालकर एम्बेडिंग सिस्टम के गर्म हिस्से पर रखें। पेपर शंकु को तब तक सावधानी से खोलें जब तक कि गोलाकार दिखाई न दें। प्रीवार्म्ड संदंश के साथ जितना संभव हो उतना सामग्री इकट्ठा करें और बेस मोल्ड में तरल पैराफिन में स्थानांतरित करें।
  14. जितना संभव हो उतने स्फेरॉइड को पुनः प्राप्त करने के लिए आवश्यक दोहराएं। धीरे-धीरे एक पूर्व युद्धार्मित क्लीन रेजर ब्लेड के साथ ऊतक पेपर को परिमार्जन करें जिसे ब्लॉक में किसी भी पेपर के बिना किसी भी अवशिष्ट स्फेरॉइड को इकट्ठा करने के लिए इथेनॉल के साथ मिटा दिया गया है।
  15. ध्यान से गर्म संदंश के साथ किसी भी गोलाकार झुरमुट को तोड़ें। स्पेरोइड को कोनों से दूर एक समान केंद्रीय परत में ले जाएं। बेस मोल्ड को जगह में स्फेरॉइड सुरक्षित करने के लिए ठंडा क्षेत्र में ले जाएं, कैसेट जोड़ें, धीरे-धीरे पैराफिन से भरें, और अच्छी तरह से ठंडा करें।
  16. न्यूरोस्फीयर पैराफिन ब्लॉक का उपयोग सामान्य खंड और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए किया जा सकता है।

Representative Results

हमने ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल को अलग और संस्कृति के लिए लागू किया है 125 ताजा सर्जिकल ग्लियोब्लास्टोमानमूने (चित्रा 1),88 नए निदान, और 37 आवर्ती ट्यूमर(तालिका 2),अनुमोदित रोगी सहमति के साथ और संस्थागत दिशानिर्देशों के तहत। दीर्घकालिक न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल की दक्षता 41.6% थी, और नए निदान ट्यूमर और आवर्ती ट्यूमर(तालिका 2)के लिए समान थी। कुछ जीबीएम नमूनों के लिए, न्यूरोस्फीयर पहले कुछ दिनों(आंकड़े 1B और 1C)में बनते हैं, जबकि अन्य के लिए अब खेती का समय आवश्यक है(आंकड़े 1D और 1E)।

न्यूरोस्फीयर गठन की दक्षता विशेष रूप से ऊतक में परिगलन के स्तर पर निर्भर नहीं थी, जैसा कि उच्च कोशिका घनत्व (GBM1) के साथ एक नए निदान ट्यूमर और प्रोटोकॉल 1 और 2 के अनुसार संसाधित एक आवर्ती और गल-समझकर ट्यूमर (GBM2) के परिणामों द्वारा उदाहरण दिया गया था, दोनों न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों(चित्रा 2)उपज ।

इम्यूनोसमझौता चूहों में प्रत्येक न्यूरोस्फीयर संस्कृति की ट्यूमरजन्य क्षमता का परीक्षण सीएससी के संवर्धन के लिए इस दृष्टिकोण का महत्वपूर्ण सत्यापन है । पहले वर्णित18,GBM1 और GBM2 न्यूरोस्फीयर के समान प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए संस्थागत और आईएसीयूसी पशु देखभाल दिशानिर्देशों के तहत इम्यूनोसमझित चूहों के दिमाग में प्रत्यारोपित किया गया । ज़ेनोबेड़ा ट्यूमर जीबीएम की रूपात्मक विशेषताओं को प्रस्तुत करते हैं, जैसे मस्तिष्क परेन्चिमा और परिगलन(चित्रा 2)में आक्रमण।

GBM3 को अलग किया गया था(चित्रा 1A)और न्यूरोस्फीयर माध्यम(आंकड़े 1D और 1E)में सुसंस्कृत, और 2% FBS/NMGF(आंकड़े 1D, 1G, और 1H)में । एनएमजीएफ में सुसंस्कृत 2% एफबीएस/एनएमजीएफ और न्यूरोस्फीयर कोशिकाओं में सुसंस्कृत मोनोलेयर कोशिकाओं को अलग किया गया था और चित्र 2में समान प्रक्रिया का उपयोग करके, नग्न माउस में कोशिकाओं की एक ही संख्या प्रत्यारोपित की गई थी। दो प्रीइप्लांट संस्कृति विधियों(आंकड़े 3 ए-सी)के बीच अस्तित्व, ट्यूमर विकास गतिशीलता, या आकृति विज्ञान में कोई अंतर नहीं देखा गया। ट्यूमर विकास विशेषताओं नवीनतम मार्ग परीक्षण करने के लिए नहीं बदलते हैं, न्यूरोस्फीयर के लिए P20, और 2% FBS/NMGF के लिए P10 । जबकि Sox2 सहित तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर, 10% एफबीएस 3,4,11में सुसंस्कृत अधिकांश प्राथमिक GBM कोशिकाओं में डाउनरेगुएश किए जाते हैं, एनएमजीएफ 2% एफबीएस के साथ पूरक Sox2 अभिव्यक्ति(चित्रा 3 डी)की अवधारण के लिए अनुमति देता है।

प्रोटोकॉल 4 के अनुसार न्यूरोस्फीयर को संसाधित किया गया था, और एचएंडई(चित्रा 4 ए),एंटी-सोक्स 2 एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था, जिसमें परमाणु स्थानीयकरण(चित्रा 4B),और ईजीएफआर एंटीबॉडी, सेल झिल्ली स्थानीयकरण(चित्रा 4C) दिखाया गयाथा। इस प्रोटोकॉल को नेस्टिन, जीएफएपी और प्रसार मार्कर Ki6711की अभिव्यक्ति में उत्तेजनाओं पर निर्भर परिवर्तन का उपयोग करने के लिए लागू किया गया है।

तालिका 2. GBMs से दीर्घकालिक स्व-नवीनीकरण न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों को प्राप्त करने की दक्षता।

पैथोलॉजी एन दीर्घकालिक स्व-नवीनीकरण न्यूरोस्फीयर (एन) उपज वाले नमूनों का प्रतिशत
ग्लियोब्लास्टोमा - अनुपचारित, पहली सर्जरी 88 42.0% (37)
ग्लियोब्लास्टोमा - आवर्ती 37 40.5% (15)
कुल 125 41.6% (52)

Figure 1
चित्रा 1. ताजा ग्लियोब्लास्टोमा सर्जिकल नमूनों से सेल संस्कृति। ताजा ट्यूमर को एक कोशिकाओं में एंजाइमेटिक रूप से अलग किया जाता है। घनत्व पृथक्करण माध्यम से न्यूक्लियेटेड सेल इंटरफेस को फिर एनएमजीएफ में चढ़ाया जाता है। एनएमजीएफ में अलग-अलग न्यूरोस्फीयर चढ़ाया जाता है, और आमतौर पर चढ़ाना के बाद 1 दिन मृत कोशिकाएं, मलबे, संलग्न एकल कोशिकाएं और निलंबन(ए)में कभी-कभी विभाजित कोशिकाएं होती हैं। न्यूरोस्फीयर गठन कुछ मामलों(बी, सी)के लिए तेज है, और दूसरों के लिए धीमा है(डी, ई)। सभी न्यूरोस्फीयर को कम से कम 10 मार्गों के लिए अलग और पुन: प्राप्त किया जाता है, 41.6% जीबीएम दीर्घकालिक स्व-नवीनीकरण न्यूरोस्फीयर उत्प्रेरित करते हैं। व्यवहार्य जीबीएम अलग कोशिकाओं कि न्यूरोस्फीयर(एफ)के रूप में विकसित करने में विफल वैकल्पिक संस्कृति की स्थिति के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए 2% FBS/NMGF(जी, एच)। बार(ए),100 माइक्रोन, सभी छवियों पर लागू होता है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। जीबीएम ट्यूमर से न्यूरोस्फीयर जनरेशन और ऑर्थोटोपिक माउस ज़ेनोग्राफ्ट्स। उच्च सेल घनत्व (GBM1) और उच्च परिगलित सामग्री (GBM2) के साथ एक ट्यूमर पेश एक ट्यूमर अलग थे और प्रोटोकॉल 1 और 2 के अनुसार 10 मार्ग के लिए सुसंस्कृत न्यूरोस्फीयर । इम्यूनोसमझौता चूहों को 3 x 105 अलग न्यूरोस्फीयर कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया था और मरणासन्न होने पर बलिदान कर दिया गया था। माउस दिमाग मानव मार्कर, मानव माइटोकॉन्ड्रिया (एचएमआईटी) या प्रमुख हिस्टोकंपनिटी वर्ग I सबयूनिट एचएलए-ए (एमएचसी-1) के एचएंडई स्टेनिंग और इम्यूनोहिस्ट्री डिटेक्शन के लिए एम्बेडेड फिक्स्ड और पैराफिन थे। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। चूहों में इसी तरह के ट्यूमर की वृद्धि GBM3 कोशिकाओं के साथ इंट्राक्रैनिक रूप से प्रत्यारोपित NMGF में न्यूरोस्फीयर के रूप में या 2% FBS/NMGF में मोनोलेयर के रूप में। (क)GBM3 के लिए Kaplan-Meier अस्तित्व घटता है या तो NMGF में न्यूरोस्फीयर या 2% FBS/NMGF (दोनों मार्ग <10) में मोनोलेयर्स के रूप में सुसंस्कृत अस्तित्व में कोई अंतर नहीं दिखा (n = 10, पी = 0.7174, लॉग रैंक परीक्षण) । (ख)ट्यूमर विकास लाइव बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (BLI) द्वारा निगरानी की दो समूहों के बीच ट्यूमर विकास गतिशीलता में कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं । (ग)ट्यूमर आकृति विज्ञान 4 GBM3 xenografts के लिए अविवेच्य है, 2 NMGF में सुसंस्कृत और 2% FBS/NMGF में सुसंस्कृत । एमएचसी-आई दाग के रूप में चित्रा 2के लिए वर्णित है । स्केल, 600 माइक्रोन। (घ)वेस्टर्न दाग स्टेम सेल मेकर Sox2 अभिव्यक्ति को 2% FBS/NMGF संस्कृतियों में बनाए रखा है जो ज़ेनोबेड़ा ट्यूमर(ए-सी)शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा न्यूरोस्फीयर खंडों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण। न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों को प्रक्रिया 4 में वर्णित औपचारिक रूप से तय किया गया था और पैराफिन एम्बेडेड किया गया था, और एचएंडई(ए),एंटी-सोक्स 2 एंटीबॉडी(बी)और एंटी-ईजीएफआर एंटीबॉडी(सी)के साथ दाग दिया गया था। डीएबी सब्सट्रेट का उपयोग कल्पना करने के लिए किया जाता था(बी, सी)। बार, 20 माइक्रोन। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

उचित एंजाइमेटिक ट्यूमर सेल वियोजन इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। ऊतक को रोटेशन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल वियोजन समाधान में इनक्यूबेशन से पहले अच्छी तरह से कीमा बनाया जाना चाहिए, न्यूनतम 30 मिनट के लिए, जब ऊतक को यांत्रिक रूप से त्रिसंतुरित किया जाना चाहिए और वियोजन का विस्तार सत्यापित किया जाना चाहिए। ऊतक सामंजस्य की डिग्री के आधार पर, इनक्यूबेशन अतिरिक्त 15-30 मिनट के लिए बढ़ाया जा सकता है, के रूप में एकल कोशिकाओं में वियोजन को पूरा करने की जरूरत है । 1 घंटे से अधिक समय तक वियोजन समाधान में इनक्यूबेशन की सिफारिश कोशिका व्यवहार्यता में कमी के कारण नहीं की जाती है। हालांकि शुरू ऊतक की इष्टतम राशि 200-500 मिलीग्राम है, इस प्रोटोकॉल के रूप में ट्यूमर ऊतक के रूप में छोटे रूप में ५० मिलीग्राम से सफल न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों के लिए नेतृत्व किया गया है ।

सीरम-मुक्त एनएमजीएफ एक चयनात्मक माध्यम है, और ट्यूमर के थोक, साथ ही मेजबान कोशिकाओं को शामिल करने वाली नियोप्लास्टिक कोशिकाओं का प्रतिशत जीवित नहीं रहेगा, जबकि अन्य चढ़ाना के बाद ऊतक संस्कृति का इलाज फ्लास्क से जोड़ते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि न्यूरोस्फीयर जो 1-3 सप्ताह(आंकड़े 1B-ई)से अधिक होगा, को विभेदित ट्यूमर कोशिकाओं और मलबे से अलग करने के लिए ताजा फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया जाता है।

जीबीएम कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से अलग किया गया है और कभी सुसंस्कृत (चरण 1.10) को वैकल्पिक मीडिया में संस्कृति के लिए कोशिकाओं के बैकअप स्रोत के रूप में क्रायोप्रेयरक किया जा सकता है, यदि न्यूरोस्फेयर संस्कृति विफल हो जाती है। हम सफलतापूर्वक इस तरह के जमे हुए शेयरों से न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों प्राप्त की है, साथ ही मोनोलेयर कोशिकाओं 2% FBS/NMGF में बढ़ रही है ।

संकल्पनात्मक रूप से, "कैंसर स्टेम सेल" प्रगति में एक काम है और इस उभरते क्षेत्र को अतिरिक्त स्पष्टीकरण से लाभ होगा, क्योंकि नैदानिक निहितार्थ काफी हैं, विशेष रूप से ट्यूमर विषमता, प्लास्टिसिटी की पीढ़ी में, और चिकित्सा के प्रतिरोध19,20। रोगी-विशिष्ट जीबीएम पशु मॉडल पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण होने के अलावा, न्यूरोस्फीयर संस्कृतियां इन विट्रो अध्ययनों के लिए भी मूल्यवान हैं जैसे कि विकास कारकों, हाइपोक्सिया और औषधीय एजेंटों के जवाब में सेल सिग्नलिंग और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन11,21। हमने पूरे क्षेत्र को लेबलिंग और इमेजिंग की अधिक सामान्य विधि के संबंध में बेहतर उपकोशिकीय स्थानीयकरण के कारण, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री11द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का अध्ययन करने के लिए, 3 डी आर्किटेक्चर को संरक्षित करते हुए, फॉर्मेलिन फिक्स्ड और पैराफिन एम्बेडेड न्यूरोस्फीयर के क्रॉस-सेक्शन का उपयोग करने का विकल्प चुना है।

यह दर्शाया गया है कि वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क से प्राप्त न्यूरोस्फेयर के भीतर सभी कोशिकाएं स्टेम सेलनहींहैं . इसी तरह, जीबीएम ट्यूमर से सुसंस्कृत न्यूरोस्फीयर अधिक विभेदित कैंसर जनक कोशिकाओं और आत्म-एकत्रीकरण की उपस्थिति के कारण क्लोनल नहीं होते हैं, जो उच्च कोशिका घनत्व23पर होने के लिए जाना जाता है, जिसे कुछ द्वारा इस विधि की सीमा माना जाता है। दीर्घकालिक आत्म-नवीनीकरण स्टेम कोशिकाओं के लिए संवर्धन का पक्ष लेने के लिए, जैसा कि सिर्फ जनकों के विपरीत है जो क्षणिक रूप से न्यूरोस्फीयर22के रूप में विकसित हो सकते हैं, प्राथमिक न्यूरोस्फीयर माध्यमिक न्यूरोस्फीयर गठन के लिए अलग हो जाते हैं, और आगे न्यूनतम 10 मार्ग के लिए मार्ग, लगभग 2 महीने के बराबर लगातार संस्कृति में, जो स्टेम सेल में समृद्ध आबादी का संकेत है22। हमारे अनुभव में, जीबीएम न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों है कि उस निशान को प्राप्त करने के लिए अनिश्चित काल के रूप में न्यूरोस्फीयर के रूप में विस्तार किया जा सकता है । ट्यूमर ग्रेड मायने रखती है, क्योंकि हमने क्रमशः जीबीएमएस और एनाप्लास्टिक एस्ट्रोसाइटोमा, डब्ल्यूएचओ ग्रेड चतुर्थ और III से सफल संस्कृतियों को प्राप्त किया है, लेकिन निचले ग्रेड ग्लियोमा से नहीं।

10% एफबीएस के साथ पूरक पारंपरिक विकास माध्यम में ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को बनाने की सबसे प्रचलित विधि, मूल ट्यूमर 4 से काफी जीनोमिक और फेनोटाइपिक विचलन की ओर जाताहै। दूसरी ओर, न्यूरोस्फीयर संस्कृतियां कैंसर स्टेम सेल फेनोटाइप 4 पेश करने वाली कोशिकाओं का एक स्थिर औरदीर्घकालिकस्रोत हैं। न्यूरोस्फीयर विधि सभी उच्च ग्रेड एस्ट्रोसाइटोमा नमूनों के लिए सफल नहीं होने के बावजूद ऑर्थोटोपिक माउस ज़ेनोबेड़ा मॉडल के लिए दीर्घकालिक संस्कृतियों में सीएससी के संवर्धन के लिए तेजी से लोकप्रिय हो गई है, जो इस विधि की मुख्य कमजोरी का प्रतिनिधित्व करती है। यह समझने के लिए अध्ययन चल रहे हैं कि माता-पिता के ट्यूमर की आणविक विशेषताएं न्यूरोस्फीयर गठन को कैसे प्रभावित कर सकती हैं। उच्च ग्रेड ग्लियोमा संस्कृति के लिए व्यावहारिक वैकल्पिक तरीकों की खोज, व्यापक सत्यापन के बाद, रोगी विशिष्ट GBM मॉडल होने के महत्वपूर्ण लाभों को देखते हुए, के रूप में हम व्यक्तिगत चिकित्सा के एक युग में अग्रिम, "omics" जानकारी की पहुंच और संभावित लक्षित चिकित्सा की संख्या में वृद्धि से प्रेरित ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को हर्मेलिन ब्रेन ट्यूमर सेंटर, हेनरी फोर्ड हॉस्पिटल द्वारा वित्त पोषित किया गया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
Trypsin - EDTA 0.05% Life Technologies 25300-054
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free Life Technologies 14170-120
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium  Life Technologies 24020-117
Collagenase Type 4 Worthington 5004188
Trypsin Inhibitor Sigma T7659
DNase I Sigma D4527
N2 Supplement (100x) Life Technologies 17502-048
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade Sigma A4919
Gentamicin Reagent Solution Life Technologies 15710-064
Antibiotic/Antimycotic Life Technologies 15240-062
Recombinant Human FGF-basic PeproTech 100-18B
Recombinant Human EGF PeproTech AF-100-15
Lympholyte-Mouse Cedarlane Laboratories Ltd. CL5031
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies 12648-010
Sterile Cell Strainer, 40 μm Fisher 22363547
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium Life Technologies 14190-144
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
Trypan Blue Stain, 0.4% Life Technologies 15250-061
Neutral Buffered Formalin Protocol 245-684
Histoplex Tissue Cassettes Thermo Scientific 22-146-426
Rotator Miltenyi BioTec 130-090-753
GlutaMAX Supplement Life Technologies 35050-061
KnockOut D-MEM/F12 Life Technologies 12660-012
Stem Pro Neural Supplement  Life Technologies A1058-01

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Hasselbach, L. A., Irtenkauf, S. M., Lemke, N. W., Nelson, K. K., Berezovsky, A. D., Carlton, E. T., Transou, A. D., Mikkelsen, T., deCarvalho, A. C. Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry. J. Vis. Exp. (83), e51088, doi:10.3791/51088 (2014).

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