Summary
Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.
Abstract
Os glioblastomas, a forma mais comum e agressiva do astrocitoma, são refratários à terapia, e molecularmente heterogêneos. A capacidade de estabelecer culturas celulares que preservem o perfil genômico dos tumores parentais, para uso em modelos in vitro e in vivo específicos do paciente, tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento pré-clínico de novos tratamentos para glioblastoma adaptados às características moleculares de cada tumor.
Começando com novos tumores de astrocitoma de alto grau dissociados em células únicas, usamos o ensaio da neurosfera como um método de enriquecimento para células que apresentam fenótipo de células-tronco cancerosas, incluindo expressão de marcadores de células-tronco neurais, auto-renovação de longo prazo in vitro,e a capacidade de formar tumores de xenoenxerto ortotópico. Este método foi previamente proposto, e agora está em uso por vários investigadores. Com base em nossa experiência de dissociar e culminar 125 espécimes de glioblastoma, chegamos ao protocolo detalhado que apresentamos aqui, adequado para a cultura da neurosfera de rotina de astrocitomas de alto grau e expansão em larga escala de células tumorigênicas para estudos pré-clínicos. Relatamos a eficiência de culturas de longo prazo bem sucedidas usando este protocolo e sugerimos alternativas acessíveis para cultivar células dissociadas de glioblastoma que não crescem como neurosferas. Também descrevemos em detalhes um protocolo para preservar a arquitetura 3D das neuroferas para a imunohistoquímica. Culturas celulares enriquecidas em CSCs, capazes de gerar modelos ortotópicos de xenoenxerto que preservam as assinaturas moleculares e a heterogeneidade dos GBMs, estão se tornando cada vez mais populares para o estudo da biologia dos GBMs e para o melhor desenho de testes pré-clínicos de terapias potenciais.
Introduction
Glioblastoma (GBM), um astrocitoma grau IV da OMS, é o tumor cerebral primário mais prevalente e agressivo. Diversos fenótipos de desenvolvimento são adotados por células tumorais GBM, incluindo células que apresentam características de "células-tronco cancerosas", como a expressão de marcadores de células-tronco neurais (NSC), a auto-renovação a longo prazo e o potencial de dar origem a células mais diferenciadas expressando marcadores astrócitos e formando a maior parte do tumor1-3. Embora ainda seja necessário esclarecimento sobre a identidade molecular do CSC e as implicações clínicas, o foco do presente trabalho está na definição operacional de CSC: autoconexão de longo prazo in vitro e a capacidade de diferenciar e reproduzir o tumor original após implantação ortotópica em roedores imunocomprometidos.
As células glioblastoma têm sido cultivadas por décadas em meio tradicional contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e várias altas passagens comercialmente disponíveis linhas celulares GBM cultivadas são tumorigênicas em roedores imunocomprometidos, mas há considerável divergência genômica e molecular do tumor original4, limitando seu uso como modelos clinicamente relevantes. Mais recentemente, foram identificadas células com fenótipo stem/progenitor responsivo ao EGF e bFGF nos GBMs2. Posteriormente, as amostras de tumorES GBM dissociadas foram cultivadas em um meio livre de soro3, originalmente formulado para a seleção e expansão de células-tronco neurais do cérebro adulto mamífero5. Essas condições culturais dificultam o crescimento da maioria das populações de células tumorais não inoplásticas e mais diferenciadas, ao mesmo tempo em que favorecem o crescimento de células-tronco e progenitoras como esferoides multicelulares flutuantes, ou neurosferas3,imitando o comportamento das células-tronco neurais de mamíferos adultos5. Comparação abrangente lado a lado das células GBM primárias cultivadas em ambos os meios da neurosfera suplementadas com fatores de crescimento (NMGF) ou no meio de crescimento tradicional complementadas com 10% de FBS, revelou que as neurosferas GBM eram tumorigênicas, apresentavam potencial de diferenciação multilineagem e preservavam o genótipo do tumor original, em contraste com as culturas de 10% de FBS que não eram tumorigênicas em passagens baixas e divergiram consideravelmente dos tumores originais nas passagens tardias4.
Também foi proposto o isolamento do CSC de tumores GBM dissociados por triagem celular com base na expressão do marcador CSC putativo CD133 também foi proposto6,7, mas outros trabalhos indicaram que o fenótipo CSC não está definitivamente associado à expressão de tais marcadores8-10, diminuindo o entusiasmo inicial para essa estratégia, enquanto novos marcadores ainda estão sendo testados10. A indisponibilidade até o momento de um conjunto validado de marcadores que definem csc, juntamente com o objetivo de amplificação em larga escala dessas células para estudos pré-clínicos, torna o uso de classificação celular impraticável para culturas rotineiras enriquecidas com CSC. Células GBM selecionadas pela capacidade de crescer como neurosferas no NMGF invariavelmente expressam marcadores de células-tronco neurais. Observamos que Sox2 e nestin são onipresentemente expressos em culturas da neurosfera, enquanto a proteína CD133 está presente em um subconjunto das neuroesferas GBM (dados inéditos e referência11).
Vários laboratórios estão buscando culturas neuroferas a partir de tumores glioblastoma usando a mesma abordagem geral de dissociação enzimática e cultivo em meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento3,4,11-14, enquanto outros colegas relataram tentativas de cultivar culturas neuroferas de longo prazo a partir de amostras de GBM sem sucesso. O método geral de dissociação enzimática e cultura neurosfera de gliomas de alto grau apresentados aqui é semelhante ao que foi descrito nas publicações acima. Otimizamos o protocolo com base em nossa experiência de dissociar e culminar mais de 100 amostras gbm. A eficiência da obtenção de culturas neuroferas de longo prazo a partir de amostras de GBM frescas aplicando o protocolo aqui apresentado é superior a 40%, semelhante aos poucos relatórios que mostram dados de eficiência3,15, levando à exploração de protocolos alternativos como células de cultivo contínua ou intermitente em meio livre de soro na presença de EGF e bFGF como monocamadas em superfícies revestidas com proteína ECM16,17. As culturas da neurosfera ainda são a abordagem mais validada e cada vez mais popular para preservar os tumores GBM características moleculares e potencial tumorigênico3,4,11-14, portanto nossa abordagem é tentar culturas neuroferas primeiro, enquanto testa concomitantemente métodos alternativos para a cultura de células GBM que não conseguem formar neuroesferas auto-renovadores de longo prazo(Figura 1),para aumentar a representação de tumores GBM que podem ser usados em modelos animais. Aqui apresentamos um protocolo para a cultura de neuroesferas de GBMs. Para as células que não conseguem formar neurosferas, mostramos uma simples modificação no meio de crescimento, como a primeira tentativa de cultivar células tumorigênicas da nonneurosphere formando GBMs, com resultados promissores e ainda passando por ampla validação.
Protocol
1. Suspensão celular única do espécime glioblastoma cirúrgico fresco para a cultura da neurosfera
- Com consentimento por escrito dos pacientes e de acordo com as diretrizes institucionais, colete amostras de tumores para cultura celular imediatamente após a cirurgia de ressecção de glioma de alto grau.
- Confirme o diagnóstico da amostra de tumor pela histopatologia. Transporte imediatamente o espécime da sala de operação para a capa de cultura de tecido de fluxo laminar, para processamento dentro de 1 hora da cirurgia.
NOTA: Para cirurgias em um local remoto, corte a amostra de tumor em fragmentos menores e coloque em um tubo contendo DMEM/F12 (mantenha no gelo). O tumor pode ser processado várias horas após a cirurgia. - Começando com 200-500 mg de tecido (ótimo), pique a amostra do tumor usando uma lâmina de bisturi, e transfira para um tubo de 15 ml contendo 10 ml de ml de meio livre de soro DMEM/F12. Misture invertendo várias vezes, deixe que os pedaços tumorais sedimentem por gravidade, removam o meio e repitam conforme necessário.
- Prepare a solução de dissociação de tecido enzimático e stop solution fresco.
- Solução de Dissociação de Tecidos Enzimáticos: 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA, 2,5 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) solução de cálcio e magnésio, 2,5 ml Solução de estoque de colagenase IV (2.000 U/ml em HBSS com cálcio e magnésio).
- Solução stop: solução inibidora de trypsin de 5 ml, 5 ml DMEM/F12, 2 μl de 5.000 U/ml DNAse I (fabricada em HBSS sem cálcio e magnésio).
- Remova o meio e adicione solução de dissociação de tecido enzimático à amostra de tumor picado, utilizando 2 ml para cada tecido de 0,5 g. Misture suavemente invertendo.
- Incubar o tecido em solução a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidual em rotação por 30 minutos.
- Triturar com uma pipeta de 2 ml e parar a digestão ou retornar à incubadora para outra incubação de 15-30 min, dependendo do nível de digestão.
- Pare a digestão adicionando 2 volumes de Stop Solution e triturar mecanicamente com uma pipeta sorológica de 5 ml.
- Filtre o material não digerido através de um coador de células de 40 μm. Pelota as células a 800 x g para 5 min na temperatura da sala, seguida pela lavagem de 3x em 10 ml DMEM/F12.
- Resuspense a última pelota celular em 5 ml DMEM/F12.
- Camada lenta da suspensão celular acima de 5 ml de Linfolito-M e pelota a 1.300 x g por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Transfira a camada de interface contendo as células nucleadas para um tubo de 15 ml contendo 10 ml de DMEM/F12.
- Pelota as células a 800 x g por 5 min a temperatura ambiente. Repita a lavagem com DMEM/F12 2x a mais.
- Criopreserve as células únicas resultantes para uso posterior, reutilizando a pelota no Meio de Congelamento de Células de Recuperação, aliquoting em criovias, congelamento lento e armazenamento em nitrogênio líquido.
- Para a cultura, resuspenque as células em Neurosphere Medium suplementada com Fatores de Crescimento (NMGF), e placa em densidade relativamente baixa (<1 x 105 células/ml) em um frasco regular de cultura tecidual T25 sob condições padrão, 5% CO2, 37 °C, incubadora de cultura tecidificada(Figura 1A).
- Prepare o NMGF usando a seguinte receita
Por 500 ml de DMEM/F12 Solução de estoque volume concentração final Suplemento N2 (10x) 5 ml 1x Solução de estoque BSA de 250 mg/ml 1 ml 0,5 mg/ml Reagente gentamicina de 10 mg/ml 1,25 ml 25 μg/ml 100x antibiótico/antimíctico 2,5 ml 0,5x 100 mg/ml bFGF 0,1 ml 20 ng/ml 100 mg/ml EGF 0,1 ml 20 ng/ml
- Prepare o NMGF usando a seguinte receita
- Transfira neuroesferas que se formam ao longo de 1-3 semanas(Figuras 1B-E) para frascos frescos, para separar de células e detritos anexados. Realize alterações parciais na mídia a cada 3-4 dias.
NOTA: Se dissociar o tumor de xenoenxerto ortotópico usando o protocolo acima, as etapas 1.11-1.13 podem ser omitidas.
2. Manutenção da Cultura da Neurofera glioblastoma e aplicações a jusante
-
Dissociação: Monitore as culturas da neurosfera e realize alterações médias parciais a cada 3-4 dias. Quando a maioria das neuroesferas multicelulares no frasco atingir 100 μm de diâmetro, dissocia-se em uma única suspensão celular:
- Transfira o meio contendo as neurosferas para um tubo de 15 ml, sedimento gravitacional as neuroesferas por cerca de 5 minutos, remova o meio e resuspenda a pelota celular em 10 ml de DPBS sem cálcio e magnésio.
- Misture e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, como as células sedimentam por gravidade.
- Remova 7-8 ml de DPBS e dissociar as neurosferas mecanicamente com uma pipeta sorológica pré-enlatado.
- Pelota as células dissociadas a 800 x g por 5 min a 4 °C.
- Passagem: Resuspenque as células dissociadas (etapa 2.1.) no NMGF e divida no número necessário de frascos (1:3) e incuba em condições padrão. Neuroesferas secundárias se formarão, e devem ser posteriormente dissociadas para a formação de esferas terciárias.
- Avaliação da auto-renovaçãoa longo prazo : Repita o procedimento de dissociação até que a cultura da neurosfera atinja pelo menos 10 passagens, o equivalente a um mínimo de 2 meses de cultura.
-
Congelamento: Para criopreservar as neurosferas, dissociar as neurosferas (passo 2.1.) e resuspensar a pelota celular no Meio de Congelamento celular de recuperação, alíquota em criovial, congelamento lento e armazenar em nitrogênio líquido.
- Para cultivar células da neurosfera a partir de um estoque congelado: descongelar as células a 37 °C e transferir imediatamente para um tubo de 15 ml contendo 10 ml DMEM/F12. Misture o tubo suavemente e gire as células a 800 x g por 5 min a 4 °C. Lave a pelota celular mais uma vez e resuspenja as células em NMGF e transfira para um frasco de cultura tecidual T25.
-
Suspensão celular para implante intracraniano em camundongos imunocomprometidos:
- Dissociar as neuroesferas (passo 2.1.) e resuspensar a pelota celular em DPBS livre de cálcio e magnésio. Conte células viáveis usando um hemócito e exclusão azul trypan.
- Calcule o número de células necessárias para o implante, tipicamente 3 x 105 células/rato, transfira o número desejado de células para um frasco e pelota as células a 1.000 x g.
- Resuspenque a pelota celular em um volume apropriado para implante (5 μl/mouse) tocando suavemente o tubo de microcentrifuge. Coloque a suspensão da célula no gelo e use dentro de 2 horas.
3. Protocolo Alternativo para Culturing Tumorigenic Glioblastoma Cells (para os casos em que a cultura da neurosfera falha)
- Suplemente o meio NMGF com soro bovino fetal a uma concentração final de 2% FBS/NMGF.
- Começando com células na cultura NMGF: Colher células viáveis do frasco NMGF(Figura 1F),resuspend em 2% FBS/NMGF e placa em densidade relativamente baixa (<1 x 105 células/ml) em um frasco regular de cultura tecidual T25, e cultura em condições padrão, 5% CO2, 37 °C, incubadora de cultura tecidificada(Figura 1G).
- Começando com células nunca cultivadas congeladas (passo 1.14.): Descongelar as células, lavar em meio e placa sem soro em 2% FBS/NMGF e cultura como descrito na etapa 3.2. A cultura no NMGF por 3 dias antes de transferir células viáveis para 2% FBS/NMGF é uma alternativa para pré-selecionar células diferenciadas.
4. Análise morfológica e molecular das neuroesferas por imunohistoquímica
- Cultue as neuroesferas até que a maioria dos esferoides multicelulares flutuantes atinjam 100 μm de diâmetro.
- Remova os frascos de cultura da incubadora e pelota imediatamente as neurosferas, remova o meio e adicione 10 ml de DPBS sem perturbar a pelota. Remova o DPBS, resuspend em formalina tamponada 10% neutra e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente.
- Pelota os esferoides, resuspense em 30% etanol e incuba por 30-45 min.
- Substitua 30% de etanol por 50% de etanol, incuba por 15 min e substitua por 50% de etanol fresco, incubar mais 30 min.
- Repita (passo 4,4.) com 70% de etanol.
- Substitua por 95% de etanol duas mudanças de 10-20 min cada, e repita com etanol absoluto até que os esferoides sejam brancos brilhantes e condensados.
- Faça um pequeno cone de papel filtro do papel da lente e coloque-o em um pequeno funil em um béquer. Molhe o papel da lente com álcool absoluto.
- Solte ligeiramente a pelota com etanol fresco 100%, despeje o excesso de etanol e despeje os esferoides através do cone de papel da lente, certificando-se de que eles vão para a ponta do cone. Enxágüe o tubo com etanol absoluto adicional e despeje todos os esferoides restantes através do cone de papel da lente.
- Retire o cone de papel do funil e mova cuidadosamente os esferoides para a parte inferior do cone. Dobre o papel em um quadrado e certifique-se de que os esferoides estejam o mais bem incluídos possível.
- Transfira as neuroesferas embaladas para um e transfira para um processador automático de tecido.
- Programe o processador automático de tecido da seguinte forma: etanol absoluto, 10 min, xileno, 15 min (2x), parafina, 10 min (4x).
- Remova o do processador e coloque-o na parte aquecida de um sistema de incorporação de parafina. Certifique-se de que toda a superfície está livre de fragmentos, poeira ou outros detritos e sifão para fora toda a parafina dos poços de aquecimento fórceps. Asseps livres de parafina quente e adicione uma pequena quantidade de parafina a um molde de base aquecido.
- Abra o, remova o pacote e coloque-o na parte aquecida do sistema de incorporação. Abra cuidadosamente o cone de papel até que os esferoides estejam visíveis. Reúna o máximo possível do material com fórceps pré-armados e transfira para a parafina líquida no molde base.
- Repita o necessário para recuperar o maior número possível de esferoides. Raspe suavemente o papel de tecido com uma lâmina de barbear limpa pré-armada que foi limpa com etanol para coletar quaisquer esferoides residuais sem colocar qualquer papel no bloco.
- Quebre cuidadosamente qualquer aglomerado esferoide com fórceps quentes. Mova os esferoides para longe dos cantos em uma camada central uniforme. Mova o molde base para a área de resfriamento para fixar os esferoides no lugar, adicione o, encha lentamente com parafina e esfrie bem.
- O bloco de parafina da neurosfera pode ser usado para secção normal e imunohistoquímica.
Representative Results
Aplicamos o protocolo descrito acima para dissociar e cultivar 125 amostras de glioblastoma cirúrgico fresco(Figura 1),88 recém-diagnosticados e 37 tumores recorrentes(Tabela 2),com consentimento aprovado pelo paciente e sob diretrizes institucionais. A eficiência do protocolo para o estabelecimento de culturas neuroferas de longo prazo foi de 41,6%, e semelhante para tumores recém-diagnosticados e tumores recorrentes(Tabela 2). Para algumas amostras de GBM, as neurosferas formam-se nos primeiros dias(Figuras 1B e 1C),enquanto para outras é necessário tempo de cultivo mais longo(Figuras 1D e 1E).
A eficiência da formação da neurosfera não dependia exclusivamente do nível de necrose no tecido, conforme exemplificado pelos resultados de um tumor recém-diagnosticado com alta densidade celular (GBM1) e um tumor recorrente e necrosado (GBM2) processado de acordo com os Protocolos 1 e 2, ambos produzindo culturas neuroferas(Figura 2).
Testar o potencial tumorigênico de cada cultura neurofera em camundongos imunocomprometidos é a validação crucial dessa abordagem para o enriquecimento dos CSCs. Utilizando um protocolo semelhante ao descrito anteriormente18,neuroferas GBM1 e GBM2 foram implantados no cérebro de camundongos imunocomprometidos, sob diretrizes institucionais e de cuidados com animais do IACUC. Os tumores de xenoenxerto apresentam características morfológicas de GBMs, como invasão ao parênquimo cerebral e necrose(Figura 2).
O GBM3 foi dissociado (Figura 1A) e cultivado em meio neurosfera(Figuras 1D e 1E), e em 2% FBS/NMGF (Figuras 1D, 1G e 1H). As células monocamadas cultivadas em 2% FBS/NMGF e células neurosferas cultivadas em NMGF foram dissociadas e o mesmo número de células foram implantadas em camundongos nus, utilizando o mesmo procedimento da Figura 2. Não foram observadas diferenças na sobrevida, dinâmica de crescimento do tumor ou morfologia entre os dois métodos de culturapré-implantação ( Figuras 3A-C). As características de crescimento tumoral não mudam até a última passagem testada, P20 para neurosferas e P10 para 2% FBS/NMGF. Enquanto os marcadores de células-tronco neurais, incluindo o Sox2, são regulados na maioria das células GBM primárias cultivadas em 10% FBS 3,4,11, NMGF suplementado com 2% FBS permite a retenção da expressão Sox2(Figura 3D).
As neuroesferas foram processadas de acordo com o Protocolo 4, e rotuladas com H&E (Figura 4A),anticorpo anti-Sox2, mostrando localização nuclear(Figura 4B),e anticorpo EGFR, localização da membrana celular(Figura 4C). Este protocolo foi aplicado para acessar alterações dependentes de estímulos na expressão de nestin, GFAP e no marcador de proliferação Ki6711.
Mesa 2. Eficiência de derivar culturas de neurofera auto-renovador a longo prazo de GBMs.
| Patologia | n | Porcentagem de amostras que produzem neuroesferas autoconexantes de longo prazo (n) |
| Glioblastoma - não tratada, primeira cirurgia | 88 | 42.0% (37) |
| Glioblastoma - recorrente | 37 | 40.5% (15) |
| total | 125 | 41.6% (52) |
Figura 1. Cultura celular a partir de amostras cirúrgicas de glioblastoma frescos. Tumores frescos são enzimaticamente dissociados em células únicas. A interface celular nucleada do meio de separação de densidade é então banhada em NMGF. Neuroesferas dissociadas são banhadas em NMGF, e tipicamente 1 dia após o revestimento há células mortas, detritos, células únicas anexadas e células divisórias ocasionais em suspensão(A). A formação da neurosfera é mais rápida para alguns casos(B,C)e mais lenta para outros(D,E). Todas as neurosferas são dissociadas e remarcadas por pelo menos 10 passagens, 41,6% GBMs produzem neuroesferas auto-renovados a longo prazo. Células dissociadas GBM viáveis que não crescem como neurosferas (F) podem ser transferidas para condições alternativas de cultura, por exemplo 2% FBS/NMGF(G,H). Barra (A),100 μm, aplica-se a todas as imagens. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 2. Geração de neurosfera e xenoenxertos ortotópicos de camundongos gbm. Uma amostra de tumor que apresentava alta densidade celular (GBM1) e um tumor com alto teor necrosado (GBM2) foram dissociadas e neuroferas cultivadas por 10 passagens de acordo com os Protocolos 1 e 2. Camundongos imunocompromoizados foram implantados com 3 x 105 células da neurosfera dissociadas e sacrificados quando moribundos. Os cérebros de camundongos foram formados fixos e parafina incorporada para a coloração de H&E e detecção imunohistoquímica de marcadores humanos, mitocôndrias humanas (hMit) ou principal classe histocompatibilidade I subunit HLA-A (MHC-I). Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 3. Crescimento de tumores semelhantes em camundongos implantados intracranianamente com células GBM3 cultivadas como neurosferas em NMGF ou como monocamadas em 2% FBS/NMGF. (A) As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para GBM3 cultivadas como neurosferas em NMGF ou monocamadas em 2%FBS/NMGF (ambas as passagens <10) não mostram diferença na sobrevivência (n=10, p=0,7174, teste de log-rank). (B) O crescimento tumoral monitorado por imagem de bioluminescência ao vivo (BLI) não mostra diferença significativa na dinâmica de crescimento do tumor entre os dois grupos. (C) A morfologia tumoral é indistinguível para xenergraftos de 4 GBM3, 2 cultivados em NMGF e 2 cultivados em 2% FBS/NMGF. Mancha MHC-I como descrito para a Figura 2. Escala, 600 μm. (D) Mancha ocidental mostrando a expressão sox2 fabricante de células-tronco retida em culturas 2% FBS/NMGF usadas para iniciar os tumores de xenoenxerto(A-C). Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 4. Análise da expressão proteica em seções da neurosfera por imunohistoquímica. As culturas da neurosfera foram fixadas em formalina e parafinas incorporadas como descrito no Procedimento 4, e manchadas com H&E(A),anticorpo anti-Sox2(B)e anticorpo anti-EGFR(C). O substrato DAB foi usado para visualizar(B,C). Bar, 20 μm. Clique aqui para ver imagem maior.
Discussion
A dissociação adequada das células tumorais enzimáticas é um passo crítico neste protocolo. O tecido deve ser picado bem antes da incubação na solução de dissociação celular a 37 °C em rotação, por um mínimo de 30 min, quando o tecido deve ser triturado mecanicamente e a extensão da dissociação verificada. Dependendo do grau de coesão tecidual, a incubação pode ser estendida por mais 15-30 minutos, conforme necessário para completar a dissociação em células únicas. A incubação na solução de dissociação por mais de 1 hora não é recomendada devido à diminuição da viabilidade celular. Embora a quantidade ideal de tecido inicial seja de 200-500 mgs, este protocolo levou a culturas neuroferas bem sucedidas de apenas 50 mg de tecido tumoral.
O NMGF sem soro é um meio seletivo, e uma porcentagem de células neoplásicas que compõem a maior parte do tumor, bem como as células hospedeiras, não sobreviverão, enquanto outras se ligarão à cultura tecidual tratada após o revestimento. É fundamental que as neurosferas que se formarão ao longo de 1-3 semanas (Figuras 1B-E) sejam transferidas para frascos frescos, para separar-se das células tumorais e detritos diferenciados.
Células GBM enzimáticamente dissociadas e nunca cultivadas (passo 1.10) podem ser criopreservadas como fonte de backup das células para a cultura em mídia alternativa, caso a cultura da neurosfera falhe. Conseguimos com sucesso culturas da neurosfera a partir de tais estoques congelados, bem como células monocamadas crescendo em 2% FBS/NMGF.
Conceitualmente, "célula-tronco do câncer" é um trabalho em andamento e este campo emergente se beneficiará de esclarecimentos adicionais, uma vez que as implicações clínicas são consideráveis, particularmente na geração de heterogeneidade tumoral, plasticidade e resistência à terapia19,20. Além de serem vitais para a geração de modelos animais GBM específicos do paciente, as culturas da neurosfera também são valiosas para estudos in vitro, como alteração na sinalização celular e expressão genética em resposta a fatores de crescimento, hipóxia e agentes farmacológicos11,21. Optamos por utilizar seções transversais de neuroesferas fixas e parafinas, preservando a arquitetura 3D, para estudar a expressão proteica e modificações pós-translacionais por imunohistoquímica11,devido à localização subcelular superior em relação ao método mais comum de rotulagem e imagem de toda a esfera.
Foi demonstrado que nem todas as células dentro das neurosferas derivadas do cérebro adulto são células-tronco22. Da mesma forma, as neuroesferas cultivadas a partir de tumores GBM provavelmente não são clonais, devido à presença de células progenitoras de câncer mais diferenciadas e auto-agregação, conhecida por ocorrer em altas densidades celulares23, o que é considerado uma limitação desse método por alguns. Para favorecer o enriquecimento de células-tronco auto-renovadoraes de longo prazo, em oposição a apenas progenitores que podem crescer transitoriamente como neuroesferas22, as neurosferas primárias são dissociadas para formação da neurosfera secundária, e ainda mais transitadas por um mínimo de 10 passagens, aproximadamente equivalente a 2 meses em cultura contínua, o que é uma indicação de uma população enriquecida em células-tronco22. Em nossa experiência, as culturas da neurosfera GBM que atingem essa marca podem continuar a ser expandidas como neuroesferas indefinidamente. O grau do tumor importa, uma vez que obtivemos culturas bem sucedidas de GBMs e astrócitos anaplásticos, grau IV e III da OMS, respectivamente, mas não de gliomas de menor grau.
O método mais prevalente de cultivar células de glioblastoma, em meio de crescimento tradicional suplementado com 10% de FBS, leva a considerável divergência genômica e fenotípica dos tumores originais 4. Por outro lado, as culturas da neurosfera são uma fonte estável e de longo prazo de células que apresentam fenótipo de células-tronco cancerosas4. O método da neurosfera tornou-se cada vez mais popular para o enriquecimento do CSC em culturas de longo prazo para modelos de xenoenxerto de rato ortotópico, apesar de não ter sido bem sucedido para todas as amostras de astrocitoma de alto grau, o que representa a principal fraqueza deste método. Estudos para entender como as características moleculares dos tumores parentais podem afetar a formação da neurosfera estão em andamento. A exploração de métodos alternativos práticos para a cultura de gliomas de alto grau, seguidas de ampla validação, dadas as vantagens importantes de ter modelos GBM específicos do paciente, à medida que avançamos para uma era de medicina personalizada, alimentada pela acessibilidade de informações "omics" e aumento do número de potenciais terapias-alvo.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Centro de Tumores Cerebrais Hermelin, Hospital Henry Ford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Trypsin - EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
| Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
| Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
| Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
| Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |
References
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