Summary
wormsorter 형광 기자의 표현에 따라 웜을 정렬하여 예쁜 꼬마 선충의 유전자 화면을 용이하게한다. 여기에서, 우리는 새로운 사용 설명 : GFP - 표현 병원체에 의한 식민지에 따라 정렬을, 우리는 면역 반응을 시작하기에 병원체의 인식의 불완전하게 이해 역할을 조사하기 위해 그것을 사용합니다.
Abstract
wormsorter이 예쁜 꼬마 선충의 연구에 사용되는 FACS 기계와 유사한 악기, 일반적으로 형광 기자의 식을 기반으로 웜을 정렬합니다. 여기에서, 우리는 GFP - 표현 병원체에 의한 식민지 자신의 정도에 따라 벌레를 정렬,이 악기의 다른 사용을 강조 표시합니다. 이 새로운 사용은 우리가 웜 소장과 면역 반응의 유도의 식민지 사이의 관계를 해결 할 수있었습니다. 동안 C. 다른 병원균에 elegans의 면역 반응은이를 시작 무엇 여전히 알 수없는, 문서화되었습니다. (상호 배타적이지) 두 가지 가능성이 병원체 - 관련 분자 패턴을 인식, 감염에 의한 손상을 감지합니다. 두 가지 가능성을 구분하기 위해 병원체에 노출이 원인이되는 손상으로부터 해리해야합니다. 그램-N 광범위 - 식민지가 된 웜의 wormsorter 활성화 분리식민지 유사하게 노출 된 웜 가능성이 병원균 부하로 인한 손상,, 그러나, 또는 가장자리와를 egative 병원체 녹농균,. 이러한 구별 인구 병원체로드 전사 및 면역 반응의 유도와의 관계를 평가하기 위해 사용되었다. 결과는 두 가지가 병원체 인식의 가능성을 지원 해리되도록 제안한다.
Introduction
자동 웜 정렬은,이 튜브에 곧게 통과 (일반적으로 기자 단백질의 유전자 발현에 의해 제공) 웜에 형광 신호를 측정하여 운영 리디렉션으로 Collection 튜브 /도 또는 폐기물 용기에 따라 수 많은 FACS처럼 연구원 1로 설정 매개 변수를 게이팅. wormsorter은 여러 가지 방법으로 연구를 촉진 할 수있다; 분석 도구로서 채용하는 예는 거의 1000 유전자 2 프로모터 활성의 시공간적 패턴을 따라 연구이다.
그러나 wormsorter의 주요 용도는 표적 유전자의 발현 수준 또는 웜 3-5의 축을 따라 형광 단백질의 지역화 다음, 유전 화면이다.
여기에서, 우리는 찬란 태그 병원체에 의해 웜의 식민지 다음의, wormsorter에 대한 새로운 응용 프로그램을 설명합니다. 이와 함께 도구로 우리는 pathog 사이의 관계에 초점을 맞춘식민지 / 부하와 면역 반응 도중에 웜에 면역 반응의 개시를 담당하는 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.
현재까지 연구의 거의 모든 생물에서, 미생물 병원체에 타고난 면역 반응의 시작은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)의 인식에 따라, 및 / 또는 위험 / 손상 관련 분자 패턴 (감쇠) 6,7. 미생물의 세포벽의 편모, 또는 지질 이중층 (6)의 구성 요소를 포함 할 첫 번째 보존되어 미생물의 구조, 두 번째는 모두 해제 분자 (예를 들면 ATP 8) 변경, 단백질이나 변형 된 세포 과정 9,10의 다른 마커를 포함한다. 신호의 두 가지 유형은 특정 패턴에 따라 분자의 결합이 보호 반응으로 이어지는 일련의 사건을 활성화 패턴 인식 수용체 (PRRS)로 지정 단백질에 의해 인식됩니다. C.에게 엘레 tracta으로 매우 유용했습니다BLE 모델 호스트 병원체 상호 작용의 다양한 측면을 해부하지만, 잘 이해되지 않는 한 가지 면역 반응이 웜에 시작하는 방법입니다하십시오. 다른 생물의 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 orthologous하는 추정 수용체 중에 PAMPS을 바인딩 표시되지되었고, 다른 생물의 면역 반응에 대한 중요한 있습니다 PRRS의 orthologs 많은 웜 병원체 반응에 놀라 울 정도로 제한된 기여를 보여 저항. 예를 들어, 그람 양성 병원균에 저항하기위한 필수적인 초파리 유료 수용체는, C로 표시된다 나타내는 데이터와 함께 있지만 다른 테스트 그람 음성 또는 양성 병원균 (11, 12)에서, 그람 병원체 살모넬라 균 Typhimurium (11) 보호에 기여한다. 이러한 관측 단독 상동, TOL-1에 의해 엘레 그 면역 반응 세포 단백질 번역의 시간을 방해에 의해 유도 될 수있다지도 일부가 제안하는 그 C. 엘레는 주로 감쇠 9,13,14를 감지합니다. 그럼에도 불구하고, 면역 반응을 유도하는 죽은 병원균의 능력을 설명하는 보고서는 PAMP 바인딩 C.에있는 병원체의 인식에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 엘레 (15, 16). 나이 동기화 유 전적으로 동일한 C의 면역 반응에 초점을 맞추고 이전 작업 elegans의 인구는 세균 그람 음성 병원균 녹농균에 의해 장내 정착에 큰 개인의 다양성을 보여 주었다.
그러나, 전사 프로파일 링 연구는 하나의 엔티티 (17, 18) 이러한 가변 - 식민지 인구를 처리. 이 변동성을 활용, 우리는 GFP - 표현 P.에 노출 예쁜 꼬마 선충의 차별적 식민지 인구를 분리하는 자동화 된 wormsorter을 집중 프로토콜을 개발 녹농균. 다르게 - 식민지 인구에서 유전자 발현을 faci 검사병원체로드 (및 관련 손상) 및 면역 반응과 C.의 병원체 인식에 대한 새로운 통찰력을 제공 사이의 관계 litated 평가 엘레 19. 우리는 어떤 찬란 병원체에 감염된 웜을 정렬에 적용 할 수있는 프로토콜을 설명 아래.
잠재적 인 사용자에게 그것을 정리 될 필요 벌레의 수는 사용상의 후속 분석 및 프로토콜의 특성에 의존한다는 것을 주목해야한다. 예를 들어, 마이크로 어레이 유전자 발현 분석의 경우,> 1000 웜은 표준 프로토콜을 사용하는 경우, 충분한 RNA를 구하는 것이 요구되지만, 증폭을 채택한 경우 ~ 100 웜 충분할, 소재의 신속한 수집을 허용하고, 따라서 스트레스를 최소화 벌레.
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Protocol
1. 젊은 성인 동물의 동기화 문화를 얻기
- OP50-1 E. 시드 여러 NGM 플레이트에 벌레를 성장 대장균 박테리아는 (10 배는 포화 문화 집중) 많은 벌레가 임신하는 단계에 도달 할 때까지.
- 동기화 문화 (계란)을 획득 달걀 준비 솔루션으로 임신하는 동물을 처리합니다.
- 여러 60 mm NGM 플레이트에 플레이트 계란은 대략 150 ~ 200 계란 / 판의 밀도로 10 배 농축 OP50-1 시드.
- (- 젊은 성인 단계 웜 L4에 도달 할 때까지) 2 일 동안 25 ° C에서 접시를 품어.
2. 녹농균 플레이트를 준비 및 웜 감염
- 달걀 준비 (단계 1.1)의 날에 100 μg / ML의 최종 농도에서 왕의 B 미디어 포함 리팜피신 2 ㎖로 PA14 :: GFP 문화를 접종. 교반 O / N과 37 ° C에서 문화를 품다
- PA14 :: GFP 막 플레이트분석에 필요한만큼 천천히 죽이는 판 (SKP)에 진짜야. 각 150mm SKP 페트리 접시 피펫에 75 ~ 100 포화 문화의 μL 및 멸균 유리 스프레더를 사용하여 균일하게 확산. 20 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- 인큐베이터에서 접시를 제거하고 실온 (~ 20 분)으로 냉각 할 수 있습니다. M9 버퍼를 사용하여, PA14에 단계 1.4에서 벌레를 씻어 :: GFP 판을 액체의 최소한의 볼륨. 150mm 플레이트를 사용하는 경우, 수백 웜 단판에 배치 될 수있다.
- 18 ~ 21 시간 동안 25 ° C에서 접시를 품어. P.에 대한 녹농균에 노출 된 젊은 성인 웜,이 noncolonized 동물 대 식민지의 최적 분배를 표시하는 시간 창입니다.
3. Wormsorter 설정
샘플의 종류를 수행하기 전에 컴퓨터가 올바르게 작동하는지 확인합니다. 자세한 사항은 http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43에서 얻어지고, 일 할 수 있습니다전자 필수적인 단계는 아래에 설명되어 있습니다.
- 약 5 PSI (4.5 ~ 5.5 범위)에 칼집 밸브 압력을 설정합니다.
- 그 칼집 유체 유량이 적절 확인 디스펜서 아래에 15 ML 원뿔 튜브를 배치, 칼집 밸브를 켜고 분류기 밸브를 해제하십시오. 60 초 동안 디스펜서 아래에 튜브를 잡습니다. 튜브의 볼륨은 9 ~ 10 ㎖를해야한다. 가이 범위를 벗어나면, 그에 따라 칼집 밸브의 압력을 조정한다.
- (단계 3.2로 설정) 그 칼집 유체 유량이 40 μm의 조정 입자를 사용하여 정렬 속도를 테스트 정확한 정렬을 보장하기 위해 허용 할 것이다 :
- 칼집 밸브를 끄십시오. 저수지 제어 입자 용액의 25 ML을 추가합니다.
- 칼집 밸브, 샘플 밸브를 켭니다.
- 컴퓨터 소프트웨어에서 "제어 입자 모드"로 이동하여 취득을 클릭합니다.
- 입자 유량의 폭을 근사 TOF (비행 시간)과 함께, ~ 5-8 입자 / 초 있는지 확인입자의 40 μm의. 이러한 TOF는 하나의 40 μm의 개체가 한 번에 통과되어 있음을 나타냅니다. 값이이 범위를 벗어난 경우에, 그에 따라 (위에서 아래 방향)의 설정을 조정한다.
4. Noncolonized 웜 대 식민지 소트
- M9를 사용하여, 15 ML 원뿔 튜브에 벌레를 씻어. 어른 벌레가 중력에 의해 튜브의 바닥에 가라 상층 액을 제거 할 수 있습니다. 신선한 M9와 튜브를 입력합니다. 이 과정을 3 - 4 배를 반복합니다. 이 애벌레의 큰 비율뿐만 아니라 여분의 박테리아를 제거하고 약 10 분 소요됩니다.
- 부드럽게 혼합 작은 파문 바 wormsorter 저수지에 벌레를 추가합니다.
- 200에 600에 녹색 PMT를 설정하고 빨간색과 노란색 PMT에 의해 초기 신호 이득을 조정합니다.
- 설정을 조정하기 위해 데이터를 수집 시작한다.
- 초당 25 ~ 30 이벤트 (벌레)의 일종 속도에 대한 목표로하고 있습니다. 개수 비율이 너무 높으면, 따라서 M9와 저장소 내에 웜 희석. 속도가에있는 경우O 저, M9의 작은 부피에 더 많은 벌레를 추가합니다.
- 실험 noncolonized 웜 대 식민지의 매우 엄격한 분리를 요구하는 경우, "우연의 일치 확인"을 "순수"로 설정합니다. 이 경우에 두 물체가 서로 너무 가깝게 발생하거나 동일한 드롭에서, 기계는 오히려수록보다 강하를 거부 것을 보장한다.
- 관심의 인구를 정렬 크기 (어른 벌레를 구하는) 및 (noncolonized 낮은 정착을 위해, 즉 높은) 형광 강도를 나타내는 축 주위에 문을 그립니다. 형광 게이팅의 값은 경험적으로 결정해야합니다.
- 벌레를 정렬 시작 정렬 밸브를 엽니 다 벌레를 수집하는 멀티 웰 플레이트 또는 디스펜서 아래 페트리 접시를 놓습니다.
- 정렬 된 인구가 관심의 인구입니다 현미경으로 확인하기 위해 동물의 작은 인구를 수집합니다. 그렇지 않은 경우, 그에 따라 게이트의 매개 변수를 조정 및 시료 채취를 계속합니다.
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Representative Results
나이와 일치하는 경우, 유 전적으로 동일한 C. 엘레은 P.에 노출되어 녹농균은 넓은 분포는 식민지 (그림 1A)의 수준에서 관찰된다. 식민지 웜 noncolonized의 효율적인 분리 (그림 1B) 달성 할 수있다 여기에 설명 된 프로토콜의 도움으로. noncolonized 웜과는 달리, 식민지 웜은 부진 감소 배변 19과 같은 손상의 징후를 보여줍니다. 후자는 벌레가 P. 식민지 이유가 될 수있다 aeruginosa에 어려움이 감염을 삭제있다. 이 noncolonized로 분류 벌레가 이전에 정착되지 않은 것을 제안 설명 된 프로토콜에 대한 직접적인 영향을 미칠 수있다. 바로이 주장이 올바른지 여부를 테스트하기 위해, 손으로 수확 식민지 웜은 정렬 실험에서와 유사한 세척 단계를 실시하고 그 후 형광 현미경으로 관찰 하였다; 만 56분의 4는 병원체를 삭제. 따라서 가능성 번째입니다noncolonized로 분류되어 그 사이에 이전에 식민지 웜의 비율에 무시할 수있다. 그러나, P. 이외의 병원체에 대한 문제가 더있을 수 있습니다 분석에 잘못된 정렬의 효과를 방지하기 위해 세척 단계에서 식민지의 변화를 모니터링하는 것이 바람직하다 녹농균.
마이크로 어레이 유전자 발현 분석을위한 우선 웜을 사용하고 P. 본질적으로 동일한 반응을 관찰 여기에서 설명한 프로토콜을 사용한 전작 시간 (19)의 동일한 양의 병원체에 노출되었던 정착 및 noncolonized 웜 인구에서 녹농균이. 2 C의 일부로 알려져 개의 유전자의 발현을 측정하는 정량적 (Q) RT-PCR을 사용하여 동일한 경향을 보여 도표 . 엘레 면역 반응 : LYS-2 라이소자임, F08G5.6 및 F55G11.2이 처음도 infec에 기여하는 감염에 특이 적으로 반응이 특성화되지 않은 유전자입니다 인코딩기 저항 및 PGP-5, 감염 등의 중금속의 스트레스 반응을 나타낸다. 네 개의 유전자는 P.에 의해 유사하게 유도 하였다 에 관계없이 벌레의 식민지 상태의 녹농균 노출. 이것은 식민지와 관련 손상 대신 신호로 병원체 - 관련 분자 패턴을 가리키는, 면역 반응에 필요하지 않은 것을 나타내는 이전에 출판 된 결과를 확증. 즉, PGP-5는 큰 피해가 발생 될 것으로 예상되지 않습니다 noncolonized 동물에서 유도, C. 면역 반응과 일반적인 스트레스 반응을 조절하는 규제 프로그램에 중복 제안 엘레.
그림 1. 식민지와 C를 noncolonized 엘레 wormsorte를 사용하여 분리야생형 성인 C.의 연구. (A) 대표 이미지 GFP - 표현 P.에 노출 엘레 18 시간 동안 녹농균. (B) noncolonized과 식민지 웜의 대표 이미지가 wormsorter를 사용하여 분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 식민지는 P.에 전사 응답이 필요하지 않습니다 녹농균.리스 - 2 (A)의 RNA 수준 F08G5.6 (B)는, F55G11.2 (C), 및 야생형 동물에서 QRT-PCR에 의해 측정 PGP-5 (D)는 E. 노출 대장균 또는 P. 녹농균 </ ~ 18 시간 동안 EM>. 수단과 세 대표 한 실험에서 중복 측정 SD는입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 재료 및 wormsorter 실험에 필요한 시약.
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Discussion
우리가 설명하는 방법은 웜과 그 환경 사이의 상호 작용을 수행하기 위해, 웜 외부 기관의 형광 라벨을 활용합니다. 우리는 선물의 경우, 분리는 병원체의 라벨을 기준으로 한없이 (또는 빛) 부하를 가진 사람에서 무거운 병원체 부하 별도의 웜을 사용 하였다. 이후 유전자 발현 분석은이 병원균 부하 독립적 이었다는 것을 건의하는 두 그룹 사이의 면역 반응에 차이를 찾을 수 없습니다. 반응을 개시 신호가 물리적으로이 신호가 PAMP 될 수 있다는 것을 제안 아니라 분비되지 않고, 세균과 연관된 것으로 밖에 도시 하였다. 함께,이 결과는 PAMP 인식 C.에서 면역 반응을 개시하는 역할을 가설을지지 엘레 19.
상기 선별 프로토콜의 하나의 장점은 모두 정착 및 noncolonized 웜은 단일 모집단으로부터 격리되어있다. 일이다 noncolonized 대 식민지가되는 동물의 최적 분포와 인구를 가진에 따라 달라집니다. 우리는 발견 그 P. 젊은 - 성인, 야생 형 웜에 감염되면 녹농균, 이것은 약 18 시간의 노출 시간에 대응. 이 노출시 동물의 대부분은 "중간"정도 정착,하지만 수백 벌레가 가득 식민지였으며, 비슷한 번호가 noncolonized 된 한 인구를 생산. 이것이 우리의 목적을 위해 최적의 분포를 나타내는 반면, 다른 사람들은 자신의 최적 분배를 정의 할 수 있습니다.
정렬하는 동안, 각 실험에 내장 된 "품질 관리"를 가지고하는 것이 좋습니다. 우리는 두 가지 방법으로 그렇게했습니다. 하나는 유전자 발현 연구를 위해, 우리는 유전자의 한정된 세트에 QRT-PCR에 사용될 수있는 형광 해부 현미경 하에서 (정착 및 noncolonized) 벌레의 소수 손 고른. 이들은 어떤 유전자 expressi위한 "금 표준"의 역할을진정한 순수 인구에하면 다음과 같을 것이다. 둘째, 예상대로 장비가 수행하는 형광 현미경으로 확인하기 위해 각 자동으로 정렬 인구를 위해 접시에 20 개 이상의 벌레를 정렬하는 것이 좋습니다. 하류 애플리케이션에 따라 선별 프로토콜의 "정확도"상이한 정도가 요구 될 수있다. 분류 벌레가 식민지의 원하는 수준을 준수하지 않는 경우, 게이트 매개 변수 (단계 4.7)을 조정해야합니다. 이것은 게이트가 높은 초기 필요한 벌레의 수 및 실험은 따라서 최대 크기를 조정해야 더 엄격한 것을 주목해야한다.
여기에 설명 된 실험은 (이 찬란 태그가되어있는 한) 그 어떤 병원체로 수행 될 수있다. 정렬 후, 후속 분석은 유전자 발현 분석에 부착 할 필요가 없으며, 심지어 생존 행동 분석에 집중할 수있다. 또한, 유사한 프로토콜은 분석 목적을 위해 사용될 수있다, 대사 산물의 흡수를 따라, 또는 병원체로드, 20, 21 매우 다양하다 CFU 수,에 대한 간단한 대안을 제공 후자를 정량화 할 수 있습니다. 숫자와 속도의 증가는 유전 호스트의 중단 또는 병원체, 서로 다른 환경 조건 등 다양한 조건에서 병원균 부하를 정량화 용이하게 할 수 있습니다. wormsorter가 군체를 추적, 다 형광 분자를 검출하기 위해 장착 될 수 있기 때문에 더욱, 박테리아의 싱글 타입에 한정 될 필요는 없다. 이 기능은 다른 미생물이 식민지에 대해 경쟁 할 수 있도록 생태 연구에 유용 할 것이다. 병인, C. 실험실 연구에서 엘레은 전형적 세균성 단작에 성장된다. 그러나 병원균이 면역에 영향을 미칠 수있는 다른 미생물의 수백의 사이에 존재하는 야생의 선천성 면역 메커니즘의 연구는 관심 (22, 23)을 가너하기 시작합니다.
요약,저기서에서g 다양한 애플리케이션 wormsorter 실험이 단시간에 수행 될 수 있으며, 그리고 / 또는 대규모. 이러한 응용 프로그램의 레퍼토리를 확장하는 것은 C. 우리의 이해를 앞당길 수있다 생리 엘레 간스. 특히, C. 분야 엘레 선천성 면역, 생존은 다양한 유전자의 기여를 테스트하기 위해 자주 사용하는 통계입니다. 그러나 식민지는 여전히 기능 출력을 제공하는 동시에 면역력을 시작하는 이벤트에 더 인접합니다. 여기에 설명 된대로 관심의 인구를 격리 및 / 또는 분석 프로토콜을 사용하면 웜에 면역 반응의 초기 사건의 다양한 측면을 연구하는 중요한 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 그들의 지원을 위해 엘리슨 의료 재단 감사합니다. 우리는 wormsorter을 사용하여에 대한 지원은 애비 Dernburg 실험실의 구성원을 감사하는 것이 좋겠다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| Rifampicin | Sigma | R3501 | |
| Egg prep solution | prepared in house | 50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide | |
| NGM plates | prepared in house | Recipe at wormbook.org | |
| SKP plates | prepared in house | Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25% | |
| Control test particles | Union Biometrica | 310-5071-001 |
References
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