Summary
치유 손상균의 처리는 세포막 손상의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 포함한다. 이 프로토콜은 이러한 프로세스를 모니터링하는 분석을 설명합니다.
Abstract
치유 손상균의 능력은 기본적인 세포 과정이지만 치유 손상균 개인 세포 및 분자 메커니즘은 불완전하게 이해되어있다. 여기에 분석은 현지화 된 손상 후 배양 된 세포의 치유의 능력과 반응 속도를 모니터링 할 수 있도록 서술되어있다. 첫 번째 프로토콜은 동시에 수백 개의 셀의 세포막 수리 능력을 평가하기 위해 엔드 포인트 기반의 접근 방식에 대해 설명합니다. 제 2 프로토콜은 펄스 레이저와 지역화 부상 다음 개별 세포의 세포막 수리의 동력학을 모니터하는 실시간 이미징 방법을 설명한다. 치유 부상 세포가 상해의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 수반으로, 세 번째 프로토콜은 동시에 부상 수백 개의 셀에 하나의 인신 매매 사건 (리소좀 세포 외 유출)을 평가하기 위해 위의 엔드 포인트 기반의 접근 방식을 사용하고 마지막 프로토콜을 설명합니다 TIRF의 마이크로 함께 펄스 레이저 부상의 사용에 대해 설명높은 공간과 시간적 해상도로 부상 세포에서 각각의 세포 내 구획의 역학을 모니터에 복사합니다. 여기 프로토콜 세포막 수리 배양 근육 세포의 리소좀 세포 외 유출 간의 링크를 연구하는 이러한 접근법의 사용을 설명하지만, 이들은 임의의 다른 부착 배양 세포 및 선택의 세포 내 구획을 위해 등을 적용 할 수있다.
Introduction
세포막은 세포와 세포 외 환경 사이의 장벽을 제공함으로써 세포의 무결성을 유지한다. 정상적인 생리 임계 값뿐만 아니라 병원균 침입의 존재를 초과, 화학, 전기, 기계적인 자극이 세포막에 상해에있는 각 결과와이 상처를 복구 이후의 세포 반응을 트리거 할 수 있습니다. 세포막에 이러한 부상을 살아 남기 위해서, 세포 복구를위한 효율적인 메커니즘을 가지고있다. 이 메커니즘은 칼슘 의존하고 다른 사람의 사이에 같은 annexins과 MG53 같은 단백질의 세포 내 인신 매매뿐만 아니라 손상된 세포막 1-7 엔도 좀, 리소좀, 골지체 파생 소포와 미토콘드리아 같은 세포 내 구획을 포함한다. 그러나 손상된 세포막을 복구에 관련된 분자 및 세포 내 일련의 이벤트의 세부 사항이 제대로 이해 남아 있습니다.
세포의 수리 응답은 귀으로 분리 할 수 있습니다LY 늦게 반응. 분 시간 단위로 초 이내에 발생하는 초기 반응은 성공적으로 세포 수리 또는 세포 사망에 이르는 늦게 응답의 성격을 결정하는 데 대단히 중요하다. 대량 생화학 및 세포 분석을 기반으로 엔드 포인트 분석은 수리 분자 및 세포 프로세스의 참여를 설정 도움이있다. 그러나, 셀룰러 인해 복구 응답 이질성 및 신속성으로, 종점 분석법 복구를 초래하는 이벤트의 시퀀스의 운동 및 공간 세부 정보를 제공하지 못한다. 세포막의 부상 제어를 가능하게하고 세포막 수리 및 높은 공간 및 시간적 해상도에 관련된 세포 내 반응을 모니터링 할 수 있도록 접근은 이상적으로 그러한 연구를 위해 적합하다. 여기, 이러한 접근 방법이 제시되었다. 프로토콜의 두 레이저 INJ 따라 세포막 수리의 실시간 동역학 및 생균의 복구 과정과 연관된 세포 내 반응을 모니터링하는 방법을 설명URY. 이러한 라이브 세포 이미징 기반의 분석에 대한 보완으로, 엔드 포인트 분석은 개별 세포와 관련된 세포 내 반응의 모니터링 수리를 위해 인구를 기반으로 측정을 제공하는 기술되었다. 이러한 접근은 세포막 손상에 응답 매매 및 리소좀의 세포 외 유출을 모니터링하는 데 사용 된 그들의 실용성을 입증.
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Protocol
1. 이미징 세포막 수리 대량 사용 (유리 구슬) 부상
이 프로토콜은 별도로 부상 세포 치료에 실패하는 사람들을 표시 할 수 있습니다. 세포의이 인구의 양을 세 가지 조건의 사용이 필요합니다 : 1. 테스트 (C1) - 세포는 칼슘 2 +, 2의 존재에 복구 할 수 있습니다. 제어 1 (아무 부상 C2) - 세포는 칼슘 이온의 존재 하에서 배양,하지만 부상하지, 3됩니다. 제어 2 (노 수리 C3)는 - 세포는 칼슘 2 +의 부재에 복구 할 수 있습니다.
- 세 멸균 커버 슬립에> 50 %의 합류로 세포 성장과 실리콘 O-링에 37 ° C 및 전송의 coverslips에서 PBS와 37 ° C 및 C3에서 CIM 회 C1과 C2를 씻어.
- C1과 C2 또는 PBS에서 C3에 CIM에서 데워진 FITC 덱스 트란 용액 100 μl를 추가합니다.
- 조심스럽게 수동 틸팅 커버 슬립에 의해 상온에서 커버 슬립에 40 밀리그램의 유리 구슬을 회전에 의해 C1과 C3에 세포막을 손상30 °의 각도로 앞으로 6 ~ 8 시간.
참고 : 가벼운 부상, 따라서 반복 부상을 최소화, 유리 구슬이 균일하게 확산되도록. 샘플 사이 부상의 재현성을 향상시키기 위해, 동시에 비교 될 다른 샘플의 유리 구슬 부상을 수행한다. - 구슬의 추가 흔들림을 방지, 대기 CO 2에서 37 ° C 배양기에 모두 커버 슬립을 전송하고 수리가 5 분 동안 진행 할 수 있습니다.
- 구슬이 굴러시키지 않고, 37 ℃에서 CIM (C1 및 C2) 또는 PBS (C3)로 세척하여 유리 구슬과 FITC 덱스 트란을 제거
- 장소는 O 링에 다시 커버 슬립과 C1과 C2 또는 PBS에서 C3에 CIM에서 데워진 리신 고칠 TRITC 덱스 트란 용액 100 μl를 추가합니다.
- 주위 CO 2에서 5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- 데워진 CIM로 두 번 커버 슬립을 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA로 고정합니다.
- PBS로 두 번 세척하고 헥스 염료의 실온에서 2 분 동안 품어.
- 세척 SAMPLES PBS로 2 회, 표면 형광 현미경을 사용하여 장착 매체 및 화상 세포를 사용하여 슬라이드 마운트.
- 배경 빨간색과 녹색의 염색 강도를 결정하고, 모든 샘플 (C1-C3)에 대한 임계 빨간색과 녹색 채널에이 값을 사용하는 C2의 세포를 사용합니다.
- ) 녹색 (부상 및 수리) 및 b) 적색 또는 적색과 녹색 (부상을 모두 포함하지만, C1과 C3 샘플에서) 복구하는 데 실패하는 세포의 수를 점수.
- 백작> (100) 그린의 각 조건에 대한 부상의 모든 세포 (녹색, 적색)의 백분율로 복구하는 데 실패 세포의 일부를 발현하는 세포.
2. 레이저 손상 후 세포의 막 수리의 속도론의 라이브 영상
- 데워진 CIM으로 세포를 세척 한 다음 FM 염료와 CIM에 커버 슬립을 넣어.
- 37 ℃에서 무대 위에 배양기에서 홀더에 커버 슬립을 배치
- 세포막의 1-2 MM 2 지역을 선택하고 대한 조사 <, 펄스 레이저와 10 밀리. 피크 파워 40-50 %로 소프트웨어를 통해 레이저 파워를 감쇄. 최적의 전력이 일치하지만, 치명적 부상을 허용하고이 사용되는 각각의 악기와 세포 라인에 대한 시행 착오에 의해 결정되어야한다.
- 이전에 부상을 시작, 표면 형광 및 시야에 수리, 이미지마다 10 초를 모니터링하고 손상 후 3 ~ 5 분 동안 계속합니다.
참조 : 수리 컨트롤의 반복 PBS의 부상 세포가 FM 염료를 함유하는 2.1-2.4 단계를 반복합니다. - 수리의 반응 속도를 정량화하기 위해 휴대 FM 염료의 형광을 측정 및 이미징의 과정 동안 강도 (ΔF/F0)의 변화를 플롯. 이 데이터는 각 조건에서 10 셀에 대한 평균과 필요에 따라, 평균 또는 개별 셀의 값으로 그릴 수 있어야합니다.
3. 영상 벌크 (유리 구슬) 상해 유도 리소좀 세포 외 유출
샘플은> 50 %로 성장 다음 세포를 포함합류 : 1. 테스트 (C1) - 칼슘 2 +, 2의 존재에 복구 할 수 세포. 제어 1 (C2, 아니 부상) - 세포 손상되거나 차 항체와 함께 배양, 3 어느 쪽도. 제어 2 (C3, 아니 수리) - 칼슘 2 +의 부재에 복구 할 수 세포.
- 세탁은 37 ° C에서 PBS와 37 ° C 및 C3에서 CIM 회 C1과 C2를 커버 슬립 실리콘 O-링에 전송할 수 있습니다.
- C3에 C1과 C2에 CIM과 PBS에서 데워진 리신 고칠 TRITC 덱스 트란의 100 μl를 추가합니다.
- 단계 1.3에서와 같이 C1과 C3에 세포막을 손상.
- 구슬의 추가 흔들림을 방지, 대기 CO 2에서 37 ° C 배양기에 모두 커버 슬립을 전송하고 수리가 5 분 동안 진행 할 수 있습니다.
- 다시 세포에 유리 구슬의 더 롤링을 보장하지, 차가운 성장 매체에 커버 슬립을 세척하여 유리 구슬과 TRITC 덱스 트란을 제거합니다.
- 차가운 성장 매체로 두 번 커버 슬립을 씻어 O-링에 전송할 수 있습니다.
- C1과 C3에차가운 완벽한 성장 미디어 쥐 반대로 마우스 램프 1 항체의 100 μl를 추가하고 C2에 감기, 완전 성장 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 항체를 4 ℃에서 30 분 동안 품어 커버 슬립을 결합 수 있도록하려면
- 차가운 CIM과 커버 슬립을 세 번 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA 모두의 coverslips를 해결하고 CIM으로 배를 씻어.
- 실온에서 15 분 동안 차단 솔루션의 100 μL의 모든 커버 슬립을 품어
- 4 ℃에서 알렉사 플 루어 100 μL에 15 분 동안 488 안티 쥐의 항체를 모두 커버 슬립을 품어
- PBS로 두 번 세척하고 훽스트에서 실온에서 2 분 동안 품어.
- PBS로 두 번 세포를 세척, 표면 형광 현미경을 사용하여 설치 미디어 및 이미지를 사용하여 슬라이드에 탑재합니다.
- C2 셀의 이미지를 사용하여 비특이적 배경 빨간색으로 염색 (TRITC 덱스 트란)과 녹색 (알렉사 플 루어 488 항체) 채널을 결정하고 모든 샘플 (C1-C3)의 빨간색과 녹색 채널 임계 값이 배경 염색 값을 사용합니다. </ 리>
- 손상된 세포의 램프 1 염색 (녹색)의 강도를 측정하기 위해 C1과 C3에서> (100) 레드 라벨 세포를 사용합니다. 성공적인 실험을 위해 C3의 세포에있는 램프 1 염색은 C1의 세포에 비해 크게 낮은 것입니다.
4. 셀 멤브레인 손상의 라이브 영상은 세포 내 인신 매매를 트리거
- 형광 라벨 (리소좀 8에 대한 예를 들어, CD63-GFP) 또는 형광 염료 (9)를 사용하여 해당 기자를 형질 전환하여 관심의 구획.
- 형광 염료와 라벨 리소좀를 들어, FITC-덱스 트란을 포함하는 성장 매체에 50 %의 합류로 성장 세포를 배양
- CO 2 인큐베이터 (관심 세포주로 덱스 트란과 충분한 엔도 좀의 표시에 필요한 이상) 덱스 트란 2 시간 동안 endocytosed 할 수 있습니다.
- 수 있도록 데워진 성장 매체와 세포를 세척하고 CO 2 배양기에서 2 시간 동안 그 안에 품어 모든리소좀 축적하는 덱스 트란을 endocytosed.
- 촬영하기 전에 예비 가온 CIM에서 커버 슬립을 씻어 37 ℃에서 무대 위에 인큐베이터에 커버 슬립 홀더에 장착
- (셀에 걸쳐 이동) 위드 또는 TIRF (세포 표면 및 세포 외 유출에 운동) 이미징을 수행 - FITC 덱스 트란 혼잡이없는 세포가 표시 리소좀 개별 리소좀의 이동과 세포 외 유출 이미징에 이상적입니다.
- 영상 현미경에 대한 TIRF 레이저 정렬 : 사용 60X 또는> 1.45 NA와 100X의 목표를. 제조업체의 접근 방식을 사용하여 사건 TIRF 레이저 빔의 각도를 설정합니다.
- 40~50% 감쇠의 펄스 레이저로, <100 밀리 위해 작은 (1-2 MM 2) 영역을 조사함으로써 세포막을 손상.
- 관심의 세포에서 세포 외 유출의 역학에 따라 최소 2 분 이상 4-6 프레임 / 초에 부상, 이미지 셀 셀에 리소좀의 반응을 모니터링 할 수 있습니다.
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Representative Results
단일 세포 이미징 여기에 설명 된 프로토콜은 능력과 반응 속도 세포막 수리 (프로토콜 1, 2) 및 복구하는 동안 세포 내 인신 매매와 리소좀의 융합 모니터링 할 수 있습니다 (프로토콜 3, 4).
프로토콜 1은 모든 부상 세포를 표시하고 복구하는 데 실패하는 부상 세포를 식별 할 수있는 대량 분석을 보여줍니다. 손상되지 않은 세포 (그림 1A)가 레이블을 유지하면서, FITC 덱스 트란의 존재에 유리 구슬로 부상 세포 (그림 1B 및 1C) 녹색 표시되는 그림 1 쇼의 결과. 세포가 칼슘의 존재에 복구 할 수 있습니다 때 2 + 부상 (녹색) 세포의 대부분은 수리, 관리 및 TRITC 덱스 트란 (그림 1B)에 의해 (적색)으로 표시되지 않습니다. 세포는 칼슘 2 +의 부재 하에서 복구하도록 허용되는 경우, 손상균의 대부분은 또한 TRITC 덱스 트란 (FI하여 적색 표시되어gure 1C). 부상당한 적이 있었다 세포 TRITC 덱스 트란과 모든 라벨을 표시하지 않습니다. 따라서, 이중 (적색 및 녹색) 표지 된 세포의 개수가 실패한 셀의 측정 값을 제공 정량화 동안 만 표시된 녹색, 유리 구슬 등 부상하고 복구 된 셀 측정 값을 제공하는 세포의 수를 정량 임의의 주어진 샘플에서 부상에서 복구합니다.
이 프로토콜은 셀 FM 염료의 엔트리를 모니터링함으로써 세포막 수리의 동력학 평가를 설명한다. FM 염료에서 배양 할 경우, 손상 세포 (상해 WF 패널 전에 그림 2A) 세포막 염색을 보여줍니다. 세포막의 국소 레이저 손상 후 FM 염료는 셀들이 FM과 형광 염료 (도 2B)의 급격한 증가를 초래 endomembranes를 바인딩 시작한다. 다음 레이저 손상을 복구하는 세포막의 용량으로 칼슘 이온, 칼슘 이온의 존재로 부상 세포에 의존 AB는르 FM 염료 항목을 일으키는, 수리 (따라서 휴대 FM 염료 형광 증가) 부상 후 분 이내에 중단 (그림 2A, 상단 패널, 그림 2B, 블루 라인, 및 비디오 1과 그림 2 애니메이션)입니다. 반대로, 칼슘 2 +의 부재에 복구 할 수 셀, 따라서 FM 염료 형광의 지속적인 증가를 연속 염색 항목에 결과 및있는 복구하는 데 실패하는 경우에도 4 분 부상 (그림 2A 후, 하단 패널, 그림 2B, 레드 라인) 비디오 2와 그림 2 애니메이션. 세포막 수리 부족 고원 실패 연속 염료 엔트리를 발생하면서 따라서 세포막 수리, FM 염료 염색 plateauing에 이르게한다.
프로토콜 3 부상에 응답 소체와 단백질의 세포 표면 전위를 감시하는 벌크 (유리 비드)의 부상 방식의 사용을 설명한다. 여기에 일손상되지 않은 세포 (그림 3A) 빨간색 표시되지 동안 전자 세포는, 따라서 TRITC 덱스 트란의 존재로 부상하고 있지만 모든 손상된 세포 (그림 3B 및 3C) 빨간색 표시되어 있습니다. 세포 표면 램프 1 (그림 3A의 램프 1 패널)에 대한 일차 항체 쇼 배경 레벨 표시로 처리되지 않은 손상되지 않은 세포. 세포가 부상과 칼슘의 존재에 치유 할 수있다 그러나, 리소좀은 세포 외 유출을 받아야하기 때문에 부상 (빨간색 표시) 세포 (그림 3B)의 표면에 램프 1 염색의 증가 수준이있다. 세포 표면 램프 1 라벨링의 증가는 칼슘의 부재 (그림 3C)에 치유 할 수있다 세포에서 훨씬 낮습니다. 이것은 칼슘 규제 리소좀 세포 외 유출의 성격 때문에 램프 1의 표면 외관을 보여줍니다. 따라서 양쪽 높은 세포 표면 LAMP1 염색법으로 세포의 수를 정량뿐만 아니라 레벨을 측정개인 부상 세포에 세포 표면 램프 1 염색의 부상은 리소좀 세포 외 유출을 발생 받아야하는 세포의 능력에 대한 측정을 제공합니다.
프로토콜 4 세포막 손상에 응답 동력학, 성격 및 개별 리소좀 융합의 위치를 직접 모니터링을 위해 사용될 수있다. 세포는 리소좀이 모니터링 부상이 각각의 세포에있는 리소좀의 세포 외 유출 트리거 (그림 4A 및 비디오 3 애니메이션). 그림 4a는에 의해 시각 (녹색에 설명) 셀을 표시 할 수 있습니다 TIRF 이미징에 의해 촬영 된 펄스 레이저 및 세포 표면으로 부상 위상 콘트라스트 이미지 (왼쪽 패널) 전에 부상으로 TIRF 현미경 (중앙 패널)에 의해. 오른쪽 패널은 부상 후 동일한 셀 105 초 TIRF의 이미지를 보여줍니다. 각종 부상 리소좀의 응답을 트리거는 그림에 설명되어 있습니다 4B-E. 그림 (b)는 부상 리소좀의 모집을 트리거 표시 (표시세포 외 유출 (애니메이션 비디오 4와 그림 4) 다음 세포막에 회색 원)로. 이 리소좀 이전 (그림 (b) : 패널 -2.5 초) 부상으로 TIRF 이미지에 표시되지 않지만 다음과 같은 부상 리소좀은 세포막에 도달한다 (그림 (b) : 패널 102.5들) 탐지가되는 소포가 가까이 이동함에 따라, 세포막 그것은 TIRF 조명에 의해보다 흥분과 융합 모공 리소좀의 pH 중화를 유발하므로 FITC 덱스 트란 형광 (도 4b : 패널 104.8들)의 dequenching 열리면 리소좀 FITC 덱스 트란 형광 최대 값에 도달한다. 이어서 덱스 트란 서서히 (: 107.1 패널들도 4B)을 감소시키는 횡 방향 확산 FITC 형광을 일으키는 세포의 외부 및 소포 형광에 소포로부터 배출된다. 두 번째 범주에서 주황색 원으로 표시 리소좀은 (Vid에 애니메이션소포 exocytoses까지 패널 91 초) : 패널 -2.5 초)는 막 (그림 4C에 남아있다 : EO 5 그림 4) 부상하기 전에 (그림 4C가 존재합니다. 퓨전 (: 94.5의 그림 4C) 다음 소포 일부 FITC 덱스 트란 남겨두고 다음은 리소좀는 부분적으로 (패널 93의 그림 4C)를 exocytosed. 소포의 세 번째와 네 번째 범주는 막에 융합하지 않습니다. (파란색 원으로 표시)도 4d에 도시 리소좀은에 멀리 (비디오 6 그림 4 animated) 세포막에서 축 방향으로 이동합니다. 이 리소좀 부상 (그림 4D : 패널 -2.5 초) 전에 세포막에 표시되지 않지만 다음과 같은 부상 세포막에 접근시는 TIRF 현미경 (그림 4D : 패널 59.3 초)으로 표시됩니다. 그것은 세포막 (그림 4D : 패널 59.6 초)에 가장 가까운 도달 한 다음 (그림 4D 융합하지 않고 멀리 이동 : P를Anel 5의 63.7 초). 네 번째 범주의 리소좀 멤브레인 부근에 도착합니다. 그림 4E (패널 8.7들) 리소좀의 도착을 보여줍니다 수평 세포막 (비디오 7 및 그림 4 애니메이션도 4a에 보라색 상자로 표시된 영역)을 따라 이동 어느 한 후 멤브레인을 따라 이동하고 일련의 이미지에서 볼 수있는 부상을 게시 (그림 4E : 패널 10.7, 11.9, 12.8, 18.8의). 각 리소좀의 FITC 덱스 트란 형광 강도 정량화 위의 설명을 바탕으로 - (그림 4E)를 융합 (그림 (b)와 (c))를 축 방향으로 (그림 4D)를 이동 또는 수평으로 이동 상해 리소좀의 반응을 판단 할 수 있습니다.
그림 1. . 유리 구슬로 대량 세포막 손상 이미지 핵 염색 (훽스트, 왼쪽 패널)을 보여, 상해 (녹색 염색 - FITC 덱스 트란), 수리되지 않은 세포 (빨간색 염색 - TRITC 덱스 트란) 및 (병합) 이미지를 합병했다. 칼슘의 존재 하에서 (A) 손상되지 않은 세포는, (B), 칼슘의 부재하에 세포를 칼슘의 존재하에 세포를 부상하고, (C) 부상. 스케일 바 10 μm의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. . (오렌지에 설명) 세포의 레이저 부상에 대한 응답으로 세포막 수리의 실시간 영상 (A) 이미지 손상 [왼쪽 패널 전 - 시야 (BF) 및표면 형광 (EPI)], 5 초, 부상 후 1 분, 4 분. 부상의 사이트는 흰색 화살표로 표시됩니다. 상판은 칼슘과 하판의 존재 부상 세포 칼슘의 부재 부상 셀을 도시 나타낸다. (B) 그래프 칼슘 (블루)의 존재 또는 칼슘 (레드)의 부재로 부상 패널의 셀의 FM 염료 염색 (ΔF/F0)의 변화를 나타내는. FM 염료가 들어가 따라서 형광 라벨링 증가 영역은 형광 강도의 정량화에 사용되었다. 스케일 바 = 10 μm의). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 대량 부상에 대한 응답으로 이미징 리소좀 세포 외 유출. 이미지는 핵 염색 훽스트 (파란색), 세포 표면 램프 1 염색 (녹색), TRITC 덱스 트란 (적색) 표시와 차 항체로 표지하지 (A) 손상되지 않은 세포의 모든 채널 (오버레이)의 병합, (B) 부상 세포를 복구 허용 칼슘의 존재, 및 (C), 칼슘의 부재 고칠 수 부상 된 세포. 스케일 바 10 μm의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 레이저 부상에 대한 응답으로 리소좀 세포 외 유출의 실시간 영상은. FITC 덱스 트란 표시 리소좀과 세포는 칼슘의 존재 펄스 레이저에 의해 손상되었다. (A)의 셀 경계에 해당부상이 (녹색) 설명되어 있습니다 : 왼쪽 패널 - 시야 부상하기 전에, 가운데 패널 - 부상과 오른쪽 패널 이전 TIRF - 부상 후 TIRF 105의. 부상의 사이트는 시안 상자와 BE 패널에 없습니다 내 흰색 / 보라색 상자와 색 원으로 표시 대표적인 영역으로 표시됩니다. 전체 세포 이미지의 소포의 색상 (그레이, 오렌지와 블루가) 개별 리소좀의 이미지에 확대의 색상에 해당합니다. (B) 왼쪽 패널은 부상 후 모집 소포의 FITC 형광의 ΔF/F0 값에 대한 그래프를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 부상 전에 소포 (-2.5들), prefusion (102.5 초), 퓨전 (104.8들)과 postfusion (107.1들)의 스냅 샷을 보여줍니다. (C) 왼쪽 패널은 이전의 부상에 도킹 소포의 FITC 형광의 ΔF/F0 값에 대한 그래프를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 부상 전에 소포 (-2.5들), prefusion (91 초), 퓨전 (93의)과 postfusion (94.5 초)의 스냅 샷을 보여줍니다. (<강한> D) 왼쪽 패널 ()으로 멀리 세포막에서 축 방향으로 이동하는 소포의 FITC 형광의 ΔF/F0 값에 대한 그래프를 보여줍니다. 오른쪽 패널 부상 (-2.5들) 전에 소포의 스냅 샷을 보여 주며, 59.3, 59.6 및 63.7의에서 막 주변의 다른 위치에서 부상 후. (8.7, 10.7, 11.9, 12.8 및 18.8의)에서 상해 (-2.5들) 전에 부상 후 다양한 위치에서 수평으로 세포막을 따라 이동 소포의 (E) 스냅 샷. 스케일 바 (A = 10 ㎛, B, C, D, E = 1 μm의). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
애니메이션 비디오 1 그림 2 . 칼슘의 존재 레이저 부상에 대한 응답으로 세포막 수리의 실시간 영상 (오렌지에 설명) 셀의 FM 염료 입력 펄스에 의해 부상칼슘의 존재하에 레이저. 영화는 2 초마다 획득 (200) 이미지를 나타냅니다. 셀은 프레임 (4) 후 (시안 사각형으로 표시된 부분)을 부상했다. 타임 스탬프는 시간의 시간을 보여줍니다 : 분 : 초 : 밀리 초 형식입니다. = 10 ㎛ 스케일 바.
애니메이션 비디오 2 그림 2 . 칼슘의 부재에 레이저 부상에 대한 응답으로 세포막 수리의 실시간 영상 칼슘의 부재에서 펄스 레이저에 의해 부상 (오렌지에 설명) 셀의 FM 염료 항목. 영화는 2 초마다 획득 (200) 이미지를 나타냅니다. 셀은 프레임 (4) 후 (시안 사각형으로 표시된 부분)을 부상했다. 타임 스탬프는 시간의 시간을 보여줍니다 : 분 : 초 : 밀리 초 형식입니다. = 10 ㎛ 스케일 바.
애니메이션 비디오 3 그림 4 : 리소좀 exocyt의 실시간 영상레이저 부상에 대한 응답으로 OSIS. 셀 리소좀의 다른 응답 펄스 레이저에 의해 부상 (, 녹색 비디오 3에 설명). 영화 / 초 5 프레임에 TIRF 현미경으로 획득 한 연속 시간 경과 이미지의 2 분을 나타냅니다. 시야 이미지는 매 20 초를 인수했다. 셀은이 비디오에 2 초에 (시안 상자로 표시) 부상했다. (그레이 오렌지와 블루) 컬러 원과 보라색 상자 세포 손상 후 자신의 다양한 운명을 보여주는 그림 4에 설명 된 리소좀과 애니메이션 동영상 4-7을 표시합니다. 타임 스탬프는 시간의 시간을 보여줍니다 : 분 : 초 : 밀리 초 형식입니다. = 10 ㎛ 스케일 바.
애니메이션 비디오 4 그림 4는 부상에 대한 응답으로 막에 채용되는 회색 원으로 표시 exocytic 리소좀을 보여줍니다. 이 비디오에 7 초 (5 초 후 부상)에 리소좀은 세포막에 채용되는다음 1 분 47 초에이 사이트에 융합. = 1mm 스케일 바.
애니메이션 영상 5도 4는 이전에이 사이트에 1 분 35 초에 부상 퓨즈 막에 고정 된 주황색 원으로 표시 exocytic 리소좀을 보여줍니다. = 1mm 스케일 바.
애니메이션 비디오 6 그림 4는 파란색 원으로 표시 리소좀 멀리 세포막에서 다음으로 이동하고 보여줍니다. = 1mm 스케일 바.
애니메이션 비디오 7 그림 4는 리소좀의 부상을 다음 위치 비디오 3 보라색 상자로 표시 셀의 영역을 보여줍니다 (흰색 원)은 알에게 이동세포막 옹. = 1mm 스케일 바.
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Discussion
생체 내에서 세포막 손상으로 인해 생리적 스트레스 요인의 다양성과 여러 가지 실험 방법이 모방하기 위해 개발되었습니다 발생합니다. 이러한 요리를 긁어 또는 좁은 구멍 주사기 9,10 통해 계대에 의해 부착 세포의 세포막을 손상 있습니다. 등의 부상에 따라 세포 현탁액 치유하고 그들이 일반적으로 조직에서와 마찬가지로 세포 외 기질을 준수하지. 이러한 기공 형성 독소의 사용과 같은 또 다른 화학적으로 콜레스테롤 등의 지질 추출에 의해 세포막을 변경, 따라서 생체 기계 부상 5 흉내 없습니다. 따라서, 세포 손상에 사용되는 방법은 수리 대응에 대해 배울 수있는 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 세포 손상의 선택에주의하지 만 운동뿐만 아니라, 생체 내에서 더 나은 기계적 손상을 모방 방법을 선택할 필요로한다. 이러한 접근 방법은 세포의 단층이 부상 스크래치 부상 (포함메스 또는 바늘)과 유리 구슬 상해 (부상이 부착 된 세포를 통해 압연 유리 구슬에 의해 발생되는 경우)에 의해. 이러한 접근 방법은 잘 한꺼번에 세포를 손상에 적합하지만, 세포막 복구 프로세스의 실시간 영상에 순종하지 않습니다. 충격 지점에서 지역화 잘 통제 부상을 만들 수있는 미세 바늘 및 펄스 레이저의 사용은 생체 내에서 기계적 외상을 모방하고 수리 응답의 실시간 영상 의무가 있지만, 한 번에 하나의 셀의 수리에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 펄스 레이저 부상 방식은 막 손상은 지질 막에 이러한 photoxidative 및 광열 손상 등 nonphysiological 효과를 유도하는 것으로 알려져 국소 가열에 의해 발생 nonpulsed 레이저와 세포막의 확장 된 방사선의 이용과 구별되는 것을 주목할 가치가있다 과 세포질 구성 요소 11.
여기에 설명 된 프로토콜은 하나의 O의 전위를 활용 허용유리 구슬의 사용에 의존하고있는 능력, 반응 속도 및 마이크로 크기의 손상 후 세포막의 수리에 관련된 세포 내 인신 매매를 모니터링하기위한 지역화 부상 방식 (펄스 레이저) 중 하나 F 한꺼번에 부상 방식. 이러한 접근 방법은 상호를 무료로 이용하실 수 있습니다 - 대량 부상은 수리 능력과 그와 관련된 세포 내 인신 매매의 적자를 식별하는 세포의 인구를 사용 할 수 있습니다. 각각의 세포에 수리의 실시간 시각화를 지원함으로써, 레이저 부상 방식은 세포막 수리의 단계와 세포 내 어떤 이벤트가 수리 적자와 연관된 식별 할 수 있습니다. 이러한 접근 방법은 포유 동물 및 무척추 동물 유기체 7,12,13에서 세포막 수리를 모니터링하는 데 사용되었다. 실험의 필요에 따라 두 가지 방법 중 하나가 단독으로 사용될 수있다. 수리 적자의 성격을 알 수 또는 세포 내 메커니즘은 t에 관여하지 않습니다 그러나,이러한 접근 방법의 조합을 사용하여, 알려져 있지 그의 처리에 유용하다.
때문에 기반의 엔드 포인트 샘플 세포 손상 분석 사이에 부상 세포의 수에있는 고유의 변동성에 독립적으로 모든 수리 관리 부상 세포 및 복구에 실패하는 사람들을 식별 할 필요가있다. 우리가 여기에서 기술 한 유리 구슬 부상 접근 방식은 이러한 세포를 식별 할 수 있습니다. 부상 유리 구슬을 수행 할 때 그 자체가 중성이다 부상 손상균의 수를 최대화하기 위해 노력하는 동안 그래서 세포가 여러 안타을받지 않는 것이 중요하다. 반복되는 부상 세포 (수리에 약한 것을 선택적으로 사람들은) 절차를 수행하는 동안 죽을 커버 슬립에서 분리하게됩니다 때문에 이것은 중요합니다. 이 수리에 실패 세포의 과소 평가 될 것이다. 어떤 새로운 부상을 제거하는 커버 슬립을 처리하고 세척 중에 유리 구슬의 흔들림을 방지하는 것도 중요하다빨간색 염색 (거짓 양성 세포)가 발생합니다. 부상에 대한 이러한 접근 방식은 또한 리소좀 관련 막 단백질 1 (램프 1) 여기를 입증 한 바와 같이, 그 단백질의 세포 표면 전위에 대한 세포의 인구를 모니터링 할 수 있습니다. 면역 형광 만이 세포 표면 단백질 지역화를 모니터링 할 때 중요한 요건은 고정 전에 관심 immunolabel 세포 단백질의 세포 외 도메인에 결합하는 항체를 사용하는 것이다. 이 손상되지 않은 세포 또는 세포의 개체군 사이 손상균의 세포막에서 LAMP1 레벨을 비교한다. 이 프로토콜을 이용하여 LAMP1 도시되었지만, 단백질의 세포 외 도메인에 특이적인 항체가 보유하는 임의의 다른 단백질에 적용될 수있다. 부상 발생 리소좀 세포 외 유출은 리소좀 세포 외 유출의 (부상에 의해 실행되지 않음)과 유사한 기저 속도가 설립되지 않은 두 개의 세포 라인을 비교해야하는 경우, 손상되지 않은 세포에 대한 세포 표면 램프 1 염색도 측정해야한다. 이를 위해 추가 샘플은 단지 9 단계에서 세포가 차 항체와 함께 배양한다 제외한 샘플 C2로 처리됩니다. 이것은 리소좀 세포 외 유출의 기저 속도의 측정 값을 제공 할 것이다.
레이저 부상 프로토콜의 세포막은 고강도 단일 광자 나노초 펄스 레이저에 의해 손상된다. 부상은 형광 증가 바인딩 endomembrane에 따라 (예를 들면 FM 1-43) 세포 impermeant 염료의 존재하에 수행된다. 따라서 세포 관련 염료의 형광을 다음 것은 시간이 3을 치료하는 세포에 의해 취해진 조치를 제공합니다. 레이저 부상 FM 염료 형광의 증가의 결과로, 세포를 입력 endomembranes을 결합하는 FM 염료가 발생합니다. 손상된 세포막의 수리 셀로 상기 염료 진입을 방해. 따라서, 셀에 염료를 복구하는 데 실패하는 동안 수리, 염료의 형광, 고원에 도달 셀형광은 지속적으로 증가한다.
세포막 수리 및 개인 개별 세포 내 사건의 생균 이미징 잡음비 하이 신호에서 세포막 모니터링을 필요로한다. 전반사 형광 (TIRF) 현미경 잡음비 14-16에 하이 신호에서 촬상 세포 표면 이벤트 적합 접근법이다. 이 몇개 시판 TIRF 시스템이며 생균 촬상 호환 이러한 시스템 중 하나가 사용될 수있다. 또한, 우리는 다른 곳에서 (17, 18) 집에서 TIRF 현미경을 설정하는 방법을 설명했다. TIRF 설치 독립적 이전에 세포 내 소포 다양한 운명을 모니터링하고 부상 다음 허용 방식을 확립 할 필요가있다. 다른 곳에서 우리는 각 리소좀 (19)의 융합 모니터링 성격, 기간 및 정도를 허용 이러한 접근 방식의 토론을 제공했다. 부상을 모니터링하려면 lysoso 표시 FITC-덱스 트란의 세포 외 유출을 트리거프로토콜 4 관찰하는 핵심 기능에 설명 된 MES는 깜박입니다. 플래시는 형광의 측면 확산의 결과로 하나의 단계에서 개별 리소좀에 포함 된 FITC 덱스 트란의 방출을 포함한다. 각 플래시는 일반적으로 하나의 리소좀의 exocytic 융합을 나타내는 반면, 많은 리소좀이 융합 사이트 이전에에 존재하는 방법을 모니터링하고 플래시에 따라이를 설정하는 것이 중요합니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 프랑스어 근육질 영양 장애 협회 (AFM)에 의해 AD에 건강 보조금 AR055686과 AR060836 및 박사 학위 취득 후 친교의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 이 연구에서 사용 된 세포 이미징 시설은 건강 보조금 HD040677의 국립 연구소에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
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