Изображений Клеточная мембрана Травмы и субклеточных процессов, связанных с Ремонт

Summary

Процесс исцеления раненых клеток включает оборотом специфических белков и субклеточных отсеков в месте повреждения клеточных мембран. Этот протокол описывает анализы, чтобы контролировать эти процессы.

Abstract

Способность поврежденных клеток, чтобы исцелить является фундаментальным клеточный процесс, но клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в лечебных ранения клеток изучены плохо. Вот анализы описаны контролировать способность и кинетики заживления культивируемых клеток следующий локализованной травмы. Первый протокол описывает конечную точку подхода, основанного одновременно оценить ремонта клеточной мембраны способность сотен клеток. Второй протокол описывает реального времени подход изображений для мониторинга кинетики клеточной мембраны ремонта в отдельных камерах следующие локализованной травмы с помощью импульсного лазера. Как целебные поврежденных клеток включает оборотом специфических белков и субклеточных отсеков в месте повреждения, третий протокол описывает использование подхода выше конечная точка основе для оценки один такой случай торговли людьми (лизосомные экзоцитоза) в сотнях клеток поврежденных одновременно и последний протокол описывает использование импульсного лазерного травмы вместе с TIRF микроскопиикопия отслеживать динамику отдельных субклеточных отсеков в поврежденных клеток с высоким пространственным и временным разрешением. В то время как протоколы здесь описано применение этих подходов для изучения связи между ремонта клеточных мембран и лизосом экзоцитоза в культивируемых клетках мышц, они могут быть применены как таковой для любой другой клейкого культуры клеток и субклеточном компартменте выбора.

Introduction

Клеточная мембрана поддерживает целостность клеток, обеспечивая барьер между клеткой и внеклеточной среде. Химические, электрические или механические стимул, который превышает нормальное физиологическое порог, а также присутствие вторжение болезнетворных микроорганизмов может каждый привести к травме клеточную мембрану и вызвать последующую клеточный ответ, чтобы восстановить эту травму. Чтобы выжить эти повреждения к клеточной мембране, клетки обладают эффективным механизмом для ремонта. Этот механизм зависит кальция и происходит путем оборота белков, таких как аннексинов и MG53 среди других, а также субклеточных отсеков, такие как эндосомах, лизосом, аппарата Гольджи, полученных пузырьков и митохондрий потерпевшей клеточной мембраны ^1-7. Тем не менее, детали последовательности молекулярных и субклеточных событий, участвующих в ремонте поврежденной клеточной мембраны еще недостаточно изучена.

Ответ ремонта клеток могут быть отделены в ухолы и поздние ответы. Ранние реакции, которые происходят в течение нескольких секунд, чтобы минут масштабе времени, чрезвычайно важны в определении характера конце ответов ведущих успешного ремонта клеток или гибели клеток. Конец точечные анализы, основанные на объемной биохимического и клеточного анализа помогли установить причастность молекулярных и клеточных процессов в ремонте. Но, в связи с неоднородностью и быстроты реакции сотовой ремонта, конечная точка анализы не в состоянии обеспечить кинетические и пространственные детали последовательности событий, приведших к ремонту. Подходы, которые позволяют контролируемого травму клеточной мембраны и позволяют контролировать ремонт клеточной мембраны и связанные субклеточных ответов на высоким пространственным и временным разрешением, идеально подходят для таких исследований. Здесь, такие подходы были представлены. Два из протоколов описать подходы для мониторинга в режиме реального времени кинетики клеточной мембраны ремонта и субклеточных реакции, связанные с процессом в живых клетках ремонта следующие лазерный InjУри. В дополнение к этих анализах, основанных изображений живых клеток, конечная точка анализы также были описаны которые обеспечивают меру, основанную население для мониторинга ремонта отдельных клеток и соответствующих ответов субклеточных. Чтобы продемонстрировать свою полезность эти подходы были использованы для мониторинга торговли людьми и экзоцитоза лизосом в ответ на повреждение клеточных мембран.

Protocol

1. Изображений Клеточная мембрана Ремонт Использование Bulk (бисер) Ранение

Этот протокол позволяет отдельно маркировки поврежденных клеток и те, которые не заживают. Количественная эти популяции клеток требует использования трех условий: 1. Тест (C1) - Клеткам давали ремонтировать в присутствии ионов Са ^{2 +,} 2. Контроль 1 (без травмы C2) - Клетки инкубируют в присутствии ^{Са2 +,} но не пострадал, и 3. Контроль 2 (без ремонта С3) - клетки позволили отремонтировать в отсутствие Ca ^{2 +.}

1. Рост клеток до> 50% слияния на трех стерильных покровные и мыть C1 и C2 дважды CIM при 37 ° С и С3 с PBS при 37 ° С и передачи покровные силиконовых уплотнительных колец.
2. Добавить 100 мкл нагретого FITC Декстрана в CIM на С1 и С2 или в ФБР на С3.
3. Повредить плазматическую мембрану на С1 и С3, осторожно прокатки 40 мг стеклянных шариков над покровным при комнатной температуре вручную наклона назад и покровныед. 6-8 раз под углом 30 °.
   Примечание: Для легкой травмой, обеспечить стеклянные шарики распределены равномерно, таким образом минимизируя повторных травм. Для улучшения воспроизводимости травмы между образцами, одновременно проводить в бисер травмы различных образцов для сравнения.
4. Избежать дальнейшей прокатки шариков, передать все покровные в инкубаторе 37 ° C при температуре окружающей CO ₂ и позволить ремонт проводили в течение 5 мин.
5. Не выпуская шарики рулон, удаления стеклянных шариков и FITC декстран промывкой CIM (С1 и С2) или PBS (С3) при 37 ° С
6. Место покровные назад на кольце O и добавить 100 мкл нагретого лизина фиксируемой TRITC Декстрана в CIM на С1 и С2 или в PBS на С3.
7. Инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин при комнатной CO _2.
8. Вымойте покровные дважды нагретого CIM и исправить с 4% PFA в течение 10 мин при комнатной температуре.
9. Промыть два раза с PBS и инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре в Hoechst краситель.
10. Вымойте SAMPLэс дважды PBS, крепление на слайде с помощью монтажных средств массовой информации и изображений клеток с использованием эпифлюорисцентной микроскопа.
11. Используйте клетки от С2 для определения фона красный и зеленый интенсивность окрашивания и использовать это значение для порога красный и зеленый каналы для всех образцов (С1-С3).
12. Оценка общего количества клеток, которые а) зеленый (ранения и ремонт) и б) красный или оба красного и зеленого (ранения, но не смогли отремонтировать) в образцах C1 и C3.
13. Граф> 100 зелень клетки для каждого условия и выражают долю клеток, которые не смогли восстановить в процентах от всех клеток поврежденных (зеленый и красный).

2. Живая съемка кинетики клеточной мембраны Ремонт итогам Лазерная травмы

1. Вымойте клеток с нагретого МГК, а затем положить покровное в МГК с FM красителя.
2. Поместите покровное в держателе в верхней этап инкубаторе, поддерживаемой при 37 ° С.
3. Выбор 1-2 мм ² область клеточной мембраны, и облучать для <; 10 мс с импульсного лазера. Ослабление мощности лазера с помощью программного обеспечения до 40-50% от пиковой мощности. Оптимальное мощность позволяет последовательно, но несмертельную травмы, и это должно быть определено методом проб и ошибок для каждого отдельного инструмента и клеточной линии используется.
4. Для мониторинга ремонт, изображение каждые 10 сек в эпифлуоресцентной и светлого, начиная до травмы и продолжаться в течение 3-5 мин после травмы.
   Примечание: Для без контроля ремонта, повторите шаги 2.1-2.4 с клетки получили ранения в PBS, содержащий FM красителя.
5. Для количественной оценки кинетики ремонта, измерения флуоресценции красителя FM сотовый и сюжет изменение интенсивности (ΔF/F0) в ходе визуализации. Эти данные должны быть усреднены в течение более 10 клеток в каждом состоянии и нанесены как усредненное или значение индивидуальной клетки, поскольку это необходимо.

3. Изображений Bulk (бисер) нарушений, индуцированных Лизосомные Экзоцитоз

Образцы включают следующие клеток, выращенных в> 50%слияние: 1. Тест (С1) - Клетки позволили восстановить в присутствии Ca ^{2 +,} 2. Контроль 1 (C2; Нет травмы) - Ячейки ни раненых, ни инкубировали с первичным антителом, и 3. Контроль 2 (С3; Нет ремонт) - Клетки позволили восстановить в отсутствие Ca ^{2 +.}

1. Wash покровные C1 и C2 дважды CIM при 37 ° С и С3 с PBS при 37 ° С и передавать их на силиконовых уплотнительных колец.
2. Добавить 100 мкл нагретого лизина фиксируемой TRITC декстрана в CIM на C1 и C2 и в ФБР на С3.
3. Ранить плазматическую мембрану на С1 и С3, как в пункте 1.3.
4. Избежать дальнейшей прокатки шариков, передать все покровные в инкубаторе 37 ° C при температуре окружающей CO ₂ и позволить ремонт проводили в течение 5 мин.
5. Удалите стеклянных шариков и TRITC декстран промывкой покровные в холодной среде роста, снова гарантируя, что ни сворачивание стеклянных шариков на клетки.
6. Промыть покровные дважды среде холодной роста и трансфер в уплотнительных колец.
7. Для С1 и С3, Добавить 100 мкл крысы анти мыши ЛАМПА1 антител в холодных полной среды роста и добавить холодную, в комплекте СМИ роста С2.
8. Чтобы разрешить связывания антител инкубировать покровные в течение 30 мин при 4 ° С.
9. Вымойте покровные три раза холодным CIM и исправить все покровные с 4% PFA в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем промыть 3 раза с CIM.
10. Инкубируйте все покровные в 100 мкл блокирующего раствора в течение 15 мин при комнатной температуре
11. Инкубируйте все покровные в 100 мкл Alexa Fluor 488 против крысиного антитела в течение 15 мин при 4 ° С.
12. Промыть два раза с PBS и инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре в Hoechst.
13. Вымойте клетки дважды с PBS, крепление на слайде с помощью монтажных средств массовой информации и изображения с помощью эпифлюорисцентной микроскопа.
14. Использование изображений C2 клеток, определения неспецифической фоновое окрашивание в красный (TRITC декстрана) и зеленый (Alexa Fluor 488 антитело) каналов и использовать эти фоновые окрашивания значения порога красный и зеленый каналы для всех образцов (С1-С3). </ Li>
15. Используйте> 100 красные помечены клетки от С1 и С3 для измерения интенсивности ЛАМПА1 окрашивания (зеленый) в поврежденных клетках. Для успешного эксперимента ЛАМПА1 окрашивание в клетках С3 будет значительно ниже, чем в клетках от С1.

4. Живая съемка клеточной мембраны травмы Срабатывает субклеточных торговлей

1. Флуоресцентно маркировать Отсек интерес путем трансфекции соответствующего репортера (например CD63-GFP для лизосом ⁸⁾ или с помощью флуоресцентных красителей ^9.
2. Для маркировки лизосом с флуоресцентным красителем, инкубировать клеток, выращенных в 50% слияния в питательной среде, содержащей FITC-декстран
3. Разрешить декстран быть эндоцитарных в течение 2 часов (или больше по мере необходимости в течение достаточного эндосом маркировки с декстраном по линии клеток интереса) в CO _{2-инкубаторе.}
4. Вымойте клеток с предварительно нагретой питательной среды и инкубировать в нем в течение 2 часов в СО _{2-инкубатор,} чтобы всеэндоцитозу декстран накапливаться в лизосом.
5. Перед изображений, промыть покровное в предварительно нагретой CIM и смонтировать в держателе покровное на стадии верхней инкубаторе при температуре 37 ° С.
6. Провести Widefield (для передвижения по всей клетке) или TIRF (движение на поверхности клетки и экзоцитоза) изображений - клетки, которые не имеют переполненные FITC декстран меченые лизосом идеально подходят для работы с изображениями движение и экзоцитоз отдельных лизосом.
7. Выравнивание TIRF лазеры для визуализации микроскопа: Используйте 60X или 100X объектив с> 1,45 NA. Настройте угол для падающего TIRF лазерного луча с помощью подход производителя.
8. Ранить клеточную мембрану путем облучения небольшой (1-2 мм ²⁾ область для <100 мс, с импульсным лазером на 40-50% затухания.
9. Для наблюдения за ответ лизосом в ячейку травмы, изображения клеток в 4-6 кадров / с, по крайней мере 2 мин или больше в зависимости от динамики экзоцитоза в клетках интерес.

Representative Results

Протоколы, описанные здесь, для работы с изображениями одного клеток являются контролировать способность и кинетика клеточных мембран ремонта (Протоколы 1 и 2) и субклеточной торговлей и слияние лизосом во время ремонта (Протоколы 3 и 4).

Протокол 1 показывает объемную анализа, который позволяет маркировка всех поврежденных клеток и определяя те поврежденные клетки, которые не удалось восстановить. Результаты на фигуре 1 показывают, что в то время как неповрежденной клетки (фиг.1А) остаются без маркировки, клетки поврежденные на стеклянных шариков в присутствии декстрана FITC помечены зеленый (фиг. 1В и 1С). Когда клетки могут отремонтировать в присутствии ионов Са ^{2 +} большинство пострадавших (зеленый) клеток удается восстановить и не отмечены (красный) по TRITC декстрана (рис. 1В). Когда клетки могут ремонтировать в отсутствие ^{Са2 +,} большинство из поврежденных клеток также помечены красным цветом на TRITC декстрана (FiGure 1С). Клетки, которые никогда не были ранены не показывают маркировку с декстран TRITC. Таким образом, в той или иной выборке количественной количество клеток только помечены зеленым обеспечивает меру клеток, которые были ранены стеклянных шариков и отремонтированных, в то время как количественной число двойных (красный и зеленый) меченых клеток обеспечивает меру клеток, которые не для ремонта от травм.

Протокол 2 описывает оценки кинетики клеточной мембраны ремонта путем мониторинга ввод FM красителя в клетке. Когда инкубировали в FM красителя, неповрежденные клетки показывают клеточной мембраны окрашивания (рис. 2 до травмы WF панели). После локализованной лазерной травмы клеточной мембраны FM краситель начинает ввод в клетку и обязательным endomembranes, что вызывает резкое увеличение красителя флуоресценции FM (рис. 2В). Поскольку возможности клеточной мембраны для ремонта следующий лазерный травмы зависит от Ca ^{2 +,} клетки потерпевшего в присутствии Ca ^{2 +} является абле для ремонта, который вызывает запись на FM красителя (и, следовательно, увеличение флуоресценции красителя сотовой FM) прекратить в течение минуты после травмы (рис. 2А, верхняя панель, рис. 2В, синей линии, и анимированные видео 1 и Рисунок 2). Напротив, клетка позволило отремонтировать в отсутствие Ca ^{2 +,} не удается восстановить, что приводит к записи непрерывного красителя и, следовательно, постоянный рост флуоресценции красителя FM даже 4 мин после травмы (рис. 2А, нижняя панель, 2В, Красная линия и анимированные видео 2 и Рисунок 2). Таким образом, клеточная мембрана ремонт приводит к плато в окрашивания красителя FM, в то время как отсутствие клеточной мембраны ремонта вызывает запись непрерывный краситель, который не сможет плато.

Протокол 3 описывает использование основная (стеклянная бусина) травмы подхода для мониторинга поверхности клетки перемещение везикул и белков в ответ на повреждение. Здесь йе клетки получают травмы в присутствии TRITC декстрана, таким образом, в то время как неповрежденной клетки не помечены красным (фиг.3А), но все поврежденные клетки помечены красным цветом (фиг. 3В и 3С). Неповрежденной клетки, которые не обработанные маркировки первичной шоу антитела уровня фона для клеточной поверхности ЛАМПА1 (3А ЛАМПА1 панель). Однако, когда клетки получают травмы и позволили залечить в присутствии кальция, лизосомы пройти экзоцитоза, и поэтому существует повышенный уровень окрашивания ЛАМПА1 на поверхности поврежденных (красный помечены) клеток (фиг. 3б). Это увеличение клеточной поверхности ЛАМПА1 маркировки значительно ниже в клетках, которым разрешено заживают в отсутствие кальция (фиг.3С). Это демонстрирует кальция регулируется характер лизосом экзоцитоза и, следовательно, внешний вид поверхности ЛАМПА1. Таким образом, и количественно оценить количество клеток с окрашиванием ЛАМПА1 поверхности высокого клеток, а также измерения уровняклеточной поверхности ЛАМПА1 окрашивания на отдельных поврежденных клеток, принимать меры для способности клеток для прохождения травмы срабатывает лизосом экзоцитоза.

Протокол 4 может быть использован для непосредственного мониторинга кинетики, характер и расположение индивидуального лизосом синтеза в ответ на повреждение клеточных мембран. Клетки являются потерпевшими в результате импульсного лазера и клеточной поверхности лизосом изображаются на TIRF изображений, что позволяет травмы мониторинга срабатывает экзоцитоза лизосом в отдельных клетках (рис. 4А и анимированные видео 3). 4А показана ячейка (описанной в зеленый) визуально определено фазовый контраст изображения (слева) и TIRF микроскопии (средняя панель), до травмы. Правая панель показывает TIRF изображение того же ячейки 105 сек после травмы. Различные травмы вызвали ответы лизосом описаны в рисунках 4B-E. 4В показывает травмы срабатывает вербовку лизосом (отмеченысерым круга) к клеточной мембране с последующей экзоцитоза (анимированные видео 4 и рисунок 4). Это лизосом не видно в TIRF изображения до травмы (рис. 4B: панель -2.5 сек), но после травмы лизосома прибывает на клеточной мембране и становится обнаружить (рис. 4B: панель 102,5 с), как пузырек перемещается ближе к Клеточная мембрана лучше восторг от освещения TIRF и флуоресценция декстран лизосомные FITC достигает максимального значения, когда слияние пор открывает вызывая нейтрализацию лизосом рН и, таким образом dequenching из FITC декстрана флуоресценции (рис. 4В: панель 104,8 ы). Впоследствии декстран выгружают из пузырька к внешней части клетки, вызывая флуоресценции FITC, чтобы распространить в поперечном направлении и флуоресценции пузырьков постепенно уменьшаться (фиг.4В: Панель 107,1 ы). Во второй категории, лизосом (отмечен оранжевым кругом, анимированные Vidео 5 Рисунок 4) присутствует до травмы (рис. 4С: панель -2.5 ы), она остается там на мембране (рис. 4С: панель 91 с) до везикул exocytoses. Здесь лизосома экзоцитозу частично (рис. 4С: панель 93 с) оставив позади какой-то FITC декстрана в пузырьке следующие слияния (рис. 4С: 94,5 с). Третий и четвертый категории везикул не сливаются с мембраной. Лизосом показано на рисунке 4D (отмечен синим кругом) движется в осевом направлении и от клеточной мембраны (анимационный видео 6 и Рисунок 4). Это лизосом не видно на клеточной мембране до травмы (рис. 4D: панель -2.5 ов), но при приближении клеточную мембрану после травмы она становится видимой на TIRF микроскопии (рис. 4D: панель 59,3 с). Он достиг ближе к клеточной мембране (рис. 4D: панель 59,6 с), а затем уходит без слияния (рис. 4D: рАнель 63,7 с). Лизосом в четвертой категории прибывает близко к мембране и движется горизонтально вдоль клеточной мембраны (области, отмеченной фиолетовую коробку на рисунке 4A, анимированные видео 7 и Рисунок 4). Рисунок 4E (панель 8,7 с) показывает приход лизосом , который затем перемещается вдоль мембраны и их можно увидеть в последовательности изображений после травмы (рис. 4E: Панели 10,7, 11,9, 12,8, 18,8 ы). На основании приведенного выше описания количественной оценки декстрана интенсивность FITC флуоресценции каждого лизосом - закрепления тонера (Цифры 4В и 4С), двигаясь вдоль оси (рис. 4D) или перемещение по горизонтали (рис. 4E) позволяет определить реакцию лизосом на травму.

Рисунок 1. . Массовая клеток травмы мембрана на стеклянные бусы Изображения показывают ядерного окрашивания (Hoechst, левая панель), травмы (зеленый окрашивание - FITC декстран), Неустраненные клетки (красный окрашивание - TRITC декстран), и объединены изображения (слияния). (А) неповрежденной клетки в присутствии кальция, (B) поврежденных клеток в присутствии кальция, и (C) поврежденных клеток в отсутствие кальция. Шкала бар 10 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2. . Настоящее время формирования изображений клеточной мембраны ремонта в ответ на лазерной травмы (А) Изображение клеток (с оранжевым контуром) до травмы [левая панель - светлое поле (BF) иэпифлуоресцентная (эпи)], 5 сек, 1 мин, и 4 мин после травмы. Сайт травмы обозначается белой стрелкой. Верхняя панель показывает клетка ранения в присутствии кальция и нижней панели показана ячейка ранения в отсутствие кальция. (В) График, показывающий изменение красителя окрашивания FM (ΔF/F0) клеток в панели А раненых в присутствии кальция (синий) или в отсутствие кальция (красный). В регионе, где FM-краситель входит и, следовательно флуоресценции маркировки увеличилось был использован для количественной оценки интенсивности флуоресценции. Шкала бар = 10 мкм). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3. Изображений лизосомные экзоцитоза в ответ на объемной травмы. Изображения показывают ядерное окрашивание Хехст (синий), на поверхности клеток ЛАМПА1 окрашивание (зеленый), TRITC декстран (красный) и объединить всех каналов (наложения) (а) пострадал клеток не меченных первичных антител, (Б) Травмированные клетки позволили ремонта в присутствии кальция, и (C) поврежденные клетки позволили восстановить в отсутствие кальция. Шкала бар 10 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4. В режиме реального времени визуализации лизосом экзоцитоза в ответ на лазерной травмы. Клетки с FITC декстрана меченых лизосом были ранены импульсного лазера в присутствии кальция. (А) Граница ячейки,был ранен изложена (зеленым цветом): левая панель - светлое поле до травмы, средняя панель - TIRF до травмы и правой панели - TIRF 105 с после травмы. Сайт травмы отмечен коробке голубого и представительного зону, обозначенную белый / пурпурный коробки и цветные круги в уменьшили в панелях BE. Цвет пузырька в клеточной изображение всего (серый, оранжевый и синий) соответствует цвету в увеличении масштаба изображения отдельных лизосом. (В) Левая панель показывает график для значения ΔF/F0 для FITC флуоресценции пузырька набранных после травмы. Правая панель показывает снимки пузырька до травмы (-2,5 с), prefusion (102,5 ов), синтеза (104,8 с) и postfusion (107,1 ов). (С) Левая панель показывает график для значения ΔF/F0 для FITC флуоресценции пузырька пристыкован до травмы. Правая панель показывает снимки пузырька до травмы (-2,5 с), prefusion (91 с), синтеза (93 сек) и postfusion (94,5 с). (<сильный> D) Левая панель показывает график для значения ΔF/F0 для FITC флуоресценции пузырька, движущегося по оси (к и от клеточной мембраны). Правая панель показывает снимки пузырька до травмы (-2,5 с), и после травмы в другом положении вблизи мембраны при 59,3, 59,6 и 63,7 с. (E) Снимки пузырька, который двигался горизонтально вдоль клеточной мембраны в различных положениях до травмы (-2,5 с) и после травмы в (8.7, 10.7, 11.9, 12.8 и 18.8 с). Шкала бар (= 10 мкм, B, C, D, E = 1 мкм). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Анимированные видео 1 Рисунок 2: . реального времени визуализации клеточных мембран ремонта в ответ на лазерной травмы в присутствии кальция запись краситель FM в ячейке (с оранжевым контуром) ранен импульсноголазер в присутствии кальция. Фильм представляет 200 изображений, полученных раз в 2 сек. Ячейка был ранен (регион, на который указывает голубой квадрат) после раме 4. Отметка времени показывает время в часы: минуты: секунды: мс формате. Шкала бар = 10 мкм.

Анимированные видео 2 Рисунок 2: . реального времени визуализации клеточных мембран ремонта в ответ на лазерной травмы в отсутствие кальция запись FM красителя в клетке (с оранжевым контуром) ранен импульсного лазера в отсутствие кальция. Фильм представляет 200 изображений, полученных раз в 2 сек. Ячейка был ранен (регион, на который указывает голубой квадрат) после раме 4. Отметка времени показывает время в часы: минуты: секунды: мс формате. Шкала бар = 10 мкм.

Анимированные видео 3 Рисунок 4: В режиме реального времени визуализации лизосом exocytОсис в ответ на лазерной травмы. Различные ответы лизосом в клетке (они изложены в зеленый, Видео 3) ранения с помощью импульсного лазера. Фильм представляет 2 мин последовательных промежуток времени изображений, полученных с TIRF микроскопии со скоростью 5 кадров / сек. Светлопольные изображения были получены каждые 20 сек. Ячейка был ранен (обозначается коробки голубой) на 2 сек в этом видео. Цветные круги (серый, оранжевый и синий) и фиолетовый коробка отметить лизосом, описанные на рисунке 4 и анимационные ролики 4-7, демонстрируя свои разнообразные судьбы после травмы клеток. Отметка времени показывает время в часы: минуты: секунды: мс формате. Шкала бар = 10 мкм.

Анимированные видео 4 рисунок 4 показывает exocytic лизосому отмечен серого круга, который, набранных на мембрану в ответ на повреждение. В 7 сек (5 сек после травмы) в этом видео лизосома получает работу на клеточной мембранеа затем предохранители на этом сайте в 1 мин и 47 сек. Шкала бар = 1 мм.

Анимированные видео 5 рисунок 4 показывает exocytic лизосому отмечен оранжевым круга, который был пристыкован в мембране до травмы и предохранителей на этом сайте 1 мин и 35 сек. Шкала бар = 1 мм.

Анимированные видео 6 рисунок 4 показывает лизосом, отмеченные синим кругом движется в направлении, а затем от клеточной мембраны. Шкала бар = 1 мм.

Анимированные видео 7 рис. 4 показана область клетки, отмеченной фиолетовую коробку в видео 3, где после травмы один из лизосом (белый круг) движется AlОнг клеточная мембрана. Шкала бар = 1 мм.

Discussion

Травмы Клеточная мембрана в естественных условиях происходит из-за различных физиологических факторов стресса и несколько экспериментальных подходов были разработаны, чтобы имитировать их. К ним относятся ранив клеточную мембрану прилипшие клетки, очищая их от блюдо или пассажей через узкий отверстие шприца ^9,10. После таких травм клетки исцелить во взвешенном состоянии и не придерживался внеклеточного матрикса как они обычно делают в ткани. Третьи, такие как использование пор формирования токсинов химически изменить клеточную мембрану путем извлечения липидов, таких как холестерин, таким образом, не подражая в естественных механических повреждений ^5. Таким образом, метод, используемый для повреждения клеток может повлиять то, что можно узнать о реакции ремонта. Это требует соблюдать осторожность не только в выборе повреждение клеток анализа, но и выбирая подходы, которые лучше имитируют механические травмы в естественных условиях. Такие подходы включают царапинам травмы (где монослой клеток травмированногоскальпелем или иглой) и стеклянные бусины травмы (где травмы вызвана стеклянных шариков пролонгации прикрепленных клеток). Эти подходы хорошо подходит для ранив клетки в массовом порядке, но не поддаются реального времени визуализации клеточных мембран процесса ремонта. Использование микроиголок и импульсных лазеров для создания локализованных и хорошо контролируемых травмы в точке удара имитировать механическое и травматическое повреждение в естественных условиях и поддаются реального времени визуализации ответа ремонта, но дает представление ремонта одной ячейки в то время. Стоит отметить, что импульсный подход лазерной травмы отличается от использования расширенного облучения клеточной мембраны с nonpulsed лазеров, где травма мембрана, вызванных локальному нагреву, который известен, чтобы побудить нефизиологических эффекты, такие как photoxidative и фототермической повреждения мембранных липидов и цитозольные компоненты ^11.

Протоколы, описанные здесь, позволяют использование потенциала Один ое массово травмы подход, который основывается на использовании стеклянных шариков и один из локализованной травмы подхода (импульсный лазер) для мониторинга способности, кинетики и субклеточной торговлей, участвующих в ремонте клеточной мембраны после травмы размера микрометра. Эти подходы дополняют друг друга - основная травма позволяет использовать популяцию клеток для выявления дефицита в ремонтной способности и субклеточном торговли, связанные с ним. При включении в режиме реального времени визуализации ремонта в отдельных клетках, подход лазерной травмы позволяет выявить то, что шаг ремонта клеточных мембран и что субклеточная события связаны с дефицитом в ремонте. Этот подход был использован для мониторинга ремонт клеточной мембраны в млекопитающих и беспозвоночных организмов ^7,12,13. Исходя из потребностей эксперимента любой из этих двух подходов может быть использован сам по себе. Тем не менее, когда природа дефицита ремонта не известно или субклеточном механизм участвует в тего процесс не известны, с использованием комбинации этих подходов является полезным.

Из-за присущего изменчивости количества клеток поврежденных между образцами в конечной точке на основе повреждение клеток анализы надо самостоятельно определить все клетки, которые получили ранения, что удалось восстановить и те, которые не удалось восстановить. Травма подход стеклянная бусина мы описали здесь позволяет выявить эти клетки. При проведении бусины ранив важно, чтобы, делая усилие, чтобы максимизировать количество клеток травмированного травмы сами мягкий поэтому клетки не получают несколько хитов. Это важно, поскольку повторный вызовет повреждение клетки (выборочно те, которые бедны при ремонте) умереть и отключаться от покровного стекла во время процедуры. Это привело бы к недооценке клеток, которые не смогли восстановить. Важно также, чтобы избежать прокатки из стеклянных шариков в процессе обработки и промывки покровные, чтобы устранить любую новую травму которыйприведет к красной окраски (ложные положительные клетки). Такой подход за причинение вреда также позволяет осуществлять мониторинг популяции клеток для клеточной поверхности транслокации интерес белка, как это было продемонстрировано здесь для лизосом связано мембранного белка 1 (ЛАМПА1). При мониторинге только поверхность клетки, локализованные белки с помощью иммунофлуоресценции ключевым требованием является использование антител, которые связываются внеклеточный домен белка, представляющего интерес, и immunolabel клеток до фиксации. Это позволяет сравнения уровня ЛАМПА1 на клеточной мембране в поврежденных клеток с неповрежденных клеток или между различными популяциях клеток. Хотя этот протокол был проиллюстрирован с помощью ЛАМПА1, он может быть применен к любой другой белок выбора, для которого существует антитело, специфичное к внеклеточным доменом белка. Когда травма срабатывает лизосомные экзоцитоза необходимо сравнить между двух клеточных линий, которые не были установлены, имеют аналогичные базальную скорость (не срабатывает из-за травмы) из лизосом экзоцитоза, Клеточной поверхности LAMP1 окрашивание на неповрежденных клеток также должны быть измерены. Для этого дополнительный образец обрабатывают так же, как образец С2 исключением того, что на шаге 9 клетки должны быть инкубировали с первичным антителом. Это обеспечит меру базальной скорости лизосомного экзоцитоза.

Для протокола лазерной травмы клеточные мембраны являются потерпевшими в высокой интенсивности одного фотона нс импульсного лазера. Wounding осуществляется в присутствии клеток impermeant красителя флуоресценции которого увеличивается при связывании endomembrane (например, FM 1-43). Таким образом после флуоресценцию клеток, связанный краситель обеспечивает меру для времени, необходимого клеткой, чтобы исцелить ^3. Лазерная травмы вызывает FM красителя проникать в клетку и связывать endomembranes, в результате чего увеличению флуоресценции красителя FM. Ремонт поврежденного клеточной мембраны препятствует дальнейшему запись красителя в клетку. Таким образом, для ячейки, ремонт, флуоресценция красителя достигает плато, в то время как для ячейки, которые не удается восстановить красительфлуоресценции постоянно увеличивается.

Живых клеток изображений отдельных субклеточных событий, связанных с клеточной мембраны ремонта требует контроля клеточной мембраны при высокой сигнала к шуму. Всего флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) микроскопия является подход хорошо подходит для поверхностных изображений клеток событий на высоком Отношение сигнал-шум ^14-16. Есть несколько коммерчески доступные системы TIRF и любой из этих систем, совместимых с изображений живых клеток могут быть использованы. Кроме того, мы описали подходы для создания домашней TIRF микроскопы в другом месте ^17,18. Независимо от установки TIRF существует необходимость в разработке подходов, которые позволяют наблюдать различные судьбы субклеточных пузырьков до и после травмы. В другом месте мы предоставили обсуждение таких подходов, которые позволяют мониторинг характер, продолжительность и степень слияния каждого лизосом ^19. Для контроля травмы срабатывает экзоцитоз FITC-декстрана с надписью lysosoМЧС, описанные в протоколе 4 Ключевой особенностью наблюдать являются мигает. Вспышка включает высвобождение FITC декстрана, содержащейся в индивидуальной лизосомы в одну стадию в результате бокового распространения флуоресценции. Хотя каждый флэш обычно указывает exocytic слияние одной лизосом, важно установить путем наблюдения, сколько лизосом присутствуют на слияния сайте до и после вспышки.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS