Summary
התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה.
Abstract
היכולת של תאים נפצעו לרפא היא תהליך תאי בסיסי, אך מנגנונים תאיים ומולקולריים המעורבים בתאי ריפוי פצוע הם הבינו היטב. הנה מבחני מתוארים כדי לפקח על היכולת וקינטיקה של ריפוי של תאים בתרבית בעקבות פציעה מקומית. הפרוטוקול הראשון מתאר גישה מבוססת נקודת סיום כדי להעריך את יכולת תיקון קרום תא של מאות תאים בו זמנית. הפרוטוקול השני מתאר גישת הדמיה בזמן אמת כדי לפקח על קינטיקה של תיקון קרום תא בתאים בודדים בעקבות פציעה מקומית עם לייזר פעם. ככל שתאי ריפוי נפצע כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעה, הפרוטוקול השלישי מתאר את השימוש בגישה מבוססת נקודת סיום לעיל כדי להעריך אירוע אחד כזה סחר (exocytosis lysosomal) במאות תאים נפצעו בו זמנית והפרוטוקול האחרון מתאר את השימוש של פגיעת לייזר פעם יחד עם מיקרו TIRFעותק כדי לפקח על הדינמיקה של תאי subcellular בודדים בתאים שנפגעו ברזולוציה מרחבית ובזמן גבוה. בעוד הפרוטוקולים כאן מתארים את השימוש בגישות אלה כדי לחקור את הקשר בין תיקון קרום התא וexocytosis lysosomal בתאי שריר בתרבית, הם יכולים להיות מיושמים כאמורים לכל תא אחר חסיד תרבותי ותא subcellular של בחירה.
Introduction
קרום תא שומר על שלמותם של תאים על ידי מתן חיץ בין התא לבין סביבת החוץ תאית. גירוי כימי, חשמלי או מכאני שעולה על הסף הפיזיולוגי הנורמלי, כמו גם נוכחותם של פולשים גורמי מחלה יכול כל תוצאה בפגיעה בקרום התא ולגרום לתגובה תאית לאחר לתקן פגיעה זו. כדי לשרוד פציעות אלה לממברנת התא, תאים בעלי מנגנון יעיל לתיקון. מנגנון זה הוא סידן תלוי וכרוך בסחר תאית של חלבונים כגון annexins וMG53 בין יתר, כמו גם תאי subcellular כגון endosomes, lysosomes, שלפוחית Golgi נגזרת ומיטוכונדריה לקרום התא נפגע 1-7. עם זאת, את פרטיו של הרצף של אירועים מולקולריים וsubcellular המעורבים בתיקון קרום תא פגוע נשאר הבינו היטב.
התגובה לתיקון של התא יכולה להיות מופרדת לתוך אוזןly ותגובות מאוחרות. תגובות הראשונות, אשר מתרחשות תוך שניות לזמן בקנה מידה דקות, הן חשובות מאוד בקביעת מהותן של תגובות מאוחרות שהובילו לתיקון תאים מוצלח או מוות של תאים. מבחני נקודת סיום מבוססים על אנליזה ביוכימית והתאית בתפזורת סייעו להקים את מעורבותם של תהליכים מולקולריים ותאיים בתיקון. אבל, בשל ההטרוגניות והמהירות של תגובת תיקון הסלולרי, מבחני נקודת סיום אינם מספקים פרטים הקינטית ומרחבים של הרצף של אירועים שהובילו לתיקון. גישות המאפשרות לפציעה מבוקרת של קרום תא ומאפשרים ניטור ותיקון קרום תא ותגובות subcellular קשורים במרחב ובזמן ברזולוציה גבוהה מתאימות בצורה אידיאלית ללימודים כאלה. הנה, גישות כאלה כבר הוצגו. שניים מפרוטוקולי תיאור גישות לפקח קינטיקה בזמן אמת של תיקון קרום תא ותגובות subcellular הקשורים בתהליך התיקון בתאים חיים הבאות inj הלייזרלסר אורי. כהשלמה למבחנים מבוססי הדמיה תא החי אלה, מבחני נקודת סיום יש גם תוארו המספקים מדד המבוסס אוכלוסייה לתיקון ניטור של תאים בודדים ותגובות subcellular הקשורות. כדי להדגים השירות שלהם גישות אלה היו בשימוש כדי לפקח על סחר וexocytosis של lysosomes בתגובה לפציעת קרום תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תיקון קרום תא הדמיה באמצעות גורף (חרוז זכוכית) פציעה
פרוטוקול זה מאפשר בנפרד סימון התאים נפצעו ואלה שלא מצליחים לרפא. כימות אוכלוסיות של תאים אלה מחייב שימוש בשלושה תנאים: 1. מבחן (C1) - תאים רשאים לתקן בנוכחות של Ca 2 +, 2. בקרת 1 (אין C2 פציעה) - תאים מודגרת בנוכחות של Ca 2 +, אך לא נפגעו, ו 3. בקרה 2 (אין C3 תיקון) - תאים רשאים לתקן בהעדר Ca 2 +.
- לגדל תאים ל> מפגש 50% בשלושה coverslips סטרילית ולשטוף C1 ו-C2 פעמיים עם CIM על 37 מעלות צלזיוס וC3 עם PBS על 37 מעלות צלזיוס וcoverslips העברה על O-טבעות סיליקון.
- הוספה של פתרון prewarmed FITC dextran בCIM על C1 ו-C2 או ב-PBS על C3 100 μl.
- לפגוע בקרום פלזמה על C1 ו-C3 על ידי בעדינות מגלגל 40 חרוזי זכוכית מ"ג על coverslip בטמפרטורת חדר על ידי coverslips הטיה באופן ידני חזרה ושוב 6-8 פעמים בזווית של ° 30.
הערה: לפציעה קלה, להבטיח את חרוזי הזכוכית מפוזרים באופן אחיד, ובכך למזער את הפציעות חוזרות. כדי לשפר את שחזור של פגיעה בין דגימות, בו זמנית לבצע את פציעת חרוז זכוכית של דגימות השונות כדי להשוות. - הימנעות גלגול נוסף של חרוזים, להעביר את כל coverslips לחממת 37 ° C ב-CO 2 הסביבה ולאפשר תיקון כדי להמשיך למשך 5 דקות.
- בלי לתת חרוזים להתגלגל, להסיר את חרוזי הזכוכית וdextran FITC על ידי שטיפה עם CIM (C1 ו-C2) או PBS (C3) ב37 ° C.
- מקום coverslips חזרה על טבעת O ולהוסיף לפתרון prewarmed יזין ניתן לתקן dextran TRITC בCIM 100 μl על C1 ו-C2 או ב-PBS על C3.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בסביבת CO 2.
- לשטוף coverslips פעמיים עם CIM prewarmed ולתקן עם PFA 4% ל10 דקות ב RT.
- לשטוף פעמיים עם PBS ו דגירה למשך 2 דקות ב RT בצבע Hoechst.
- לשטוף samples פעמיים עם PBS, הר בשקופית באמצעות תקשורת הרכבה ותאי תמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence.
- להשתמש בתאים מC2 כדי לקבוע את עוצמת כתמים האדומה וירוקה ברקע ולהשתמש בערך הזה לסף הערוצים האדומים וירוקים לכל הדגימות (C1-C3).
- ציון מספר כולל של תאים ש) ירוק (נפצע ומתוקן) ו ב) אדומים או שניהם אדומים וירוק (נפצע, אך לא הצליחו לתקן) בדגימות C1 ו-C3.
- תאי ספירה> 100 הירוקים לכל מצב ולהביע את החלק היחסי של תאים שלא הצליחו לתקן כאחוז מכל נפגעו התאים (הירוק ואדום).
2. הדמיה חיה של קינטיקה של תיקון קרום תא בעקבות פגיעה הלייזר
- שטוף תאים עם CIM prewarmed ולאחר מכן לשים את coverslip בCIM עם צבע FM.
- מקום coverslip בבעל בחממה העליונה שלב נשמרה על 37 ° C.
- בחר אזור 1-2 מ"מ 2 של קרום התא, ולהקרין ל<; 10 אלפיות שני עם לייזר הפעם. להחליש את כוח הלייזר דרך התוכנה כדי 40-50% מהחשמל בשעתי השיא. כוח אופטימלי מאפשר פגיעה עקבית, אך לא קטלנית וזה צריך להיקבע על ידי ניסוי וטעייה עבור קו מכשיר והתא בודדים כל אחד בשימוש.
- כדי לפקח על תיקון, תמונה כל 10 שניות בepifluorescence וbrightfield, החל לפני פציעה ולהמשיך ל3-5 דקות בעקבות פציעה.
הערה: אין שליטת תיקון, חזור על שלבים 2.1-2.4 עם התאים נפצעו בPBS המכילים צבע FM. - כדי לכמת את קינטיקה של תיקון, למדוד הקרינה לצבוע FM הסלולרי, ותתאר את השינוי בעוצמת (ΔF/F0) במהלך ההדמיה. נתונים אלו צריכים להיות בממוצע במשך 10 תאים בכל תנאי וזממו כממוצע או הערך של התא בודד, לפי צורך.
3. גורף הדמיה (חרוז זכוכית) פגיעה הנגרם על lysosomal exocytosis
דוגמאות כוללות תאים הבאים גדלו> 50%נקודת המפגש: 1. מבחן (C1) - תאים אפשרו לתקן בנוכחות של Ca 2 +, 2. בקרת 1 (C2; אין פגיעה) - תאים לא נפגעו ולא הודגרו עם נוגדן ראשוני, ו 3. בקרה 2 (C3; לא תיקון) - תאים אפשרו לתקן בהעדר Ca 2 +.
- לשטוף coverslips C1 ו-C2 פעמיים עם CIM על 37 מעלות צלזיוס וC3 עם PBS על 37 מעלות צלזיוס ולהעביר אותם על O-טבעות סיליקון.
- הוספה של דקסטראן prewarmed יזין ניתן לתקן TRITC בCIM על C1 ו-C2 ובPBS על C3 100 μl.
- לפגוע בקרום פלזמה על C1 ו-C3 כמו בשלב 1.3.
- הימנעות גלגול נוסף של חרוזים, להעביר את כל coverslips לחממת 37 ° C ב-CO 2 הסביבה ולאפשר תיקון כדי להמשיך למשך 5 דקות.
- הסר את חרוזי הזכוכית וdextran TRITC ידי שטיפת coverslips במדיום גידול קר, שוב הבטחה אין מתגלגל של חרוזי זכוכית על התאים.
- שטוף את coverslips פעמיים עם מדיום גידול קר ולהעביר לטבעות האטימות.
- לC1 ו-C3, להוסיף נוגדן LAMP1 עכברוש אנטי עכבר 100 μl בתקשורת צמיחה מלאה קרה ולהוסיף את תקשורת הצמיחה הקרה, המלאה לC2.
- כדי לאפשר לנוגדנים מחייבים coverslips דגירה למשך 30 דקות ב 4 ° C.
- שטוף את coverslips שלוש פעמים עם CIM הקר ולתקן את כל coverslips עם PFA 4% ל10 דקות ב RT ולאחר מכן לשטוף 3x עם CIM.
- דגירה כל coverslips בחסימת פתרון ל15 דקות ב RT 100 μl
- דגירה כל coverslips ב100 μl אלקסה פלואוריד 488 נוגדן אנטי עכברוש ל15 דקות ב 4 ° C.
- לשטוף פעמיים עם PBS ו דגירה למשך 2 דקות ב RT בHoechst.
- שטוף תאים פעמיים עם PBS, הר בשקופית באמצעות תקשורת ותדמית הרכבה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence.
- שימוש בתמונות של תאי C2, לקבוע את מכתים ספציפי רקע באדום (dextran TRITC) וירוק ערוצים (נוגדן אלקסה פלואוריד 488) ולהשתמש בערכי מכתים רקע אלה לסף הערוצים האדומים וירוקים לכל הדגימות (C1-C3). </ Li>
- השתמש ב> 100 התאים האדומים שכותרתו מC1 ו-C3 כדי למדוד את עוצמת כתמי LAMP1 (ירוק) בתאים פגועים. לניסוי מוצלח מכתים LAMP1 בתאים מC3 יהיה נמוך יותר באופן משמעותי מאשר בתאים מC1.
4. הדמיה חיה של קרום תא פגיעה מופעלת על סחר subcellular
- Fluorescently לתייג תא של עניין על ידי transfecting כתב מתאים (למשל CD63-GFP לlysosomes 8) או על ידי שימוש בצבעי ניאון 9.
- לlysosomes תיוג עם צבע פלואורסצנטי, דגירה תאים המבוגרים כדי מפגש 50% בתקשורת צמיחה המכילה FITC-dextran
- לאפשר dextran להיות endocytosed עבור שעה 2 (או יותר בהתאם לצורך תיוג מספיק endosomal עם dextran ידי שורת התאים של עניין) בחממת CO 2.
- שטוף תאים עם תקשורת צמיחת prewarmed דגירה בזה במשך שעה 2 בחממה CO 2 כדי לאפשר לכלendocytosed dextran להצטבר בליזוזום.
- לפני ההדמיה, יש לשטוף את coverslip בCIM prewarmed ולעלות בבעל coverslip על החממה העליונה שלב ב 37 ° C.
- לבצע widefield (לתנועה ברחבי התא) או TIRF (תנועה על פני התא וexocytosis) הדמיה - תאים שאין להם צפופים dextran FITC lysosomes שכותרתו הם אידיאליים עבור ההדמיה התנועה וexocytosis של lysosomes הבודד.
- יישור לייזרי TIRF למיקרוסקופ הדמיה: השימוש 60x או אובייקטיבי 100X עם> 1.45 NA. להגדיר את הזווית לאירוע קרן לייזר TIRF שימוש בגישה של היצרן.
- לפצוע את קרום התא על ידי הקרנת אזור קטן (1-2 מ"מ 2) ל< 100 אלפית שניים, עם לייזר הפעם בהנחתת 40-50%.
- כדי לפקח על התגובה של הליזוזום לתא פציעה, תאי תמונה ב4-6 מסגרות / השני לפחות 2 דקות או יותר בהתאם לדינמיקה של exocytosis בתאים של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקולים שתוארו כאן להדמית תא בודדת הם לפקח על היכולת וקינטיקה של תיקון קרום תא (פרוטוקולי 1 ו -2) והסחר subcellular וההיתוך של lysosomes במהלך תיקון (פרוטוקולי 3 ו -4).
פרוטוקול 1 מציג assay בתפזורת המאפשר סימון כל התאים נפגעו וזיהוי תאים אלה נפגעו שלא הצליחו לתקן. התוצאות בתכנית איור 1 שבזמן שהתאים ללא כל הפגע (איור 1 א) יישארו ללא תווית, התאים שנפגעו מחרוז זכוכית בנוכחות של dextran FITC מסומנים ירוקים (איורים 1B ו 1C). כאשר תאים רשאים לתקן בנוכחות של Ca 2 + רוב התאים נפצעו (הירוקים) מצליחים לתקן ואינם מסומנים (אדום) על ידי dextran TRITC (איור 1). כאשר תאים רשאים לתקן בהעדר Ca 2 +, רוב התאים נפצעו גם שכותרתו אדומה על ידי dextran TRITC (Figure 1C). תאים שלא נפגעו לא מראים שום תיוג עם dextran TRITC. לפיכך, בכל מדגם נתון כימות מספר התאים רק ירוק שכותרתו מספק מידה מסוימת של התאים שנפגעו מחרוזי זכוכית ותוקנו, ואילו כימות מספר התאים כפולים (אדומים וירוקים) שכותרתו מספק מידה מסוימת של התאים שנכשלו כדי לתקן מפציעה.
פרוטוקול 2 מתאר הערכת קינטיקה של תיקון קרום תא על ידי ניטור הכניסה של צבע FM בתא. כאשר הודגרו בצבע FM, תאים שלמים להראות מכתים קרום תא (איור 2 א לפני פנל WF פציעה). בעקבות פציעת לייזר מקומית של קרום תא לצבוע FM מתחיל להיכנס לתא ומחייב endomembranes, אשר גורם לעלייה פתאומית בקרינת צבע FM (איור 2). כמו הקיבולת של קרום תא כדי לתקן פציעת הלייזר הבאה הוא תלוי Ca 2 +, תא נפצע בנוכחות של Ca 2 + הוא able כדי לתקן, מה שגורם לכניסת צבע FM (ומכאן להגדיל בקרינת צבע FM הסלולרית) להפסיק בתוך דקות לאחר הפציעה (קו כחול איור 2 א, פנל העליון, איור 2, ואנימצית וידאו 1 ואיור 2). אדרבה, תא אפשר לתקן בהעדר Ca 2 +, לא מצליח לתקן, מה שגורם כניסת צבע רציפה ולכן עלייה מתמדת בקרינת צבע FM אפילו 4 דקות לאחר 2A פציעה (איור, פנל תחתון, איור 2 ב, קו אדום ואנימציה וידאו 2 ואיור 2). לפיכך, תיקון קרום תא מוביל לplateauing של מכתים צבע FM, ואילו חוסר תיקון קרום התא גורם לכניסת צבע רציפה שאינה מישור.
פרוטוקול 3 מתאר את השימוש בגישת פגיעה בתפזורת (חרוז זכוכית) כדי לפקח על טרנסלוקציה של שלפוחית וחלבונים פני תא בתגובה לפציעה. הנה התאי דואר נפצעים בנוכחות dextran TRITC וכך, בעוד שהתאים ללא כל הפגע אינם מסומנים אדומים (איור 3 א), אבל כל התאים נפצעו מסומנים אדומים (3B דמויות ו3 ג). התאים ללא כל הפגע שאינם מטופלים עם תיוג רמת רקע מופע נוגדן הראשוני לLAMP1 פני תא (פנל LAMP1 איור 3 א). עם זאת, כאשר תאים נפצעים ואפשרו לרפא בנוכחות של סידן, lysosomes לעבור exocytosis ולכן יש רמה מוגברת של מכתים LAMP1 על פני השטח של (אדום שכותרתו) התאים נפצעו (איור 3 ב). העלייה בתיוג LAMP1 תא שטח הזה היא הרבה יותר נמוכה בתאים שמותר לרפא בהיעדר הסיד (איור 3 ג). זה מדגים את אופי סידן המוסדר של exocytosis lysosomal ומכאן מראה פני השטח של LAMP1. וכך שניהם, כימות מספר התאים עם מכתים LAMP1 משטח גבוה תא, כמו גם מדידת הרמהשל מכתים LAMP1 פני תא בתאים נפצעו אדם, לספק אמצעים ליכולתו של התא לעבור פציעה מופעלת exocytosis lysosomal.
פרוטוקול 4 יכול לשמש לניטור ישיר של קינטיקה, הטבע, ומיקום של היתוך הליזוזום בודד בתגובה לפציעת קרום תא. התאים שנפגעו על ידי לייזר הפעם ותא שטח lysosomes הם צילמו על ידי ההדמיה TIRF, המאפשרת פגיעת ניטור מופעלת exocytosis של lysosomes בתאים בודדים (איור 4 א ואנימציה וידאו 3). איור 4A מראה תא (שתואר בירוק) דמיינו ידי הדמיה שלב ניגוד (משמאל פנל) ועל ידי מיקרוסקופ TIRF (פנל באמצע), לפני פציעה. פנל ימני מראה תמונת TIRF של אותו תא 105 שניות לאחר פציעה. פציעה שונות גררה תגובות של lysosomes מתוארים באיורים 4 ב-E. איור 4 מראה פציעה מופעלת על גיוס הליזוזום (מסומןעל ידי העיגול אפור) על קרום התא ואחריו exocytosis (וידאו אנימציה 4 ואיור 4). הליזוזום זה לא נראה לעין בתמונת TIRF לפני פציעה (איור 4: -2.5 פנל ים), אבל בעקבות פציעת ליזוזום מגיע לממברנת התא והופך לזיהוי (איור 4: פנל 102.5 ים), כמו השלפוחית מתקרבת ל קרום תא עדיף מתרגשת מתאורת TIRF וקרינת dextran FITC lysosomal מגיעה ערך מקסימאלי כאשר נקבוביות ההיתוך פותח גורם נטרול חומציות lysosomal וכך dequenching של הקרינה dextran FITC (איור 4: פנל 104.8 ים). בהמשך לכך dextran משוחרר מהשלפוחית לצד החיצוני של התא גורם לקרינת FITC להפיץ רוחבי וקרינת השלפוחית כדי להפחית בהדרגה (איור 4: פנל 107.1 ים). בקטגוריה השנייה, הליזוזום (המסומן בעיגול כתום, האנימציה Vidאיו 5 איור 4) נמצא לפני פציעה (איור 4C: ים -2.5 פנל), הוא נשאר שם בקרום (איור 4C: פנל 91 ים) עד exocytoses השלפוחית. הנה הליזוזום exocytosed חלקית (איור 4C: פנל 93 ים) והותיר אחריו כמה dextran FITC בשלפוחית לאחר ההיתוך (איור 4C: 94.5 ים). הקטגוריות שלישי והרביעי של שלפוחית לא להיצמד אל הקרום. הליזוזום שמוצג באיור 4D (המסומן בעיגול הכחול) נע axially ולהרחק מקרום התא (אנימציה וידאו 6 והאיור 4). הליזוזום זה אינו גלוי בקרום התא לפני פציעה (איור 4D: -2.5 פנל ים), אבל כשהתקרב קרום תא בעקבות פציעתו הופכת לגלויה על ידי מיקרוסקופ TIRF (איור 4D: פנל 59.3 ים). הוא הגיע הכי קרוב לקרום התא (איור 4D: פנל 59.6 ים) ולאחר מכן מתרחק בלי פיוזינג (איור 4D: pאנל 63.7 ים). הליזוזום בקטגוריה הרביעית מגיע קרוב לממברנה ונע בצורה אופקית לאורך קרום תא (האזור המסומן במלבן הסגול בתרשים 4A, אנימציה 7 וידאו והאיור 4). איור 4E (פנל 8.7 ים) מציג את הגעתו של הליזוזום , אשר לאחר מכן הוא נע לאורך הממברנה וניתן לראות ברצף של תמונות שלאחר פציעה (איור 4E: לוחות 10.7, 11.9, 12.8, 18.8 ים). בהתבסס על התיאור לעיל כימות עוצמת FITC dextran הקרינה של כל ליזוזום - פיוזינג (4B דמויות ו4C), נע axially (איור 4D) או העברה אופקית (איור 4E) מאפשר קביעת התגובה של הליזוזום לפציעה.
איור 1. . פציעת קרום תא כמויות גדולה על ידי חרוזי זכוכית תמונות להראות מכתים גרעיני (Hoechst פנל משמאל), פציעה (צביעה ירוקה - FITC Dextran), תאים שלא תוקנו (מכתים אדום - TRITC Dextran), ומזג את תמונות (מיזוג). (א) בתאים וללא כל פגע בנוכחות סידן, (ב ') נפצעו תאים בנוכחות של סידן, ו (ג) נפגע תאים בהיעדר סידן. בקנה מידה בר מיקרומטר 10. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. . תמונת הדמיה בזמן אמת של תיקון קרום תא בתגובה לפציעת לייזר () של תאים (המפורטים בכתום) לפני פציעת פנל [עזב - שדה בהיר (BF) וepifluorescence (EPI)], 5 שניות, דקות, 1 ו -4 דקות לאחר פציעה. האתר של פציעה הוא הצביע על ידי חץ לבן. פנל עליון מראה תא נפצע בנוכחות סידן ופנל תחתון מראה תא נפצע בהיעדר סידן. (ב) גרף המציג את השינוי בכתמי צבע FM (ΔF/F0) של התאים בפנל נפצעו בנוכחות סידן (כחול) או בהיעדר סידן (אדום). האזור שבו צבע FM נכנס ולכן תיוג הקרינה מוגבר שימש לכימות של עוצמת הקרינה. בקנה מידה בר = 10 מיקרומטר). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. exocytosis lysosomal ההדמיה בתגובה לפציעה בתפזורת. תמונות להראות מכתים גרעיני Hoechst (כחול), מכתים תא שטח LAMP1 (ירוק), dextran TRITC (אדום) ומיזוג של כל הערוצים (השכבה) של תאים ללא פגע (א) לא מסומנים עם נוגדן ראשוני, (ב) תאים נפצעו אפשרו לתיקון בנוכחות סידן, ו (ג) תאים נפצעו אפשרו לתקן בהיעדר סידן. בקנה מידה בר מיקרומטר 10. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. הדמיה בזמן אמת של exocytosis lysosomal בתגובה לפציעת לייזר. תאים עם lysosomes כותרת dextran FITC נפצעו על ידי לייזר פעם בנוכחות של סידן. () הגבול של התא הלוח שמאלי - שדה בהיר לפני פציעה, פנל באמצע - TIRF לפני פציעה ופנל ימני - TIRF 105 ים לאחר פציעה: נפצע מתואר (בירוק). האתר של פציעה מסומן בתיבת ציאן ואזור הנציג שצוין על ידי קופסות הלבנות / סגולות ועיגולים צבעוניים בתוך הגדלת התצוגה בפנלים BE. הצבע של השלפוחית בתמונת כל התא (אפור, כתום וכחול) מתאים לצבע שבתצוגה מוקטנת בתמונות של lysosomes הבודד. פנל (ב ') משמאל מציג עלילה לערך ΔF/F0 לקרינת FITC של שלפוחית גויסה לאחר פציעה. פנל ימני מראה תמונות של השלפוחית לפני פציעה (-2.5 ים), prefusion (102.5 ים), פיוז'ן (104.8 ים) וpostfusion (107.1 ים). פנל (ג) משמאל מציג עלילה לערך ΔF/F0 לקרינת FITC של שלפוחית עגנה לפני פציעה. פנל ימני מראה תמונות של השלפוחית לפני פציעה (-2.5 ים), prefusion (91 ים), פיוז'ן (93 ים) וpostfusion (94.5 ים). (<פנל> חזק D) שמאל מציג עלילה לערך ΔF/F0 לקרינת FITC של שלפוחית נעה axially (כיוון ומרחק של קרום התא). פנל ימני מראה תמונות של השלפוחית לפני פציעה (-2.5 ים), ולאחר פציעה בעמדה שונה בקרבת הקרום ב59.3, 59.6 ו63.7 ים. מול המצלמה (ה) של השלפוחית שזזו בצורה אופקית לאורך קרום התא בתפקידים שונים לפני פציעה (-2.5 ים) ולאחר פציעה ב( 8.7, 10.7, 11.9, 12.8 ו18.8 ים). סרגל קנה מידה (= 10 מיקרומטר, B, C, D, E = 1 מיקרומטר). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור אנימציה וידאו 1 2:. הדמיה בזמן אמת של תיקון קרום תא בתגובה לפציעת לייזר בנוכחות של סידן כניסת FM לצבוע בתא (שתוארה בכתום) נפגע על ידי פעמולייזר בנוכחות סידן. הסרט מייצג 200 תמונות שנרכשו כל 2 שניות. התא נפצע (אזור המסומן בריבוע ציאן) אחרי מסגרת 4. חותמת הזמן מראה את הזמן בשעות: דקות: שניות: פורמט אלפיות שני. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.
וידאו 2 איור אנימציה 2:. הדמיה בזמן אמת של תיקון קרום תא בתגובה לפציעת לייזר בהיעדר סידן כניסת FM לצבוע בתא (שתוארה בכתום) נפגעה על ידי לייזר פעם בהיעדר סידן. הסרט מייצג 200 תמונות שנרכשו כל 2 שניות. התא נפצע (אזור המסומן בריבוע ציאן) אחרי מסגרת 4. חותמת הזמן מראה את הזמן בשעות: דקות: שניות: פורמט אלפיות שני. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.
וידאו 3 איור אנימציה 4: הדמיה בזמן אמת של exocyt lysosomalאוזיסים בתגובה לפציעת לייזר. תגובות שונות של lysosomes בתא (שתואר בירוק, וידאו 3) נפגע על ידי לייזר פעם. הסרט מייצג 2 דקות של תמונות הזמן לשגות רציפים נרכשו על ידי מיקרוסקופיה TIRF ב5 מסגרות / sec. תמונות brightfield נרכשו כל 20 שניות. התא נפצע (מסומן על ידי תיבת ציאן) בשעה 2 שניות לתוך הסרטון הזה. עיגולים הצבעוניים (אפורים, כתומים והכחולים) והתיבה הסגולה לסמן lysosomes מתואר באיור 4 וסרטוני אנימציה 4-7, הוכחת גורלותיהם השונים בעקבות פציעת תא. חותמת הזמן מראה את הזמן בשעות: דקות: שניות: פורמט אלפיות שני. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.
וידאו 4 דמות אנימציה 4 תערוכות הליזוזום exocytic מסומן על ידי העיגול אפור אשר גויס על הקרום בתגובה לפציעה. בשעת 7 שניות (לאחר 5 שניות פציעה) לסרטון הזה הליזוזום מקבל גויס בקרום התאולאחר מכן משלב באתר זה בדקות 1 ו 47 שניות. בר סולם = 1 מ"מ.
וידאו 5 דמות אנימציה 4 תערוכות הליזוזום exocytic מסומן על ידי העיגול הכתום שעגן בקרום לפני פציעה ונתיכים בדקות זה אתר 1 ו35 שניות. בר סולם = 1 מ"מ.
וידאו 6 דמות אנימציה 4 תערוכות lysosomes מסומן על ידי העיגול הכחול נע לכיוון ולאחר מכן מקרום התא. בר סולם = 1 מ"מ.
וידאו 7 דמות אנימציה 4 מראה אזור של התא המסומן בתיבה סגולה בוידאו 3 שבו בעקבות פציעה אחד הליזוזום (העיגול לבן) נע אלאונג קרום התא. בר סולם = 1 מ"מ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פציעת קרום תא in vivo מתרחשת עקב מגוון של גורמי לחץ פיסיולוגיים וכמה גישות ניסיוניות פותחו לחקות אלה. אלה כוללים פצעו קרום תא של תאים חסיד על ידי גירוד אותם מהצלחת או על ידי passaging דרך 9,10 מזרק שעמם צר. בעקבות פציעות כגון התאים לרפא בהשעיה ולא פעל בהתאם למטריצה תאית כפי שהם עושים בדרך כלל ברקמות. כגון שימוש ברעלים נקבוביות ויוצר, ואילו אחרים כימיים לשנות קרום תא על ידי שומני חילוץ כגון כולסטרול, ולכן לא מחקה בפגיעות מכאניות vivo 5. לפיכך, שיטה המשמשת לפגיעה בתא יכולה להשפיע על מה שניתן ללמוד על התגובה לתיקון. זה מחייב נזהר שלא רק בבחירה של assay פגיעה בתא, אלא גם בחירת גישות שיותר טובים לחקות את הפגיעות מכאניות in vivo. גישות אלה כוללות פגיעת שריטה (שבי monolayer של תאים נפגעועל ידי פגיעה באזמל או מחט) וחרוזי זכוכית (שבו ניזק נגרם על ידי חרוזי זכוכית התהפכות תאים דבקים). גישות אלו מתאימות גם לפציעתם של תאים בהמוניהם, אבל הם לא ניתנים להדמיה בזמן אמת של תהליך תיקון קרום תא. שימוש בmicroneedles ולייזרים פעמו ליצור פציעות מקומיות ומבוקרות היטב בנקודת הפגיעה לחקות את הפגיעה מכאנית וטראומטית in vivo ונוחות להדמיה בזמן אמת של תגובת התיקון, אבל מציעה תובנה התיקון של תא אחד בכל פעם. ראוי לציין כי גישת פציעת לייזר פעם שונה מהשימוש בקרינה ממושכת של קרום תא עם לייזרי nonpulsed בי פציעת הממברנה נגרמת על ידי חימום מקומי, אשר ידוע לגרום השפעות nonphysiological כגון נזק photoxidative וphotothermal קרום שומנים ורכיבי cytosolic 11.
הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים לרתום את הפוטנציאל של אחד of בהמוניהם גישת פציעה, אשר מסתמכת על השימוש בחרוזי זכוכית ואחד גישת פציעה המקומית (לייזר פעמו) לניטור היכולת, קינטיקה וסחר subcellular המעורב בתיקון של קרום תא בעקבות פציעת גודל מיקרומטר. גישות אלו הן הדדית חינם - פגיעה בתפזורת מאפשרת שימוש באוכלוסייה של תאים לזהות גירעון ביכולת התיקון וסחר subcellular הקשורים אליו. כך שהיא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של תיקון בתאים בודדים, גישת פציעת לייזר מאפשרת זיהוי מה שלב של תיקון קרום תא ומה subcellular אירועים הקשורים לגירעון בתיקון. גישה זו כבר בשימוש לניטור תיקון קרום תא באורגניזמים יונקים וחסרי חוליות 7,12,13. בהתבסס על הצרכים של הניסוי באחת משתי גישות אלה יכולים להיות בשימוש על ידי עצמו. עם זאת, כאשר האופי של תיקון גירעון אינו ידוע או מנגנון subcellular מעורב בtהתהליך שלו לא ידוע, באמצעות שילוב של גישות אלה הוא שימושי.
בשל השונות הגלומות במספר התאים נפצעו בין הדגימות בנקודת סיום מבוססות מבחני פגיעה בתא יש צורך לזהות באופן עצמאי את כל התאים שנפגעו, שהצליח לתקן ואלו שלא הצליחו לתקן. גישת פציעת חרוז הזכוכית שתארנו כאן מאפשרת זיהוי תאים אלה. בעת ביצוע חרוז הזכוכית ופצע אותו חשוב כי בעת ביצוע מאמץ על מנת למקסם את מספר התאים נפצע הפציעות עצמם הם קלים כל כך תאים לא מקבלים כניסות מרובות. זה חשוב מאז פציעה החוזרת ונשנית תגרום לתאים (באופן סלקטיבי אותם כי הם עניים בתיקון) למות ולהתנתק מcoverslip במהלך ההליך. זה היה התוצאה של הערכה נמוכה מדי של תאים שלא הצליחו לתקן. כמו כן, חשוב להימנע מכל גלגול של חרוזי הזכוכית במהלך טיפול ושטיפת coverslips כדי למנוע כל פגיעה חדשה היגרום לכתמים אדומים (תאים חיוביים כוזבים). גישה זו לפגיעה גם מאפשרת ניטור אוכלוסייה של תאים לטרנסלוקציה של חלבון של עניין תא שטח, כפי שהודגם כאן לקבלת חלבון קרום הליזוזום קשור 1 (LAMP1). כאשר הניטור רק חלבונים מקומיים תא שטח על ידי immunofluorescence דרישת מפתח היא להשתמש בנוגדנים שקושרים תחום תאי של החלבון בתאי ריבית וimmunolabel לפני הקיבעון. זה מאפשר השוואה של רמת LAMP1 בקרום התא בתאים נפצעו עם תאים ללא כל פגע, או בין אוכלוסיות השונות של תאים. בעוד פרוטוקול זה כבר מאויר באמצעות LAMP1, זה יכול להיות מיושם על כל חלבון אחר לבחירה שבגינו קיימים נוגדנים ספציפיים לתחום תאי של החלבון. כאשר exocytosis lysosomal פציעה מופעלת צריך להיות בהשוואה בין שתי שורות תאים שלא הוקמו יש שיעור דומה בסיסי (לא מופעל על ידי פציעה) של exocytosis lysosomal, מכתים LAMP1 פני תא בתאים ללא כל פגע צריך גם להימדד. לכך נוסף מדגם מטופל בדיוק כמו C2 מדגם פרט לכך בשלב 9 יש מודגרות התאים עם הנוגדן הראשוני. זה יספק מידה של השיעור הבסיסי של exocytosis lysosomal.
לפרוטוקול פציעת לייזר קרום התא נפגע על ידי לייזר בעוצמה גבוהה יחיד פוטון NSEC פעם. פצע מתבצע בנוכחות של צבע impermeant תא הקרינה שעולה על endomembrane המחייב (למשל 1-43 FM). כך בעקבות הקרינה הצבע קשורה התא מספק מדד לזמן שנדרש על ידי התא לרפא 3. פגיעת לייזר גורמת לצבע FM להיכנס לתא ולהיקשר endomembranes, וכתוצאה מכך העלייה בקרינת צבע FM. תיקון של קרום התא הפגום מעכב כניסה לצבוע יותר לתוך התא. לפיכך, לתא שתיקונים, הקרינה של הצבע מגיעה לרמה, ואילו לתא שלא מצליחה לתקן צבעהקרינה מגבירה ללא הרף.
הדמיה תא חי של אירועי subcellular בודדים המעורבים בתיקון קרום תא דורשת ניטור קרום התא בגבוה יחס אות לרעש. מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההשתקפות פנימית סה"כ (TIRF) הוא גישה מתאימה גם לאירועי שטח פני תא הדמיה באות גבוהה ל14-16 יחס רעש. ישנן מספר מערכות TIRF הזמינות מסחרי וכל המערכות הללו תואמים הדמיה תא חי יכול לשמש. בנוסף, יש לנו תיארתי גישות להגדרת מיקרוסקופים TIRF תוצרת בית במקומות אחרים 17,18. מבקר של התקנת TIRF יש צורך להקים גישות המאפשרות ניטור גורלות שונים של שלפוחית subcellular לפני ואחרי פציעה. במקומות אחרים שאנו מספקים לדון בגישות באופן שתאפשרנה לטבע ניטור, משך זמן, ותואר של היתוך של כל 19 הליזוזום. כדי לפקח על פגיעה מופעל exocytosis של FITC-dextran שכותרת lysosomes תואר בפרוטוקול 4 תכונת המפתח להתבונן הם ההבזקים. הבזק כרוך בשחרורו של dextran FITC הכלול בליזוזום הבודד בשלב אחד וכתוצאה מכך התפשט לרוחב של הקרינה. למרות שכל פלאש בדרך כלל מצביע על היתוך exocytic של הליזוזום אחת, חשוב לבסס זאת על ידי ניטור כמה lysosomes רבים נמצאים באתר ההיתוך לפני ואחרי הבזק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המענקים AR055686 וAR060836 ומלגה הבתר לספירה על ידי צרפתים ניוון שרירים אגודה (AFM). מתקן ההדמיה הסלולרית מנוצל במחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי HD040677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K.
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
