Summary
Iyileşme yaralı hücrelerinin hücre zarı gibi bir işlem yaralanma siteye özgü protein ve hücre içi bölmeler kaçakçılığı içerir. Bu protokol, bu süreçleri izlemek için deneyleri açıklar.
Abstract
Iyileşmek için yaralı hücrelerinin yeteneği temel bir hücresel süreçtir, ama şifa yaralı hücrelerde yer alan hücresel ve moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Burada deneyler lokalize yaralanma sonrası kültürlenmiş hücrelerin iyileşmesi yeteneği ve kinetik izlemek için tarif edilmiştir. İlk protokol hücre aynı anda yüzlerce hücre zarı tamir yeteneği değerlendirmek için bir uç nokta bazlı yaklaşım anlatılmaktadır. İkinci protokol, bir darbeli lazerle lokalize yaralanmasından sonra, tek tek hücrelerin hücre membran onarım kinetiğini izlemek için bir gerçek zamanlı görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Şifa yaralı hücreleri yaralanma siteye spesifik proteinler ve subselüler bölmeleri kaçakçılığı içerdiğinden, üçüncü protokolü aynı anda yaralı hücrelerin yüzlerce böyle bir kaçakçılık olayı (lizozomal ekzositoz) değerlendirmek için yukarıdaki uç nokta bazlı yaklaşımın kullanımı ve son protokolünü açıklar TIRF MICROS birlikte darbeli lazer yaralanma kullanımını tarifyüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte yaralı hücrelerin içindeki bireysel subselüler bölmelerinin dinamiklerini izlemek için kopyalama. Burada protokoller, hücre zarı ve tamir kültürlenmiş kas hücrelerinde lızozomal Ekzositoz arasındaki bağlantıyı incelemek için bu yaklaşımların kullanımını tarif olsa da, herhangi bir diğer yapışık kültürlenmiş hücre ve hücre altı bölme seçim için gibi uygulanabilir.
Introduction
Hücre membran hücre ve hücre-dışı ortam arasında bir bariyer sağlayarak hücre bütünlüğünü korur. Normal fizyolojik eşik gibi, istila eden patojenlere varlığını aşan bir kimyasal elektriksel veya mekanik uyarıcı hücre zarına zarar her bir sonuç, bu hasarı onarmak için bir sonraki hücresel tepkiye sebep olabilir. Hücre zarı, bu yaralanmalar hayatta kalmak için, hücreleri tamir için etkili bir mekanizmaya sahip. Bu mekanizma, kalsiyum bağımlıdır ve diğerlerinin yanı sıra bu ve MG53 anneksinler gibi proteinlerin hücre içi hem de örneğin yaralı hücre zarı 1-7 endozomlarda, lizozomlarda, Golgi türetilmiş veziküller ve mitokondri gibi hücre altı bölme içerir. Bununla birlikte, hasarlı hücre zarı ve tamiri ile ilgili moleküler ve hücre içi olaylar dizisinin ayrıntıları henüz tam olarak anlaşılamamıştır.
Hücrenin onarım tepkisi kulağına ayrılmış olabilirly ve geç yanıtlar. Dakikalık bir zaman ölçeği saniyeler içinde meydana gelen erken tepkiler, başarılı onarım hücresi ya da hücre ölümüne yol açan geç yanıtların doğasını belirlenmesinde son derece önemlidir. Toplu biyokimyasal ve hücresel analizine dayalı uç nokta tahliller tamir moleküler ve hücresel süreçlerin tutulumu kurulmasına yardımcı olmuştur. Ama nedeniyle hücresel onarım tepki heterojenliği ve süratine, uç nokta deneyleri onarmak yol açan olaylar dizisinin kinetik ve mekansal ayrıntıları sağlamak için başarısız. Hücre zarı kontrollü yaralanma etkinleştirmek ve hücre zarı onarımı ve yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte ilişkili subselüler yanıtları izlemek izin Yaklaşımlar ideal gibi çalışmalar için uygundur. İşte, bu tür yaklaşımlar sunulmuştur. Protokollerin iki lazer inj aşağıdaki hücre membran onarım gerçek zamanlı kinetik ve canlı hücrelerdeki onarım süreci ile ilgili hücre içi tepkileri izlemek için yaklaşımlar açıklarUry. Bu canlı hücre görüntüleme bazlı deneyler için bir tamamlayıcı olarak, uç nokta deneyler ayrıca tek tek hücrelerin ve ilgili hücre içi tepkileri izleme onarımı için bir nüfus tabanlı bir ölçüsünü sağlar tarif edilmiştir. Bu yaklaşımlar hücre zarı hasarına yanıt ticaretini ve lizozomların eksositosizini izlemek için kullanılmış olan kendi programını göstermek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Görüntüleme Hücre Zarı Onarımı Toplu Kullanımı (Cam Boncuk) Yaralama
Bu protokol ayrıca yaralı hücreleri ve iyileşmek için başarısız olanlar işaretleme sağlar. Hücrelerin bu popülasyonlarını miktarının üç şarttan kullanımını gerektirir: 1.. Testi (C1) - Hücreler, Ca2 +, 2 varlığında, tamir izin verilir. Kontrol 1 (yaralanma yok ve C2) - Hücreler Ca2 + mevcudiyetinde inkübe ancak yaralı olmayan ve 3 vardır. Kontrol 2 (hiçbir onarım C3) - hücrelerin Ca 2 + yokluğunda onarmak için izin verilir.
- Üç steril lamelleri>% 50 ortak akışa kadar hücrelerin büyümesine ve silikon O-halkaları üzerinde 37 ° C ve devir lamelleri PBS ile 37 ° C'de ve C3 CIM ile iki kez C1 ve C2 yıkama.
- C1 ve C2 veya PBS C3 üzerinde CIM prewarmed FITC dekstran solüsyonu 100 ul ekleyin.
- Nazikçe elle geri eğerek lamelleri oda sıcaklığında lamel üzerinde 40 mg cam boncuk haddeleme tarafından C1 ve C3 plazma zarı zarar30 ° 'lik bir açıyla ileri 6-8 kez.
Not: hafif sakatlığı için, böylece tekrar sakatlanmaları en aza indirmeyi, cam boncuklar eşit yayılır sağlamak. Örnekler arasında yaralanma tekrarlanabilirlik artırmak için, eş zamanlı olarak karşılaştırılabilir, farklı numunelerin cam boncuk yaralanma gerçekleştirmek. - Boncuklar bundan başka haddeleme kaçınmak çevre CO2 bir 37 ° C inkübatöre tüm lamelleri aktarmak ve onarım 5 dakika devam etmesine izin verir.
- Boncuklar rulo izin olmadan, 37 ° C de CIM (C1 ve C2) veya PBS (C3) ile yıkanarak, cam boncuklar ve FITC dekstran kaldırma
- Yeri O halka geri lamelleri ve C1 ve C2 veya PBS C3 üzerinde CIM prewarmed lisin fixable TRITC dekstran çözüm 100 ul ekleyin.
- Ortam CO 2 ° C'de 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
- Önceden ısıtılmış CIM ile iki kere yıkayın lamelleri ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA ile tamir.
- Iki kez PBS ile yıkayın ve Hoechst boya içinde, oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edilir.
- Yıkama SAMPLes PBS ile iki kez, bir Epifloresans mikroskop kullanılarak montaj medya ve görüntü hücreleri kullanarak bir slayt üzerine monte.
- Arka plan, kırmızı ve yeşil boyama yoğunluğunu belirlemek ve tüm numunelerin (C1-C3) için eşik, kırmızı ve yeşil kanallar için bu değeri kullanmak C2 hücreleri kullanın.
- A) Yeşil (yaralı ve tamir) ve b) kırmızı veya kırmızı ve yeşil (yaralananların, ama C1 ve C3 örneklerinde) onarmak için başarısız olan hücrelerin toplam sayısını skor.
- Sayısı> 100 yeşillik ve her bir durum için yaralı tüm hücreler (yeşil ve kırmızı) bir yüzdesi olarak onarım başarısız hücrelerin fraksiyonu ifade hücreleri.
2. Lazer Sakatlık sonrasında Hücre zarı tamiri Kinetiğinin Canlı Görüntüleme
- Prewarmed CIM hücreleri yıkayın ve ardından FM boya ile CIM lamel koydu.
- 37 ° C de muhafaza üst evre inkübatör içinde bir tutucu içine lamel
- Hücre zarının 1-2 mm 2 bölgenizi seçin ve aydınlatılır <, Darbeli lazer ile 10 msn. Pik güç% 40-50 yazılım aracılığıyla lazer gücünü zayıflatabilir. Optimal güç tutarlı, ancak ölümcül olmayan yaralanma izin verir ve bu kullanılan her bir alet ve bir hücre hattı için deneme-yanılma ile tespit edilmelidir.
- Yaralanmadan önceki başlıyor, epifluoresan ve aydınlık onarım, görüntü her 10 saniye izlemek ve yaralanmayı takiben 3-5 dakika boyunca devam edin.
Not: Hiçbir onarım kontrolü için, tekrar PBS yaralanan hücrelerin FM boya içeren 2,1-2,4 adımları. - Tamir kinetiklerini ölçmek için, cep FM boya floresan ölçümü ve görüntüleme sırasında yoğunluk (ΔF/F0) 'de değişiklik arsa. Bu veriler, her durumda üzerinde 10 hücreleri için ortalama ve gerektiği gibi, ortalama veya bireysel hücrenin değeri olarak çizilmiştir edilmelidir.
3. Görüntüleme Toplu (Cam Boncuk) Yaralanma Indüklenen Lizozomal Ekzositoz
Numuneler,>% 50 büyüdü aşağıdaki hücreleri,izdiham: 1. Testi (C1) - Ca2 +, 2 varlığında, tamir edilmesine bırakılmıştır hücreler. Kontrol 1 (C2; Yaralanma) - Hücreler yaralı veya birincil antikor ile inkübe edildi ve 3 de. Kontrol 2 (C3; Hayır onarım) - Ca 2 + yokluğunda onarmak için izin Hücreler.
- Yıkama 37 ° C 'de PBS ile 37 ° C'de ve C3 CIM ile iki kez C1 ve C2 lamelleri ve silikon O-halkaları üzerinde aktarın.
- C3 üzerinde C1 ve C2 üzerinde CIM ve PBS prewarmed lisin fixable TRITC dekstran 100 ul ekleyin.
- Adım 1.3 'de olduğu gibi C1 ve C3 plazma membran hasar görebilir.
- Boncuklar bundan başka haddeleme kaçınmak çevre CO2 bir 37 ° C inkübatöre tüm lamelleri aktarmak ve onarım 5 dakika devam etmesine izin verir.
- Yine hücreler üzerindeki cam boncuklar no haddeleme sağlanması, soğuk büyüme ortamında lamelleri yıkanarak cam boncuklar ve TRITC dekstran çıkarın.
- Soğuk büyüme ortamı ile iki kez lamelleri durulayın ve O-halkalara transfer.
- C1 ve C3 için:, Soğuk tam büyüme ortamı içinde sıçan anti-fare antikoru LAMP1 100 ul ekleyin ve C2 için soğuk, tam büyüme ortamı ilave edin.
- Antikor, 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe lamelleri bağlayıcı izin vermek için
- Soğuk CIM ile lamelleri üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA Tüm lamelleri düzeltmek ve daha sonra CIM ile 3 kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 100 ml bloke etme ul Tüm lamelleri inkübe
- 4 ° C'de Alexa Fluor 100 ul içinde 15 dakika boyunca 488 anti fare antikoru, tüm lamelleri inkübe
- Iki kez PBS ile yıkayın ve Hoechst içinde, oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edilir.
- PBS ile iki kez hücreleri yıkayın, Epifloresans bir mikroskop kullanılarak montaj medya ve görüntü kullanılarak bir slayt üzerine monte.
- C2 hücrelerinin görüntüleri kullanarak, spesifik olmayan arka plan kırmızı boyanma (TRITC dekstran) ve yeşil (Alexa Fluor 488 antikor) kanalları belirlemek ve tüm numunelerin (C1-C3) için kırmızı ve yeşil kanalları eşik bu plan boyama değerleri kullanın. </ Li>
- Yaralı hücrelerinde LAMP1 lekeleme (yeşil) yoğunluğunu ölçmek için C1 ve C3 ila> 100 kırmızı etiketli hücreler kullanın. Başarılı bir deney için C3 hücrelerinde LAMP1 boyama C1 hücrelerine önemli ölçüde daha düşük olacaktır.
4. Hücre Zarı Yaralanma Canlı Görüntüleme hücrealtı Ticareti AteŃlemeli
- Fluoresanlı etiketlemek (lizozomlardan 8 örneğin CD63-GFP) veya floresan boyalar 9 kullanılarak uygun muhabiri transfecting tarafından ilgi bölmesi.
- Floresan boya ile etiketleme, lizozomlar için, FITC-dekstran ihtiva eden büyüme ortamı içinde% 50 ortak akışa kadar büyütülmüş hücrelerini inkübe
- CO2 inkübatöründe (ilgi hücre hattı ile dekstran ile yeterli endozomal etiketlenmesi için gerektiği kadar veya daha uzun) dekstran 2 saat boyunca endocytosed izin ver.
- Izin vermek için önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile yıkayın ve hücreler, bir CO2 inkübatör içinde 2 saat içinde inkübe tümlizozomlarda birikir dekstran endocytosed.
- Görüntüleme önce, önceden ısıtılmış CIM lamel yıkayın ve 37 ° C'de sahne üst inkübatör bir lamel tutucu monte
- (Hücre boyunca hareketi için) Widefield veya TIRF (hücre yüzeyinde ve ekzositoz ile hareket) görüntüleme yürütmek - FITC dekstranı kalabalık var olmayan hücreleri etiketlenmiş lizozomlar bireysel lizozomların hareketini ve ekzositoz görüntüleme için idealdir.
- Görüntüleme mikroskop için TIRF lazer hizalama: kullan 60x veya> 1.45 NA ile 100X objektif. Üreticinin yaklaşımı kullanarak olay TIRF lazer ışınının açısını ayarlayın.
- % 40-50 zayıflatma de darbeli bir lazer ile, <100 ms için küçük (1-2 mm 2) bölgeyi ışınlayarak hücre zarı hasar görebilir.
- Ilgi hücrelerde ekzositoz dinamiklerine bağlı olarak en az 2 dakika ya da daha uzun süre 4-6 kare / sn yaralanma, görüntü hücreleri hücre lizozoma yanıtını izlemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek hücre görüntüleme için burada anlatılan Protokoller yeteneği ve kinetik hücre zarı tamiri (Protokoller 1 ve 2) ve onarım sırasında subsellüler kaçakçılığı ve lizozomların füzyon izlemek için vardır (Protokoller 3 ve 4).
Protokol 1 yaralı tüm hücreleri işaretleme ve onarmak için başarısız olanlar yaralı hücrelerin belirlenmesi sağlayan bir yığın tahlil gösterir. Yaralanmamış hücreleri (Şekil 1A) etiketsiz kalırken, FITC dekstran varlığında cam boncuk tarafından yaralı hücreleri (Şekil 1B ve 1C) yeşil etiketli olduğunu Şekil 1 gösterisinde sonuçları. Hücreler Ca varlığında onarmak için izin verildiğinde 2 + yaralı (yeşil) hücrelerin çoğu onarım yönetmek ve TRITC dekstran (Şekil 1B) tarafından (kırmızı) işaretli değildir. Hücreler Ca 2 + yokluğunda onarmak için izin verildiğinde, yaralı hücrelerin çoğu da TRITC dekstrana (Fi tarafından kırmızı etiketliGüre 1C). Yaralandı asla Hücreler TRITC dekstran ile herhangi bir etiketleme görünmüyor. Bu nedenle, çift (kırmızı ve yeşil) etiketli hücrelerin sayısı başarısız hücrelerin miktarının bir ölçüsünü sağlar iken, sadece etiketli yeşil, cam boncuklar ile yaralandı ve tamir edilmiş hücrelerin bir ölçüsünü sağlar hücre sayısının ölçülmesi herhangi bir numunede yaralanma onarmak için.
Protokol 2 hücrede FM boya girişini izleyerek hücre membran onarım kinetiğini değerlendirmek tarif etmektedir. FM boya inkübe olduğunda, sağlam hücreler (hasar WF panelinde daha önce Şekil 2A), hücre zarı boyama göstermektedir. Hücre membran lokalize lazer yaralanma sonrasında FM boya hücreye giren ve FM floresan boya (Şekil 2B) ani bir artışa neden olur endomembranes, bağlayıcı başlar. Aşağıdaki lazer hasarı onarmak için hücre zarı kapasitesi olarak Ca2 +, Ca 2 + varlığında yaralı bir hücreye bağlıdır able FM boya girişi neden olan onarım (ve dolayısıyla hücresel FM boya floresan artışa) yaralanma sonrası bir dakika içinde ateşkes için (Şekil 2A, üst panel, Şekil 2B, mavi çizgi ve video 1 ve Şekil 2 animasyonlu) için. Aksine, Ca 2 + yokluğunda onarmak için izin verilen bir hücre, bu nedenle FM boya floresansta sürekli bir artış sürekli boya girişi ile sonuçlanır ve ayrıca, onarım başarısız da 4 dakika hasarı (Şekil 2A'da sonra, alt panel, Şekil 2B, kırmızı çizgi ve) Video 2 ve Şekil 2 animasyonlu. Hücre membran onarım eksikliği plato başarısız sürekli boya giriş olur Böylece, hücre zarı tamir, FM boya boyama bir platolaşmasının yol açar.
Protokol 3 yaralanmaya yanıt olarak veziküller ve proteinlerin hücre yüzey translokasyon izlemek için dökme (cam boncuk) yaralanma yaklaşımı kullanımını tarif eder. İşte thzarar görmemiş hücreler (Şekil 3A) kırmızı etiketlenmemiş ise e hücreler, bu şekilde dekstran TRITC varlığında yaralandı, ancak tüm yaralı hücreleri (Şekil 3B ve 3C), kırmızı etiketlenir. Hücre yüzey LAMP1 (Şekil 3A LAMP1 paneli) için primer antikor gösterisi arka plan seviyesi etiketleme ile tedavi edilmez yaralanmamış hücreleri. Hücreler yaralı ve kalsiyum mevcudiyetinde iyileştirmek için izin verilen, ancak, lizozomlar eksositosizini geçmesi ve bu şekilde yaralı (kırmızı etiketli) hücreleri (Şekil 3B) yüzeyinde LAMP1 boyanma artan seviyesi yoktur. Hücre yüzeyi LAMP1 etiketleme bu artış, kalsiyum yokluğunda (Şekil 3C) olarak iyileşmeye bırakılır hücrelerdeki çok daha düşüktür. Bu kalsiyum düzenlenir lizozomal ekzositoz doğasını ve dolayısıyla LAMP1 yüzey görünümünü gösterir. Bu nedenle, hem yüksek hücre yüzeyi LAMP1 boyama ile hücre sayısının ölçülmesi hem de seviyesini ölçmekBireysel yaralı hücreleri üzerinde hücre yüzey LAMP1 boyanması, yaralanma lizozomal eksositosizini tetikleyen geçmesi hücrenin yeteneği için önlem alınmasını sağlamaktadır.
Protokol 4 hücre membran hasarına yanıt olarak kinetik, doğası ve bireysel lizozom füzyonu konumu doğrudan izlenmesi için de kullanılabilir. Hücreler lizozomlar izleme yaralanma bireysel hücrelerin lizozomların eksositosizini tetiklenir (Şekil 4A ve video 3 animasyonlu). Şekil 4A tarafından görüntülendi (yeşil özetlenen) bir hücreyi gösterir sağlar TIRF görüntüleme, tarafından görüntülenmiş darbeli lazer ve hücre yüzeyinde tarafından yaralandı faz kontrast görüntüleme (sol panel) ve önceden yaralanma TIRF mikroskobu (orta panel), tarafından. Sağ paneli yaralanma sonrası aynı hücre 105 sn TIRF görüntü gösterir. Çeşitli yaralanma lizozomların tepkileri tetikleyen Şekil açıklanan 4B-E. Şekil 4B yaralanma lizozoma istihdamı tetikleyen gösterir (işaretliEkzositoz (animasyonlu Video 4 ve Şekil 4) takip hücre zarı gri daire) ile. Bu lizozom önce (Şekil 4B: panel -2.5 s) yaralanma TIRF görüntüde görünür değil, ama aşağıdaki yaralanma lizozom, hücre zarı ulaşır ve (Şekil 4B: Panel 102.5 s) saptanabilir hale vezikül yakın hareket ederken, Hücre zarı bu TIRF aydınlatma daha iyi heyecan ve füzyon gözenek lızozomal pH nötralizasyon neden olan ve bu nedenle FITC floresan dekstran (Şekil 4B: panel 104.8 ler) dequenching açar zaman lizozom FITC floresan dekstran maksimal değerine ulaşır. Daha sonra, yavaş yavaş dekstran (: panel 107.1 s Şekil 4B) azaltmak için yanal yayılmasına FITC floresan neden olan hücrenin dış ve vezikül floresan vezikül boşaltılır. İkinci kategoride, turuncu daire ile işaretlenmiş lizozom (Vid animasyonluvezikül exocytoses kadar panel 91 ler): panel -2.5 s), bu membran (Şekil 4C orada kalır: eo 5 Şekil 4) yaralanma öncesi (Şekil 4C mevcuttur. Füzyon (: 94.5 s Şekil 4C) aşağıdaki vezikül bazı FITC Dekstranın geride bırakarak: İşte lizozom kısmen (panel 93 ler Şekil 4C) ekzositozlanmış. Veziküllerin üçüncü ve dördüncü kategoriler zara sigorta yoktur. (Mavi bir daire ile işaretli) Şekil 4D 'de gösterilen lizozom ve uzak (Video 6 ve Şekil 4, hareketli), hücre zarı eksenel olarak hareket eder. Bu lizozom yaralanma (Şekil 4D: panel -2.5 s) önce hücre zarında görünür değil, ama yaralanma aşağıdaki hücre zarını yaklaşırken, bu TIRF mikroskobu (Şekil 4D: Panel 59.3 lar) ile görünür hale gelir. Bu hücre zarı (Şekil 4D: Panel 59.6 s) en yakın ulaştı ve sonra (Şekil 4D eritme olmadan uzaklaşıyor: pAnel 63.7 s). Dördüncü kategori lizozom zara yakın gelir ve. Şekil 4E (panel 8.7 ler) lizozoma gelişini gösteren yatay olarak hücre zarı (Video 7 ve Şekil 4, hareketli Şekil 4A'daki mor kutu ile işaretlenmiş alan) boyunca hareket eder , bu daha sonra, zar boyunca hareket eder ve görüntü dizisi görülebilir yaralanmadan (Şekil 4E: paneller 10.7, 11.9, 12.8, 18.8 s). Her lizozoma ve FITC dekstran floresan yoğunluğu miktarının yukarıdaki açıklamasına dayanarak - (Şekil 4E), eritme (Şekil 4B ve 4C) eksenel (Şekil 4D) hareketli ya da yatay hareket yaralanma lizozoma yanıtını belirleyen sağlar.
Şekil 1,. . Cam boncuk Toplu hücre zarı hasarı Görüntüler nükleer boyanma (Hoechst, sol panel) gösterir, yaralanma (yeşil boyama - FITC Dekstran), unrepaired hücreleri (kırmızı boyama - TRITC Dekstran), ve (Merge) görüntüleri birleşti. Kalsiyum varlığında (A) zarar görmemiş hücreler, (B), kalsiyum yokluğunda hücrelerin kalsiyum mevcudiyetinde hücrelerin yaralı ve (C) yaralı. Ölçek çubuğu 10 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. . (Turuncu özetlenen) hücrelerinin lazer yaralanmasına tepki olarak hücre zarı onarım gerçek zamanlı görüntüleme (A) Görüntü yaralanma [sol panel önce - aydınlık alan (BF) veepifluorışıma (epi)], 5 saniye, yaralanma sonrası 1 dk ve 4 dk. Yaralanma bölgesinde, beyaz bir okla gösterilir. Üst panel kalsiyum ve alt panelde mevcudiyetinde yaralı bir hücre kalsiyum yokluğunda yaralı bir hücre sini göstermektedir. (B) Grafik kalsiyum (mavi) varlığında, ya da kalsiyum (kırmızı) yokluğunda yaralı Panel A'daki hücrelerin FM boya boyama (ΔF/F0) 'de değişiklik gösteren. FM boya girer ve dolayısıyla floresan etiketleme artmış bölge floresan yoğunluğunun ölçümü için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 10 mikron). resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Kütle yaralanmaya yanıt olarak görüntüleme lızozomal ekzositozu. Görüntüler nükleer boyanma Hoechst (mavi), hücre yüzeyi LAMP1 boyama (yeşil), TRITC dekstran (kırmızı) gösterir ve primer antikor ile etiketlenmiş değil (A) yaralanmamış hücreleri tüm kanallar (bindirme) Birleştirme, (B) Yaralı hücreleri tamir için izin kalsiyum mevcudiyetinde, ve (C), kalsiyum yokluğunda tamir edilmesine bırakılmıştır yaralı hücreleri. Ölçek çubuğu 10 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Lazer yaralanmaya yanıt olarak lizozomal ekzositoz gerçek zamanlı görüntüleme. FITC etiketli dekstran lizozomlarında ile hücreler kalsiyum varlığında bir darbeli lazer tarafından yaralandı. (A) hücrenin sınır olduğuyaralandı (yeşil) özetlendi: Sol panel - parlak alan yaralanma öncesi, orta panel - yaralanma ve sağ panel öncesi TIRF - yaralanma sonrası TIRF 105 s. Yaralanma Site mavi kutu ve BE panellerde uzaklaştırdınız içindeki beyaz / mor kutuları ve renkli daireler ile gösterilen temsili bir alan ile işaretlenir. Bütün hücre görüntüdeki vezikül rengi (gri, turuncu ve mavi) bireysel lizozomların görüntülerde yakınlaştırılmış de renge karşılık gelir. (B) Sol panel yaralanma sonrası işe edilen bir vesikülün FITC floresan için ΔF/F0 değeri için bir grafiğini göstermektedir. Sağ panel yaralanma önce vezikül (-2.5 ler), prefüzyon (102.5 ler), füzyon (104.8 s) ve postfusion (107,1 ler) anlık gösterir. (C) Sol panel önce yaralanmaya yerleştirilmiş bir vesikülün FITC floresan için ΔF/F0 değeri için bir grafiğini göstermektedir. Sağ panel yaralanma önce vezikül (-2.5 ler), prefüzyon (91 ler), füzyon (93 s) ve postfusion (94.5 ler) anlık gösterir. (<strong> D) Sol panel () doğru ve bundan uzağa hücre zarından eksenel olarak hareket eden bir vesikülün FITC floresan için ΔF/F0 değeri için bir grafiğini göstermektedir. Sağ panel hasarı (-2.5 ler) önce vezikül anlık görüntülerini göstermektedir, ve 59.3, 59.6 ve 63.7 s zara yakın farklı bir konumda yaralanma sonrası. (8.7, 10.7, 11.9, 12.8 ve 18.8 s) de yaralanması (-2.5 ler) öncesi ve yaralanma sonrası çeşitli pozisyonlarda yatay hücre zarı boyunca hareket vesikülün (E) Anlık. Ölçek çubuğu (A = 10 mikron, B, C, D, E = 1 mikron). resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Animasyon video 1 Şekil 2: . kalsiyum varlığında lazer yaralanma tepki olarak hücre zarı onarımı Gerçek zamanlı görüntüleme (turuncu özetlenen) bir hücrede FM boya giriş pulsed yaralandıkalsiyum mevcudiyetinde lazer. Film her 2 sn edinilen 200 görüntüleri temsil eder. Hücre çerçevesine sonra 4 (mavi kare ile işaretlenmiş bölge) yaralandı. Zaman damgası saat zaman gösterir: dk: sn: msn biçimi. = 10 mikron ölçek çubuğu.
Hareketli görüntü 2 Şekil 2: . kalsiyum yokluğunda lazer yaralanmaya yanıt olarak hücre zarı onarım gerçek zamanlı görüntü kalsiyum yokluğunda darbeli lazer sakatlığı (turuncu özetlenen) bir hücrede FM boya girişi. Film her 2 sn edinilen 200 görüntüleri temsil eder. Hücre çerçevesine sonra 4 (mavi kare ile işaretlenmiş bölge) yaralandı. Zaman damgası saat zaman gösterir: dk: sn: msn biçimi. = 10 mikron ölçek çubuğu.
Animasyon video 3 Şekil 4: lizozomal exocyt Gerçek zamanlı görüntülemeLazer yaralanmaya yanıt olarak osis. bir hücrede lizozomların farklı karşılıklar darbeli lazerle yaralı (yeşil video 3'te gösterilmiştir). Film / sn 5 kare TIRF mikroskopi tarafından edinilen sıralı zaman atlamalı görüntüler 2 dk temsil eder. Aydınlık görüntüleri her 20 saniyede elde edildi. Hücre, bu videonun içine 2 saniyede (camgöbeği kutu ile gösterilir) yaralandı. (Gri, turuncu ve mavi) renkli daire ve mor kutu hücre hasarı takiben çeşitli kaderlerini gösteren, şekil 4'te tarif lizozomları ve animasyon videoları 4-7 işaretleyin. Zaman damgası saat zaman gösterir: dk: sn: msn biçimi. = 10 mikron ölçek çubuğu.
Hareketli görüntü 4 Şekil 4, yaralanmaya yanıt olarak membranına kabul edilir gri daire ile işaretlenmiş ekzositik lizozom gösterir. Bu video içine 7 sn (5 sn sonrası yaralanma) de lizozom, hücre zarında işe alırve sonra 1 dakika ve 47 saniye bu sitede sigortalar. = 1 mm ölçekli bar.
Animasyon video 5 şekil 4 önce bu site 1 dakika ve 35 saniye de yaralanma ve sigortalar için membran demirledi edildi turuncu daire ile işaretlenmiş ekzositik lizozoma gösterir. = 1 mm ölçekli bar.
Animasyon video 6 rakam 4 mavi daire ile işaretlenmiş lizozomlar uzak hücre zarından sonra doğru hareket ve gösterir. = 1 mm ölçekli bar.
Animasyon video 7 rakam 4 lizozoma yaralanması biri aşağıdaki nerede Video 3 mor kutu ile işaretlenmiştir hücrenin bir bölge gösterir (beyaz daire) AL hamlehücre zarı ong. = 1 mm ölçekli bar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo hücre zarı hasarı, fizyolojik stres çeşitli ve çok sayıda deneysel yaklaşım, bu taklit etmek için geliştirilmiştir oluşur. Bunlar çanak onları kazıyarak ya da dar bir delik şırınga 9,10 ile pasajlanarak yapışık hücrelerin hücre zarı yaralanmasına içerir. Gibi yaralanmalar sonrasında hücreler süspansiyonda iyileşmesi ve normal dokuda olduğu gibi hücre dışı matrisin yapışık değildir. Bu gözenek oluşturucu toksin kullanımı Yine bazıları, kimyasal olarak kolesterol gibi ekstre lipidler tarafından hücre zarı değiştirebilir, bu nedenle in vivo mekanik yaralanma 5 taklit değildir. Böylece, hücre hasarı için kullanılan yöntem, onarım yanıtı hakkında öğrenilebilir ne etkileyebilir. Bu, hücre hasarı tahlilin seçiminde sadece çok dikkatli olunması değil, aynı zamanda daha iyi in vivo mekanik yaralanma taklit yaklaşımları tercih gerektirir. Bu tür yaklaşımlar hücrelerin bir tek tabakalı yaralı çizik yaralanma (dahilBir neşter veya iğne) ve cam boncuk yaralanma (yaralanma yapışık hücreleri üzerinde yuvarlayarak cam boncuklar neden olduğu) tarafından. Bu yaklaşımlar da topluca hücreleri yaralanmasına için uygundur, ancak hücre zarı onarım sürecinin gerçek zamanlı görüntüleme için uygun değildir. Darbe noktasında lokalize ve iyi kontrol yaralanmaları oluşturmak mikroiğnelerin ve darbeli lazer kullanılması, in vivo olarak, mekanik ve travmatik yaralanma taklit ve onarım yanıtı gerçek zamanlı görüntülenmesi için uygun olan, ancak bir anda bir hücre onarım hakkında fikir sunar. Bu darbeli lazer yaralanma yaklaşım, membran lipitleri yaralanma zar gibi photoxidative ve fototermal hasar gibi fizyolojik olmayan etkilere neden olduğu bilinmektedir lokalize ısınma neden olduğu nonpulsed lazer ile hücre membranının uzun ışımasıyla kullanımından farklı olduğu kayda değerdir ve sitosolik bileşenler 11.
Burada anlatılan protokollerin bir o potansiyelini sokmak izincam boncuklar kullanımına dayanır ve yeteneği, kinetik ve mikrometre boyut yaralanma sonrası hücre zarı onarımında yer alan hücre içi kaçakçılığı izlenmesi için lokalize yaralanma yaklaşımı (pulsed laser) bir f topluca yaralanma yaklaşımı,. Bu yaklaşımlar karşılıklı ücretsizdir - toplu yaralanma tamir yeteneği ve onunla ilişkili subselüler ticaretine açık tanımlamak için hücrelerin bir nüfus kullanarak sağlar. Bireysel hücrelerin tamir gerçek zamanlı görselleştirme sağlayarak, lazer yaralanma yaklaşım hücre zarı onarım aşaması ve subsellüler ne olaylar tamir açığı ile ilişkili olduğunu tespit sağlar. Bu yaklaşım, memeli ve omurgasız organizma 7,12,13 hücre membran onarım izlenmesi için kullanılmıştır. Deneyin ihtiyaçlarına göre bu iki yaklaşımın, ya kendi başına kullanılabilir. Tamir açığının doğası bilinen ya da hücre içi mekanizma t dahil değildir Ancak,Bu yaklaşımların bir kombinasyonu kullanılarak, bilinmemektedir onun süreci yararlıdır.
Nedeniyle tabanlı uç noktasında numune hücre hasarı tahliller arasında yaralı hücrelerin sayısında doğal değişkenliği bağımsız onarmak başardı yaralı hücreleri, ve onarmak için başarısız olanları belirlemek için gereklidir. Burada anlattığımız cam boncuk yaralanma yaklaşımı bu hücrelerin belirlenmesini sağlar. Yaralama cam boncuk yaparken kendileri hafif yaralanmalar yaralı hücrelerin sayısını arttırmak için çaba yaparken böylece hücreler birden fazla hit almıyorsunuz önemlidir. Tekrarlanan yaralanma hücreleri (onaracak fakir olduğunu seçici olanlar) işlem sırasında ölür ve lamel ayırmak neden olacaktır çünkü bu önemlidir. Bu onarım için başarısız bir hücre olduğundan düşük olmasına neden olur. Bu yeni bir yaralanma ortadan kaldırmak için lamelleri taşıma ve yıkama sırasında cam boncuklar bir haddeleme önlemek için de önemli olankırmızı boyama (yanlış pozitif hücreleri) neden olur. Yaralanma için bu yaklaşım aynı zamanda lizozom ilişkili membran proteini 1 (LAMP1) burada gösterilmiş olduğu gibi, ilgi konusu proteinin hücre yüzeyi translokasyonu için bir hücre popülasyonu izleme sağlar. Immünofloresan sadece hücre yüzeyi proteinleri lokalize gözlendiği zaman önemli bir gerekliliktir tespit önce ilgi ve immunolabel hücre proteinin hücre-dışı alanını bağlanan antikorları kullanmaktır. Bu zarar görmemiş hücreler veya farklı hücre popülasyonları arasında yaralı hücrelerinde hücre membranında LAMP1 seviyesinin karşılaştırılması sağlar. Bu protokol kullanılarak LAMP1 tasvir edilmiş olmakla beraber, bu proteinin hücre-dışı etki alanı için özel bir antikor var olduğu için tercih edilen bir başka protein ile uygulanabilir. Yaralanma tetiklenen lizozomal ekzositozu lizozomal ekzositoz (yaralanma tarafından tetiklenen değil) benzer bazal oranına sahip kurulmuş değil iki hücre arasında karşılaştırıldı gerektiğinde, Zarar görmemiş hücreler üzerinde hücre yüzeyi LAMP1 boyama da ölçülmelidir. Bunun için ilave bir örnek sadece bu adım 9'da hücreler, birincil antikor ile inkübe edilmelidir dışında örnek C2 olarak kabul edilir. Bu lızozomal Ekzositoz bazal oranı bir ölçüsünü sağlar.
Lazer yaralanma protokolü için hücre zarları bir yüksek yoğunluklu tek foton NSEC darbeli lazer ile yaralandı. Yaralama floresan artar bağlayıcı endomembran üzerine (örneğin, FM 1-43) hücre geçirgenliği olmayan boya varlığında gerçekleştirilir. Bu durumda, hücre bağlantılı floresan boya aşağıdaki kez 3 iyileştirmek için hücre tarafından alınan bir ölçü sağlar. Lazer yaralanma FM, boya floresansında bir artış ile sonuçlanan, hücreye girerek endomembranes bağlamak için FM boya neden olur. Hasarlı hücre zarının tamiri hücrenin içine daha fazla boya girişini engellemektedir. Bu durumda, bir hücre için boya tamir başarısız ise onarım, boyanın flüoresan olarak düz seviyeye ulaşan bir hücre içinfloresan sürekli olarak artar.
Hücre zarı onarımı ile ilgili bireysel subselüler olayların canlı hücre görüntüleme gürültü oranı yüksek sinyal de hücre zarını izleme gerektirir. Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi gürültü oranı 14-16 yüksek bir sinyalde görüntüleme hücre yüzey etkinlikler için uygundur bir yaklaşımdır. Pek çok ticari olarak temin edilebilir TIRF sistemleri ve canlı hücre görüntüleme ile uyumlu Bu sistemlerin herhangi biri kullanılabilir. Ayrıca, başka bir yerde 17,18 yapımı TIRF mikroskopları kurmak için yaklaşımlar tarif var. TIRF kurulum bağımsız önce hücre içi veziküller çeşitli kaderlerini takip ve yaralanma sonrası olanak yaklaşımları oluşturmak için bir ihtiyaç vardır. Başka bir yerde her lizzom 19 füzyon izlenmesi doğası, süresi ve derecesine izin gibi yaklaşımların bir tartışma sağladı. Yaralanma izlemek için lizozom FITC-etiketli dekstran ekzositozu tetiklenenprotokolü 4 gözlemlemek için anahtar özelliği açıklanan mes basması. Flaş floresans yanal yayılması ile sonuçlanan tek bir aşamada tek lizozom içinde ihtiva FITC dekstran salınmasını içerir. Her flaş Genellikle tek lizozoma bir ekzositik füzyon işaret ederken, birçok lizozomlar füzyon siteye önce mevcut nasıl izlenmesi ve flaş izleyerek bu tesis için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Fransız Müsküler Distrofi Derneği (AFM) ile AD Sağlık Hibeler AR055686 ve AR060836 ve doktora sonrası dostluk Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan hücresel görüntüleme tesis Sağlık Hibeler HD040677 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K.
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
