Summary
Het genezingsproces beschadigde cellen omvat handel specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten aan de plaats van celmembraan schade. Dit protocol beschrijft assays deze processen volgen.
Abstract
Het vermogen van beschadigde cellen te genezen is een fundamenteel cellulair proces, maar cellulaire en moleculaire mechanismen betrokken bij genezing beschadigde cellen worden slecht begrepen. Hier assays zijn beschreven om het vermogen en de kinetiek van genezing van gekweekte cellen na gelokaliseerde schade controleren. Het eerste protocol beschrijft een eindpunt gebaseerde benadering van celmembraan herstel vermogen van honderden cellen tegelijkertijd te beoordelen. Het tweede protocol beschrijft een real-time imaging benadering om de kinetiek van celmembraan reparatie in individuele cellen na gelokaliseerde letsel met een gepulste laser controleren. Als genezing beschadigde cellen betreft handel in specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten om de plaats van het letsel, de derde protocol beschrijft het gebruik van bovenstaande eindpunt gebaseerde benadering van een dergelijke handel event (lysosomale exocytose) in honderden cellen gewond gelijktijdig beoordelen en het laatste protocol beschrijft het gebruik van gepulste laser letsel met TIRF microskopie aan de dynamiek van de individuele subcellulaire compartimenten in beschadigde cellen bij hoge ruimtelijke en temporele resolutie monitoren. Terwijl de protocollen Hier wordt de toepassing van deze benaderingen het verband tussen celmembraan reparatie en lysosomale exocytose in gekweekte spiercellen bestuderen, kunnen ze worden toegepast als zodanig voor andere hechtende gekweekte cellen en subcellulaire compartiment keuze.
Introduction
Celmembraan handhaaft de integriteit van de cellen door een barrière tussen de cellen en de extracellulaire omgeving. Een chemische, elektrische of mechanische stimulus die de normale fysiologische drempel en de aanwezigheid van binnendringende pathogenen dan kan elk letsel aan het celmembraan en leiden tot een latere cellulaire respons op de schade te herstellen. Om deze verwondingen overleven de celmembraan, cellen beschikken over een efficiënt mechanisme voor reparatie. Dit mechanisme is calcium afhankelijk en gaat intracellulair verkeer van eiwitten zoals annexinen en MG53 oa evenals subcellulaire compartimenten zoals endosomen, lysosomen, Golgi afgeleide blaasjes en mitochondriën aan de benadeelde celmembraan 1-7. Toch blijft de gegevens van de sequentie van moleculaire en subcellulaire gebeurtenissen betrokken bij het herstel van beschadigde celmembraan slecht begrepen.
Reparatie reactie cel kan worden gescheiden in het oorly en late reacties. Vroege reacties, die binnen seconden tot minuten tijdschaal, zijn enorm belangrijk bij het bepalen van de aard van de late reacties die leiden tot succesvol herstel van cellen of celdood. Eindpunt assays gebaseerd op bulk biochemische en cellulaire analyse hebben meegewerkt aan de totstandkoming van de betrokkenheid van de moleculaire en cellulaire processen in de reparatie. Maar vanwege de heterogeniteit en de snelheid van cellulaire reparatiereactie, eindpunt assays niet de kinetische en ruimtelijke data van de reeks gebeurtenissen die tot herstelling. Benaderingen die gecontroleerde schade van celmembraan mogelijk en laat de controle celmembraan reparatie en bijbehorende subcellulaire reacties op hoge ruimtelijke en temporele resolutie zijn ideaal voor dergelijke studies. Hier hebben dergelijke benaderingen gepresenteerd. Twee van de protocollen beschreven benaderingen van de real-time kinetiek van celmembraan reparatie en de subcellulaire responsen geassocieerd met het reparatieproces in levende cellen na laser inj bewakenUry. Ter aanvulling op deze live cell imaging gebaseerde testen, hebben eindpunt assays ook beschreven dat een populatie gebaseerd maatregel voorzien in toezicht reparatie van individuele cellen en de bijbehorende subcellulaire reacties. Om hun nut bewijzen deze benaderingen zijn gebruikt om mensenhandel en exocytose van lysosomen bewaken in reactie op celmembraan letsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Imaging celmembraan Reparatie behulp Bulk (Glass Bead) Verwonden
Met dit protocol kunt afzonderlijk markeren van de beschadigde cellen en degenen die niet te genezen. Kwantificeren van deze populaties van cellen vereist het gebruik van drie voorwaarden: 1. Test (C1) - Cellen mogen te herstellen in aanwezigheid van Ca 2 +, 2. Controle 1 (geen schade C2) - Cellen worden geïncubeerd in aanwezigheid van Ca2 +, maar niet gewond en 3. Control 2 (geen reparatie C3) - cellen zijn toegestaan om te herstellen in afwezigheid van Ca 2 +.
- Kweek cellen> 50% confluentie drie steriele dekglaasjes en was C1 en C2 tweemaal met CIM bij 37 ° C en C3 met PBS bij 37 ° C en overdracht dekglaasjes op silicone O-ringen.
- Voeg 100 ul van voorverwarmde FITC dextran oplossing CIM van C1 en C2 of C3 PBS.
- Verwonden plasmamembraan bij C1 en C3 door zacht glooiende 40 mg glazen kralen over het dekglaasje bij kamertemperatuur door het handmatig kantelen dekglaasjes terug enweer 6-8 keer onder een hoek van 30 °.
Opmerking: Bij lichte blessure, zorgen de glazen kralen zijn gelijkmatig verdeeld, dus het minimaliseren van herhaling verwondingen. Om reproduceerbaarheid schade tussen monsters verbeteren, tegelijkertijd uitvoeren van de glaskraal schade van de verschillende monsters te vergelijken. - Om verdere rollen kralen; breng dekglaasjes tot een 37 ° C incubator bij omgevingstemperatuur CO2 en laat reparatie men gedurende 5 minuten.
- Zonder dat de korrels rollen, het glazen kralen en FITC dextran door wassen met CIM (C1 en C2) of PBS (C3) bij 37 ° C.
- Plaats coverslips terug op de O-ring en voeg 100 ul van voorverwarmde lysine fixable TRITC dextran oplossing CIM op C1 en C2 of in PBS op C3.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur CO2.
- Was tweemaal met dekglaasjes voorverwarmde CIM en bevestig met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was tweemaal met PBS en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur Hoechst kleurstof.
- Wassen samples tweemaal met PBS, monteren op een dia met behulp van montage media en imago cellen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.
- Gebruik cellen van C2 naar de achtergrond rode en groene kleurintensiteit bepalen en deze waarde drempel de rode en groene kanalen voor alle monsters (C1-C3).
- Score totaal aantal cellen dat a) groene (gewonden en gerepareerd) en b) rood of beide rood en groen (gewonden, maar niet te repareren) C1 en C3 monsters.
- Telling> 100 greens cellen voor elke voorwaarde en drukken de fractie van cellen die niet te repareren als percentage van alle cellen gewonden (groen en rood).
2. Live-Imaging van de kinetiek van celmembraan Reparatie Na Laser Injury
- Was de cellen met voorverwarmde CIM en zet dan het dekglaasje in CIM met FM kleurstof.
- Plaats het dekglaasje in een houder in de bovenste fase incubator op 37 ° C.
- Selecteer een 1-2 mm2 gebied van het celmembraan en bestralen voor <, 10 msec met gepulste laser. Verzwakken het laservermogen via de software tot 40-50% van het piekvermogen. Optimale voeding laat consistent, maar niet-dodelijke verwondingen en dit moet worden bepaald door trial and error voor elk individueel instrument en cellijn wordt gebruikt.
- Te repareren, afbeelding controleren elke 10 seconden in epifluorescentie en helderveld, ingaan vóór letsel en blijven voor 3-5 minuten na letsel.
Opmerking: Voor geen reparatie controle, herhaalt u de stappen 2,1-2,4 met de cellen gewond bij PBS met FM-kleurstof. - Om de kinetiek van de reparatie te kwantificeren, meten cellulaire FM kleurstof fluorescentie en plot de verandering in intensiteit (ΔF/F0) in de loop van de beeldvorming. Deze gegevens worden gemiddeld voor meer dan 10 cellen per conditie en uitgezet als gemiddelde waarde of individuele cel, zoals nodig.
3. Imaging Bulk (Glass Bead) Letsel Induced Lysosomal Exocytosis
De volgende monsters omvatten cellen gekweekt tot> 50%samenvloeiing: 1. Test (C1) - cellen toegestaan te herstellen in aanwezigheid van Ca 2 +, 2. Controle 1 (C2; geen letsel) - Cellen noch gewond noch geïncubeerd met primair antilichaam, en 3. Control 2 (C3; geen reparatie) - Cellen toegestaan om te herstellen in afwezigheid van Ca 2 +.
- Was dekglaasjes C1 en C2 tweemaal met CIM bij 37 ° C en C3 met PBS bij 37 ° C en overbrengen op silicone O-ringen.
- Voeg 100 ul voorverwarmde lysine vastzetbaar TRITC dextran CIM van C1 en C2 en C3 in PBS op.
- Verwonden plasmamembraan bij C1 en C3 zoals in stap 1.3.
- Om verdere rollen kralen; breng dekglaasjes tot een 37 ° C incubator bij omgevingstemperatuur CO2 en laat reparatie men gedurende 5 minuten.
- Verwijder de glazen kralen en TRITC dextran door het wassen van de dekglaasjes in koud groeimedium en zorgt op geen rollen van de glasparels op de cellen.
- Spoel tweemaal de dekglaasjes met koud kweekmedium en transfer naar de O-ringen.
- Naar C1 en C3Voeg 100 ul rat anti-muis antilichaam LAMP1 koud volledig groeimedium en voeg de koude, compleet groeimedium C2.
- Om antilichaambinding dekglaasjes Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Was de dekglaasjes driemaal met koud CIM en vast alle coverslips met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en spoel 3x met CIM.
- Incubeer alle dekglaasjes in 100 ui blokkerende oplossing gedurende 15 min bij KT
- Incubeer alle dekglaasjes in 100 pl Alexa Fluor 488 anti-rat antilichaam gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
- Was tweemaal met PBS en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur Hoechst.
- Was de cellen tweemaal met PBS, monteren op een dia met behulp van montage-media en het beeld met behulp van een epifluorescentiemicroscoop.
- Afbeeldingen gebruiken C2 cellen, bepalen de niet-specifieke achtergrondkleuring in het rode (TRITC dextran) en groene (Alexa Fluor 488 antilichaam) kanalen en deze gebruiken achtergrondkleuring waarden drempel de rode en groene kanalen voor alle monsters (C1-C3). </ Li>
- Gebruik> 100 rode gemerkte cellen uit C1 en C3 aan de intensiteit van kleuring LAMP1 (groen) in beschadigde cellen te meten. Voor een succesvolle experiment LAMP1 kleuring in cellen C3 aanzienlijk lager dan in cellen van C1 zijn.
4. Live-Imaging van celmembraan Injury Getriggerd Subcellulaire Trafficking
- Fluorescent label de compartiment van rente door transfecteren geschikte reporter (bijv. CD63-GFP voor 8 lysosomen) of met behulp van fluorescerende kleurstoffen 9.
- Voor de etikettering lysosomen met fluorescerende kleurstof, incubeer cellen gekweekt tot 50% confluentie in groeimedia met FITC-dextran
- Laat dextran worden endocytosed 2 uur (of langer als nodig is voor voldoende endosomal labeling met dextran door de cellijn van belang) in de CO 2 incubator.
- Was de cellen met voorverwarmd groeimedium en incubeer daarin gedurende 2 uur in een CO2 incubator om alleendocytose dextran ophopen in het lysosoom.
- Voor beeldvorming, spoel het dekglaasje in voorverwarmde CIM en houder van een dekglaasje houder op het podium top incubator bij 37 ° C.
- Voer groothoek (voor verkeer in de cel) of TIRF (verkeer aan het celoppervlak en exocytose) imaging - cellen die niet FITC gelabelde dextran kan druk lysosomen zijn ideaal voor beeldvorming van de verplaatsing en exocytose individuele lysosomen.
- Uitlijnen van de TIRF lasers voor imaging microscoop: Gebruik 60X of 100X doelstelling met> 1.45 NA. Stel de hoek voor het incident TIRF laserstraal met behulp van de aanpak van de fabrikant.
- Verwonden celmembraan door bestraling een kleine (1-2 mm 2) regio <100 msec, met de gepulste laser op 40-50% verzwakking.
- Om de reactie van lysosoom controleren om schade afbeeldingscellen cel 4-6 beelden / sec gedurende minstens 2 minuten of langer, afhankelijk van de dynamiek van exocytose in de cellen van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protocollen hier beschreven voor de enkele-cell imaging zijn om het vermogen en de kinetiek van celmembraan reparatie (Protocollen 1 en 2) en de subcellulaire mensenhandel en fusie van lysosomen tijdens de reparatie te controleren (Protocollen 3 en 4).
Protocol nr. 1 toont een bulk test waarmee markering alle beschadigde cellen en het identificeren van die beschadigde cellen die niet te repareren. De resultaten in Figuur 1 laten zien dat, terwijl de niet-beschadigde cellen (Figuur 1A) ongelabelde blijven cellen gewond door glas kraal in aanwezigheid van FITC dextran worden groen (figuren 1B en 1C) gemerkt. Wanneer de cellen mogen herstellen in aanwezigheid van Ca 2 + de meeste gewonden (groene) cellen in slagen om te herstellen en zijn niet gemarkeerd (rood) door TRITC dextran (Figuur 1B). Wanneer cellen mogen te herstellen in de afwezigheid van Ca2 +, de meeste van de beschadigde cellen worden ook gekenmerkt door de rode TRITC dextran (Figuur 1C). Cellen die nooit werden verwond hebben geen etikettering met de TRITC dextran tonen. Aldus, in een gegeven monster dat het aantal cellen alleen groen gelabeld verschaft een maat voor de cellen die waren verwond glasparels en hersteld, terwijl dat het aantal dubbele (rood en groen) gelabelde cellen verschaft een maat voor de cellen die mislukt om te herstellen van een blessure.
Protocol 2 beschrijft de beoordeling van de kinetiek van celmembraan reparatie door toezicht op de invoer van FM kleurstof in de cel. Bij incubatie in FM kleurstof, intacte cellen tonen de celmembraan kleuring (Figuur 2A voor letsel WF paneel). Na een plaatselijke laser letsel van celmembraan FM kleurstof begint de cel binnendringt en bindende endomembranes, die een plotselinge toename van FM kleurstof fluorescentie (Figuur 2B) veroorzaakt. Aangezien de capaciteit van celmembraan na laser schade te herstellen is afhankelijk van Ca2 +, een cel geblesseerd aanwezigheid van Ca 2 + able te repareren, waardoor de FM-kleurstof-invoer veroorzaakt (en dus verhoging van de cellulaire FM kleurstof fluorescentie) verdween binnen een minuut na een blessure (Figuur 2A, bovenste paneel, Figuur 2B, blauwe lijn, en geanimeerde Video 1 en Figuur 2). Integendeel, een cel mogen te herstellen in de afwezigheid van Ca2 +, niet te repareren, waardoor continue kleurstof binnenkomst en daardoor voortdurende stijging van FM kleurstof fluorescentie zelfs 4 minuten na verwonding (figuur 2A, onderste paneel, Figuur 2B, rode lijn en geanimeerde Video 2 en figuur 2). Zo celmembraan reparatie leidt tot een plateauing van de FM-kleurstof kleuring, terwijl gebrek aan celmembraan reparatie continue kleurstof item dat niet in slaagt om plateau veroorzaakt.
Protocol nr. 3 beschrijft het gebruik van bulk (glas kraal) letsel aanpak celoppervlak translocatie van blaasjes en eiwitten bewaken in reactie op letsel. Hier the cellen geblesseerd aanwezigheid van TRITC dextran aldus, terwijl de niet-beschadigde cellen niet rood (figuur 3A) gemerkt, maar de gewonde cellen rood (Figuren 3B en 3C) gemerkt. De ongedeerde cellen die niet behandeld worden met primaire antilichaam tonen achtergrondniveau etikettering voor celoppervlak LAMP1 (figuur 3A LAMP1 paneel). Echter, wanneer de cellen gewond en mogen genezen in aanwezigheid van calcium, lysosomen exocytose ondergaan en daarom is er meer uitgebreide LAMP1 vlekken op het oppervlak van de gewonde (rood gemerkt) cellen (Figuur 3B). Deze toename in celoppervlak LAMP1 labeling veel geringer in cellen die mogen genezen zonder calcium (figuur 3C). Dit toont de calcium gereguleerde aard van lysosomale exocytose en dus oppervlakteverschijning van LAMP1. Dus beide, dat het aantal cellen met hoge celoppervlak LAMP1 kleuring en meten van het niveauvan celoppervlak LAMP1 vlekken op individuele beschadigde cellen, in maatregelen voor het vermogen van de cel om te ondergaan letsel veroorzaakt lysosomale exocytose.
Protocol 4 kan worden gebruikt voor directe controle van de kinetiek, de aard en locatie van individuele lysosoom fusie reactie op celmembraan schade. De cellen worden verwond door de gepulste laser en celoppervlak lysosomen worden afgebeeld door TIRF beeldvorming, die zorgt voor de opvolging letsel veroorzaakt exocytose van lysosomen in individuele cellen (figuur 4A en geanimeerde Video 3). Figuur 4A toont een cel (aangegeven in groen) gevisualiseerd door fase contrast beeldvorming (linker paneel) en door TIRF microscopie (middelste paneel), voorafgaand aan het letsel. Rechterdeel verschijnt TIRF beeld van dezelfde cel 105 sec na verwonding. Diverse letsel veroorzaakt reacties van de lysosomen worden beschreven in de figuren 4B-E. Figuur 4B toont letsel veroorzaakt aanwerving van een lysosoom (gemarkeerddoor grijze cirkel) aan het celmembraan gevolgd door exocytose (geanimeerde video 4 en figuur 4). Dit lysosoom is niet zichtbaar in beeld TIRF voor schade (Figuur 4B: paneel -2.5 s), maar na verwonding het lysosoom komt bij het celmembraan en wordt detecteerbaar (Figuur 4B: 102,5 paneel s), de vesicle dichter bij de celmembraan het beter is enthousiast over de TIRF verlichting en de lysosomale FITC dextran fluorescentie maximale waarde bereikt wanneer de fusie porie opent waardoor neutralisatie van de lysosomale pH en dus dequenching van de FITC dextran fluorescentie (Figuur 4B: paneel 104,8 s). Vervolgens wordt het dextran wordt uit het blaasje aan de buitenkant van de cel veroorzaken FITC fluorescentie lateraal verspreiden en het blaasje fluorescentie geleidelijk af (Figuur 4B: 107,1 paneel s). In de tweede categorie, de lysosoom (aangegeven door een oranje cirkel, geanimeerde Video 5 Figuur 4) aanwezig is voor letsel (Figuur 4C: paneel -2.5 s), blijft er op het membraan (Figuur 4C: paneel 91 s) tot het blaasje exocytoses. Hier exocytosed het lysosoom gedeeltelijk (Figuur 4C: paneel 93 s) met achterlating van een aantal FITC dextran in het blaasje volgende fusie (Figuur 4C: 94,5 s). De derde en vierde groepen vesicles niet fuseren met het membraan. De in figuur 4D lysosoom (aangegeven door blauwe cirkel) axiaal beweegt naar en weg van de celmembraan (geanimeerde video 6 en figuur 4). Dit lysosoom is niet zichtbaar op het celmembraan voor letsel (Figuur 4D: paneel -2.5 s), maar bij het naderen van celmembraan na letsel is zichtbaar door TIRF microscopie (Figuur 4D: paneel 59,3 s) wordt. Het bereikte dichtst bij het celmembraan (Figuur 4D: paneel 59,6 s) en verplaatst weg zonder versmelten (Figuur 4D: panel 63,7 s). De lysosoom in de vierde categorie komt dichtbij het membraan en beweegt horizontaal langs de celmembraan (gebied aangeduid door de paarse vak in figuur 4A, geanimeerde video 7 en figuur 4). Figuur 4E (paneel 8,7 s) toont de komst van de lysosoom Deze beweegt langs het membraan en kan worden gezien in de reeks beelden verwonding plaatsen (Figuur 4E: panels 10.7, 11.9, 12.8, 18.8 s). Op basis van de bovenstaande beschrijving kwantificeren FITC dextran fluorescentie intensiteit van elke lysosoom - fuseren (Figuren 4B en 4C), axiaal bewegen (figuur 4D) of horizontaal beweegt (figuur 4E) kan bepalen lysosoom reactie op letsel.
Figuur 1. . Bulk celmembraan letsel door glazen kralen Foto's tonen nucleaire kleuring (Hoechst, linker paneel), schade (groene vlekken - FITC dextran), gerepareerde cellen (rode vlekken - TRITC dextran) en samengevoegde afbeeldingen (samenvoegen). (A) onbeschadigd cellen in de aanwezigheid van calcium, (B) beschadigde cellen in aanwezigheid van calcium, en (C) verwonde cellen in afwezigheid van calcium. Schaalbalk 10 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. . Real time beeldvorming van celmembraan reparatie naar aanleiding laser schade (A) Afbeelding van cellen (in het oranje) voor letsel [linkerpaneel - helder veld (BF) enepifluorescentie (epi)], 5 sec, 1 min en 4 min na beschadiging. De plaats van de verwonding wordt aangeduid door een witte pijl. Bovenpaneel toont een cel geblesseerd aanwezigheid van calcium en onderste paneel toont een cel geblesseerd afwezigheid van calcium. (B) grafiek die de verandering FM kleurstof kleuring (ΔF/F0) van de cellen in paneel A geblesseerd aanwezigheid van calcium (blauw) of bij afwezigheid van calcium (rood). Het gebied waar FM kleurstof binnenkomt en derhalve fluorescentie labeling verhoogd werd gebruikt voor de kwantificering van de fluorescentie intensiteit. Schaal bar = 10 micrometer). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Imaging lysosomale exocytose in reactie op bulk letsel. Beelden tonen kernkleuring Hoechst (blauw), celoppervlak LAMP1 kleuring (groen), TRITC dextran (rood) en samenvoegen van alle kanalen (overlay) van (A) niet gewond cellen niet gelabeld met primaire antilichaam, (B) Gewonde cellen toegestaan om reparatie in aanwezigheid van calcium, en (C) beschadigde cellen toegestaan te herstellen in de afwezigheid van calcium. Schaalbalk 10 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Real-time beeldvorming van lysosomale exocytose in reactie op laser letsel. Cellen met FITC dextran gelabelde lysosomen raakten gewond door een gepulste laser in aanwezigheid van calcium. (A) De begrenzing van de cel diewerd gewond is geschetst (in groen): linker paneel - helder veld voor letsel, middelste paneel - TIRF voor letsel en rechter paneel - TIRF 105 s na een blessure. De plaats van het letsel wordt gekenmerkt door het vakje cyaan en de vertegenwoordiger gebied aangegeven met wit / paarse dozen en gekleurde cirkels binnen hebt in panelen BE. De kleur van het blaasje in het beeld volledige cel (grijs, oranje en blauw) overeenkomt met de kleur in de ingezoomde beelden van individuele lysosomen. (B) Linker paneel toont een plot voor de ΔF/F0 waarde voor de FITC fluorescentie van een blaasje aangeworven na een blessure. Rechter paneel toont momentopnamen van het blaasje voor letsel (-2,5 s), prefusion (102,5 s), fusie (104,8 s) en postfusion (107.1 s). (C) Linker paneel toont een plot voor de ΔF/F0 waarde voor de FITC fluorescentie van een blaasje voorafgaand aan het letsel aangemeerd. Rechter paneel toont momentopnamen van het blaasje voor letsel (-2,5 s), prefusion (91 s), fusie (93 s) en postfusion (94,5 s). (<strong> D) Linker paneel toont een diagram voor het ΔF/F0 waarde voor de FITC fluorescentie van een blaasje axiaal bewegen (naar en van de celmembraan). Rechter paneel toont momentopnamen van het blaasje voor letsel (-2,5 s), en na een blessure op verschillende positie in de buurt van het membraan bij 59,3, 59,6 en 63,7 s. (E) Snapshots van het blaasje dat horizontaal langs de celmembraan verhuisde op verschillende posities voordat letsel (-2,5 s) en na een blessure op (8.7, 10.7, 11.9, 12.8 en 18.8 s). Schaal bar (A = 10 micrometer, B, C, D, E = 1 micrometer). Klik hier voor grotere afbeelding.
Geanimeerde video 1 Figuur 2: . real-time beeldvorming van celmembraan reparatie naar aanleiding van laser letsel in aanwezigheid van calcium FM kleurstof binnenkomst in een cel (in het oranje) gewond door gepulstelaser in aanwezigheid van calcium. De film vertegenwoordigt 200 beelden om de 2 sec verworven. De cel werd gewond (regio gekenmerkt door de cyaan vierkant) na frame 4. Het tijdstip geeft de tijd in uur: min: sec: msec formaat. Schaal bar = 10 micrometer.
Geanimeerde video 2 Figuur 2: . real-time beeldvorming van celmembraan reparatie naar aanleiding van laser letsel in afwezigheid van calcium FM kleurstof binnenkomst in een cel (in het oranje) gewond door gepulste laser in afwezigheid van calcium. De film vertegenwoordigt 200 beelden om de 2 sec verworven. De cel werd gewond (regio gekenmerkt door de cyaan vierkant) na frame 4. Het tijdstip geeft de tijd in uur: min: sec: msec formaat. Schaal bar = 10 micrometer.
Geanimeerde video 3 Figuur 4: Real-time beeldvorming van lysosomale exocytosis in reactie op laser letsel. Verschillende reacties van lysosomen in een cel (in het groen omlijnd, Video 3) gewond door gepulste laser. De film vertegenwoordigt 2 min van opeenvolgende time-lapse beelden door TIRF microscopie verworven op 5 beelden / sec. Helderveld beelden werden elke 20 sec verworven. De cel werd verwond (aangeduid door een kader cyaan) op 2 sec in deze video. De gekleurde cirkels (grijs, oranje en blauw) en de paarse doos markeren de in figuur 4 beschreven lysosomen en geanimeerde video 4-7, tonen hun diverse lot na celschade. Het tijdstip geeft de tijd in uur: min: sec: msec formaat. Schaal bar = 10 micrometer.
Geanimeerde video 4 figuur 4 toont exocytische lysosome gekenmerkt door grijze cirkel die is aangeworven om het membraan in reactie op letsel. Op 7 sec (5 sec na verwonding) in deze video wordt het lysosoom ingedeeld in de celmembraanen dan zekeringen op deze site op 1 min en 47 sec. Schaal bar = 1 mm.
Geanimeerde video 5 figuur 4 toont exocytische lysosome gemarkeerd met oranje cirkel die was aangemeerd in de membraan voorafgaand aan letsel en zekeringen op deze site 1 min en 35 sec. Schaal bar = 1 mm.
Geanimeerde video 6 figuur 4 toont lysosomen gemarkeerd door blauwe cirkel op weg naar en vervolgens van de celmembraan. Schaal bar = 1 mm.
Geanimeerde video 7 figuur 4 toont een gebied van de cel gekenmerkt door paars box aan Video 3 waar na letsel een van de lysosoom (witte cirkel) beweegt al.ong het celmembraan. Schaal bar = 1 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celmembraan schade in vivo optreedt als gevolg van een verscheidenheid van fysiologische stressoren verschillende experimentele benaderingen zijn ontwikkeld om deze na te bootsen. Deze omvatten verwonden celmembraan van hechtende cellen door schrapen ze van de schaal of door passage van door een smalle boring spuit 9,10. Naar aanleiding van dergelijke verwondingen de cellen te genezen in suspensie en niet gehouden aan de extracellulaire matrix zoals ze normaal doen in het weefsel. Weer anderen, zoals het gebruik van poriënvormende toxines chemisch te veranderen celmembraan door extractie lipiden zoals cholesterol, dus niet nabootsen in vivo mechanische letsels 5. Zo kan methode voor celschade invloed hebben op wat kan worden geleerd over de reparatie reactie. Dit vereist voorzichtigheid te betrachten niet alleen de keuze van de celschade assay maar ook kiezen benaderingen die beter nabootsen mechanische letsels in vivo. Deze benadering houdt onder nul letsel (waarbij een monolaag van cellen zijn gewonddoor een scalpel of naald) en glaskralen letsel (waarbij letsel wordt veroorzaakt door glasparels omrollen gehandeld cellen). Deze benaderingen zijn zeer geschikt voor verwonden cellen massaal, maar zijn niet ontvankelijk voor real time beeldvorming van celmembraan reparatieproces. Gebruik van micronaalden en gepulste lasers gelokaliseerde en goed gecontroleerde verwondingen aan het botspunt bootsen de mechanische en traumatische verwonding in vivo en zijn vatbaar voor real time beeldvorming van de reparatiereactie, maar biedt inzicht in reparatie van een cel tegelijk. Het is vermeldenswaard dat de gepulste laser schade benadering verschilt van het gebruik van uitgebreide bestraling van celmembraan met nonpulsed lasers waarbij het membraan schade wordt veroorzaakt door lokale verhitting, waarvan bekend is dat niet-fysiologische effecten zoals photoxidative en fotothermische schade veroorzaken aan lipiden membraan en cytosolische onderdelen 11.
De hier beschreven protocollen toestaan gebruik te maken van het potentieel van een of het massaal letsel aanpak, die gebaseerd is op het gebruik van glazen kralen en een van de gelokaliseerde schade aanpak (gepulste laser) voor het toezicht op het vermogen, het kinetiek en het subcellulaire mensenhandel betrokken zijn bij de reparatie van celmembraan na micrometer grootte letsel. Deze benaderingen zijn onderling gratis - bulk blessure maakt gebruik van een populatie van cellen om een tekort in de reparatie vermogen en de subcellulaire mensenhandel in verband met het te identificeren. Doordat real-time visualisatie van de reparatie in individuele cellen, maakt laser letsel aanpak vast te stellen wat stap van het celmembraan reparatie en wat subcellulaire gebeurtenissen worden geassocieerd met het tekort in de reparatie. Deze benadering is gebruikt voor het bewaken celmembraan reparatie zoogdieren en ongewervelde organismen 7,12,13. Op basis van de behoeften van het experiment een van deze twee benaderingen kunnen op zichzelf worden gebruikt. Wanneer de aard van de reparatie tekort niet bekend of de subcellulaire mechanisme betrokken in tproces zijn niet bekend, een combinatie van deze benaderingen nuttig.
Vanwege de inherente variabiliteit van het aantal cellen gewonden tussen monsters eindpunt gebaseerd celbeschadiging testen moet zelfstandig vaststellen van alle cellen die gewond raken, dat heeft herstellen en die niet te repareren. De glazen kraal blessure aanpak die wij hier hebben beschreven maakt het identificeren van deze cellen. Bij het uitvoeren van de glaskraal verwonden is het belangrijk dat tijdens het maken van inspanningen om het aantal cellen gewonden maximaliseren de verwondingen zelf mild zodat cellen niet meerdere treffers ontvangen. Dit is belangrijk aangezien herhaalde letsel veroorzaken de cellen (die selectief tot herstel armen) sterven en losmaken van het dekglaasje tijdens de procedure. Dit zou resulteren in een onderschatting van cellen die niet te repareren. Het is ook belangrijk om rollen van de glasparels tijdens hanteren en wassen van de dekglaasjes voorkomen dat nieuwe schade op te heffen diezal resulteren in een rode kleuring (vals positieve cellen). Deze benadering voor letsel kan ook een controle populatie van cellen voor celoppervlak translocatie van eiwitten van interesse, zoals hier aangetoond voor lysosoom membraan geassocieerd eiwit 1 (LAMP1). Bij het bewaken van alleen het celoppervlak gelokaliseerde eiwitten met immunofluorescentie een eerste vereiste is om antilichamen die het extracellulaire domein van het eiwit van belang en immunolabel cellen vóór fixatie binden gebruiken. Dit maakt vergelijking van de LAMP1 niveau de celmembraan beschadigde cellen met niet gewonde cellen of tussen verschillende populaties cellen. Hoewel dit protocol is geïllustreerd middels LAMP1 kan worden toegepast op elk ander gekozen eiwit waarvoor een antilichaam specifiek voor het extracellulaire domein van het eiwit. Bij schade veroorzaakt lysosomale exocytose moet worden vergeleken tussen twee cellijnen die niet zijn vastgesteld soortgelijke basale (niet veroorzaakt door verwonding) lysosomale exocytose hebben, Celoppervlak LAMP1 vlekken op niet-gewonde cellen moeten ook worden gemeten. Hiervoor is een extra monster wordt behandeld zoals voorbeeld C2 behalve dat in stap 9 de cellen worden geïncubeerd met het primaire antilichaam. Dit is een maat voor de basissnelheid van lysosomale exocytose verschaffen.
Voor de laser letsel protocol de celmembranen worden verwond door een hoge intensiteit enkel foton ns gepulste laser. Verwonden wordt uitgevoerd in aanwezigheid van cel impermeant kleurstof waarvan de fluorescentie toeneemt na binding endomembrane (bijv. FM 1-43) uitgevoerd. Aldus na de cel geassocieerde fluorescentie kleurstof verschaft een maat voor de tijd die cel te genezen 3. Laser letsel veroorzaakt de FM kleurstof de cel en endomembranes binden, wat resulteert in verhoging FM kleurstof fluorescentie. Reparatie van de beschadigde celmembraan belemmert verder kleurstof binnenkomst in de cel. Aldus kan een cel die reparaties fluorescentie van de kleurstof bereikt een plateau, terwijl een cel die niet aan kleurstof reparerenfluorescentie stijgt voortdurend.
Live cell imaging van individuele subcellulaire gebeurtenissen betrokken bij celmembraan reparatie nodig het toezicht op de celmembraan bij hoge signaal-ruisverhouding. Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een aanpak geschikt voor beeldvorming celoppervlak gebeurtenissen in een hoge signaal-ruisverhouding 14-16. Er zijn verschillende commercieel verkrijgbaar TIRF systemen en geven deze systemen geschikt beeldvorming van levende cellen kan worden gebruikt. Daarnaast hebben we benaderingen beschreven voor het opzetten zelfgemaakte TIRF microscoop elders 17,18. Onafhankelijk van de opstelling TIRF er behoefte benaderingen waarmee controle verschillende lot van subcellulaire blaasjes voor als na de verwonding vast te stellen. Elders hebben we een bespreking van dergelijke benaderingen die mbt aard, duur en mate van fusie van elk lysosome 19 laten voorzien. Om letsel te bewaken getriggerd exocytose van FITC-dextran lysoso gelabeldemes in protocol 4 de spil te observeren beschreven zijn de flitsen. De flits gaat afgifte van FITC dextran in afzonderlijke lysosoom in een stap resulteert in zijdelingse spreiding van de fluorescentie. Terwijl elke flash geeft meestal een exocytose fusie van enkele lysosoom, is het belangrijk om dit vast door het bewaken van het aantal lysosomen aanwezig zijn op de fusieplaats vóór en na de flits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants AR055686 en AR060836 en postdoctoraal fellowship aan AD door de Franse Vereniging van de Spierdystrofie (AFM). De cellulaire beeldvorming inrichting gebruikt in deze studie wordt ondersteund door National Institutes of Health Grants HD040677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K.
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
