Summary
Der Prozess der Heilung verletzten Zellen beinhaltet Handel spezifischer Proteine und subzellulären Kompartimenten an der Stelle der Zellmembran Verletzung. Dieses Protokoll beschreibt Assays, um diese Prozesse zu überwachen.
Abstract
Die Fähigkeit von verletzten Zellen zu heilen ist eine grundlegende zelluläre Prozess, aber zellulären und molekularen Mechanismen der Heilung verletzten Zellen beteiligt sind kaum verstanden. Hier Assays werden beschrieben, die Fähigkeit und die Kinetik der Heilung von kultivierten Zellen folgenden lokalisierten Verletzungen zu überwachen. Das erste Protokoll beschreibt einen Endpunkt basierten Ansatz, um gleichzeitig zu beurteilen Zellmembran Reparaturfähigkeit von Hunderten von Zellen. Das zweite Protokoll beschreibt ein Echtzeit-Bild Ansatz, um die Kinetik der Zellmembran Reparatur in einzelnen Zellen folgenden lokalisierten Verletzungen mit einem gepulsten Laser zu überwachen. Wie Heilung verletzten Zellen beinhaltet Handel von spezifischen Proteinen subzellulärer Kompartimente und an den Ort der Verletzung, das dritte Protokoll beschreibt die Verwendung von oben Endpunkt Ansatz für eine solche Veranstaltung Handel (lysosomale Exozytose) in Hunderten von Zellen verletzt bewerten und gleichzeitig die letzte Protokoll beschreibt die Verwendung von gepulstem Laser Verletzungen zusammen mit TIRF microsKopie an die Dynamik der einzelnen subzellulären in verletzten Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu überwachen. Während die Protokolle beschreiben die Verwendung dieser Ansätze, um die Verbindung zwischen Zellmembran Reparatur und lysosomale Exozytose in kultivierten Muskelzellen zu studieren, können sie als solche für andere adhärenten Kulturzelle und subzellulären Kompartiment der Wahl angewendet.
Introduction
Zellmembran hält die Integrität der Zellen durch eine Barriere zwischen der Zelle und der extrazellulären Umgebung. Eine chemische, elektrische oder mechanische Reiz, die die normalen physiologischen Schwelle sowie das Vorhandensein von eindringenden Krankheitserregern überschreitet kann jedes Ergebnis zu Verletzungen der Zellmembran und lösen eine anschließende zelluläre Reaktion auf diese Verletzung zu reparieren. Um diese Verletzungen der Zellmembran überleben Zellen besitzen einen effizienten Mechanismus zur Reparatur. Dieser Mechanismus ist calciumabhängig und erfordert intrazellulären Transports von Proteinen, wie Annexine und MG53 ua sowie subzellulären Kompartimenten, wie Endosomen, Lysosomen, Golgi abgeleiteten Vesikeln und Mitochondrien der verletzten Zellmembran 1-7. Allerdings bleibt die Details der Abfolge der molekularen und subzellulärer Ereignisse bei der Reparatur beschädigter Zellmembran beteiligt kaum verstanden.
Reparatur Antwort Zelle kann in Ohr getrennt werdenly und späte Antworten. Frühe Reaktionen, die innerhalb von Sekunden bis Minuten-Zeitskala auftreten, sind bei der Bestimmung der Natur der verspäteten Antworten, die zu erfolgreichen Zellreparatur oder Zelltod enorm wichtig. Endpunkt-Assays auf Basis von Groß biochemische und zelluläre Analyse haben dazu beigetragen, die Einbeziehung der molekularen und zellulären Prozesse in Reparatur. Aber aufgrund der Heterogenität und die Schnelligkeit der zellulären Reparatur Antwort, Endpunkt-Assays nicht den kinetischen und räumlichen Details der Abfolge der Ereignisse, die zu reparieren ist. Ansätze, die gesteuert Verletzung Zellmembran ermöglichen und die Überwachung der Zellmembran assoziierten Reparatur und subzellulären Reaktionen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ideal für solche Untersuchungen geeignet sind. Hier solcher Ansätze wurden vorgestellt. Zwei der Protokolle beschreiben Ansätze, um die Echtzeit-Kinetik der Zellmembran Reparatur und die subzelluläre Antworten mit der Reparatur-Prozess in lebenden Zellen assoziiert folgende Laser inj überwachenUry. Als Ergänzung zu diesen Live-Cell-Imaging-basierte Assays haben Endpunkt-Assays auch beschrieben, dass eine Bevölkerung basierte Maßnahme zur Überwachung der Reparatur von einzelnen Zellen und der damit verbundenen subzellulärer Antworten zu liefern. Um ihren Nutzen zeigen diese Ansätze wurden verwendet, um Menschenhandel und Exozytose von Lysosomen zu überwachen als Reaktion auf Verletzungen der Zellmembran.
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Protocol
1. Imaging Cell Membrane Repair Mit Schütt (Glasperlenspiel) Verwundung
Dieses Protokoll erlaubt separat Kennzeichnung der verletzten Zellen und solche, die nicht heilen. Die Quantifizierung dieser Populationen von Zellen erfordert die Verwendung von drei Bedingungen: 1. Test (C1) - Die Zellen können in Gegenwart von Ca 2 +, 2 zu reparieren. Kontrolle 1 (keine Schädigung C2) - Die Zellen werden in Gegenwart von Ca 2 + 3 inkubiert, aber nicht verletzt, und. Control 2 (keine Reparatur C3) - Zellen werden in Abwesenheit von Ca 2 + zu reparieren.
- Zellen wachsen auf> 50% Konfluenz auf drei sterile Deckgläser und waschen C1 und C2 zweimal mit CIM bei 37 ° C und C3 mit PBS bei 37 ° C und Transferdeck auf Silikon-O-Ringe.
- 100 l vorgewärmten FITC-Dextran-Lösung in CIM auf C1 und C2 oder C3 in PBS auf.
- Verletzen Plasmamembran auf C1 und C3 von sanften 40 mg Glasperlen über das Deckglas bei Raumtemperatur durch manuelles Kippen zurück und Deckgläser6-8 mal her in einem Winkel von 30 °.
Hinweis: Für leichte Verletzungen, sicherzustellen, dass die Glasperlen sind gleichmäßig verteilt, so wiederholen Verletzungen zu minimieren. Um die Reproduzierbarkeit der Verletzung zwischen den Proben zu verbessern, gleichzeitig nehmen die Glasperlen Verletzungen der verschiedenen Proben verglichen werden. - Vermeidung von weiteren Rollen der Perlen, übertragen alle Deckgläser auf einem 37 ° C-Inkubator bei Umgebungs CO 2 und damit die Reparatur für 5 min gehen.
- Ohne dass die Kugeln rollen, entfernen Sie die Glasperlen und FITC-Dextran durch Waschen mit CIM (C1 und C2) oder PBS (C3) bei 37 ° C
- Platz Deckgläser wieder auf den O-Ring und 100 l vorgewärmten Lysin fixierbar TRITC-Dextran-Lösung in CIM auf C1 und C2 oder C3 in PBS auf.
- Inkubieren bei 37 ° C für 5 min bei Umgebungs CO 2.
- Zweimal waschen Deckgläser mit vorgewärmten CIM setzen und mit 4% PFA für 10 min bei RT.
- Zweimal waschen mit PBS und Inkubation für 2 min bei RT in Hoechst-Farbstoff.
- Wash samples zweimal mit PBS, montieren auf einem Objektträger mit Montage Medien-und Bildzellen mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskop.
- Verwenden C2-Zellen aus, um den Hintergrund rote und grüne Farbintensität bestimmen und diesen Wert auf Schwellen die roten und grünen Kanäle für alle Proben (C1-C3).
- Ergebnis Gesamtzahl der Zellen, die sind a) Grün (verletzt und repariert) und b) rot oder beide rot und grün (verletzt, aber nicht zu reparieren) in C1 und C3 Proben.
- Zahl> 100 Greens Zellen für jede Bedingung und drücken die Fraktion von Zellen, die als Prozent der Zellen verletzt (grün und rot) zu reparieren fehlgeschlagen.
2. Live-Imaging der Kinetik der Zellmembran Reparatur Nach Laser-Verletzung
- Waschen der Zellen mit vorgewärmtem CIM und dann das Deckglas in CIM mit FM-Farbstoff.
- Legen Sie das Deckglas in einer Halterung in der Phase Top Inkubator bei 37 ° C gehalten
- Wähle einen 1-2 mm 2 Bereich der Zellmembran, und bestrahlen <, 10 ms mit dem gepulsten Laser. Dämpfen die Laserleistung durch die Software, um 40-50% der Spitzenleistung. Optimale Leistung ermöglicht die konsistente, aber nicht tödliche Verletzungen und dies muss durch Versuch und Irrtum für jedes einzelne Instrument und Zelllinie verwendet bestimmt werden.
- Um Reparatur-, Bild-in Epi-Fluoreszenz-und Hell überwachen alle 10 sec, beginnend vor Verletzungen und weiterhin für 3-5 min nach der Verletzung.
Hinweis: Für keine Reparatursteuer, wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4 mit die Zellen verletzt in PBS mit FM-Farbstoff. - Um die Kinetik der Reparatur zu quantifizieren, messen zellulären Fluoreszenz-Farbstoff FM und zeichnen Sie die Änderung in der Intensität (ΔF/F0) im Verlauf der Bildgebung. Diese Daten sollten über 10 Zellen in jeder Bedingung gemittelt und aufgetragen als gemittelte Wert oder einzelne Zelle, wie gebraucht.
3. Bulk-Imaging (Glasperlenspiel) Verletzung Induced Lysosomal Exocytosis
Die Proben sind folgende Zellen> 50% gewachsenZusammenfluss: 1. Test (C1) - Die Zellen können in Gegenwart von Ca 2 +, 2 zu reparieren. Control 1 (C2; Keine Verletzung) - Cells weder verletzt noch mit primärem Antikörper inkubiert und drei. Control 2 (C3; keine Reparatur) - Cells erlaubt, in Abwesenheit von Ca 2 + zu reparieren.
- Waschdeckgläser C1 und C2 zweimal mit CIM bei 37 ° C und C3 mit PBS bei 37 ° C und übertragen sie auf Silikon-O-Ringe.
- 100 ul vorgewärmtes Lysin fixierbar TRITC-Dextran in CIM auf C1 und C2 und C3 in PBS auf.
- Verletzen Plasmamembran auf C1 und C3, wie in Schritt 1.3.
- Vermeidung von weiteren Rollen der Perlen, übertragen alle Deckgläser auf einem 37 ° C-Inkubator bei Umgebungs CO 2 und damit die Reparatur für 5 min gehen.
- Entfernen Sie die Glasperlen und TRITC-Dextran durch Waschen der Deckgläser in kaltem Wachstumsmedium, wodurch ebenfalls keine Rollen der Glasperlen auf den Zellen.
- Zweimal mit kaltem Wachstumsmedium Spülen Sie die Deckgläser und Transfer zu den O-Ringen.
- C1 und C3, 100 l Ratte anti-Maus-Antikörper, der in kalten LAMP1 komplette Wachstumsmedien und die kalte, komplett Wachstumsmedien bis C2.
- Antikörperbindung zu ermöglichen, Inkubieren Deckgläser für 30 min bei 4 ° C.
- Dreimal Waschen Sie die Deckgläser mit kaltem CIM und reparieren alle Deckgläser mit 4% PFA für 10 min bei RT und dann spülen 3x mit CIM.
- Alle Deck inkubieren in 100 ul Blockierungslösung für 15 min bei RT
- Alle Deck inkubieren in 100 &mgr; l Alexa Fluor 488 anti-Ratten-Antikörper für 15 min bei 4 ° C.
- Zweimal waschen mit PBS und Inkubation für 2 min bei RT in Hoechst.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, montieren auf einem Objektträger mit Montage Medien und Bild mit Epifluoreszenzmikroskop.
- Mit Bildern von C2-Zellen, bestimmen die unspezifische Hintergrundfärbung in rot (TRITC-Dextran) und Grün (Alexa Fluor 488-Antikörper)-Kanäle und nutzen diese Hintergrundfärbung Werte Schwelle die roten und grünen Kanäle für alle Proben (C1-C3). </ Li>
- Verwenden Sie die> 100 rot markierten Zellen von C1 und C3, die Intensität der Färbung LAMP1 (grün) in verletzten Zellen zu messen. Für eine erfolgreiche Experiment der LAMP1 Färbung in Zellen von C3 deutlich niedriger als in den Zellen von C1 sein.
4. Live-Imaging von Cell Membrane Verletzung ausgelöst Subcellular Handel
- Fluoreszenz beschriften die Raum von Interesse durch Transfektion geeigneter Reporter (zB CD63-GFP für Lysosomen 8) oder mit Fluoreszenzfarbstoffen 9.
- Für die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff Lysosomen, Inkubation Zellen zu 50% Konfluenz in Wachstumsmedium, das FITC-Dextran gewachsen
- Ermöglichen Dextran für 2 Stunden endocytosiert im CO 2-Inkubator (oder mehr als ausreichend endosomalen Markierung mit Dextran von der Zellinie von Interesse erforderlich) werden.
- Waschen der Zellen mit vorgewärmtem Wachstumsmedium und Inkubieren darin für 2 Stunden in einem CO 2-Inkubator, damit alleendozytosiert Dextran in den Lysosomen ansammeln.
- Vor Bildgebung, spülen Sie die Deckglas in vorgewärmten CIM und montieren in einem Deckglas Halter auf der Bühne oben Brutschrank bei 37 ° C
- Führen Sie Weitfeld (für die Bewegung in der gesamten Zelle) oder TIRF (Bewegung an der Zelloberfläche und Exozytose) Bildgebung - Zellen, die FITC-Dextran nicht überfüllt sind markiert Lysosomen sind ideal für die Abbildung der Bewegung und Exozytose einzelner Lysosomen.
- Ausrichten der TIRF Laser für die Bild Mikroskop: Verwenden 60X oder 100X-Objektiv mit> 1,45 NA. Stellen Sie den Winkel für die einfallenden Laserstrahl mit TIRF des Herstellers Ansatz.
- Verletzen die Zellmembran durch Bestrahlen einer kleinen (1-2 mm 2) Region <100 ms, mit dem gepulsten Laser bei 40-50% Dämpfung.
- Um die Reaktion zu überwachen, um Verletzungen Lysosom, Bildzellen für mindestens 2 min lang bei 4-6 Zell Bilder / sec abhängig von der Dynamik der Exozytose in den Zellen von Interesse.
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Representative Results
Für Single-Cell-Imaging hier beschriebenen Protokolle sind, die Fähigkeit und die Kinetik der Zellmembran Reparatur (Protokolle 1 und 2) und die subzelluläre Handel und Fusion von Lysosomen während der Reparatur zu überwachen (Protokolle 3 und 4).
Protokoll 1 zeigt eine Groß Assay, der die Kennzeichnung aller verletzten Zellen und der Identifizierung von verletzten Zellen, die zur Reparatur fehlgeschlagen ermöglicht. Die Ergebnisse in Abbildung 1 zeigen, dass, während die unverletzten Zellen (Abbildung 1A) unmarkierten bleiben, Zellen durch Glasperle in Gegenwart von FITC-Dextran verletzt sind grün (1B und 1C) markiert. Wenn Zellen können in Gegenwart von Ca 2 + zu reparieren meisten verletzt (grün)-Zellen zu verwalten und zu reparieren sind von TRITC-Dextran (1B) markiert (rot). Wenn Zellen erlaubt, in Abwesenheit von Ca 2 + zu reparieren, die meisten der verletzten Zellen werden ebenfalls von der TRITC-Dextran (Fi markierten rotengure 1C). Zellen, die nie verletzt wurden, keine Kennzeichnung mit dem TRITC-Dextran zu zeigen. Somit wird in einem gegebenen Proben indem die Anzahl der Zellen, die nur markierten grünen liefert ein Maß für die Zellen, die durch Glasperlen verletzt und repariert wurden, und indem die Anzahl der Doppel (rot und grün) markierten Zellen stellt ein Maß für die Zellen, die fehlgeschlagen von Verletzungen zu reparieren.
Protokoll 2 beschreibt die Bewertung der Kinetik der Reparatur von Zellmembranen Überwachung der Eingabe der FM-Farbstoff in der Zelle. Im UKW-Farbstoff inkubiert, intakten Zellen zeigen die Zellmembran Färbung (2A vor Verletzungen WF-Panel). Nach lokalisierten Laser Verletzung Zellmembran FM Farbstoff beginnt die Zelle eintritt und Binde Endomembranen, die einen plötzlichen Anstieg der FM-Farbstoff-Fluoreszenz (Fig. 2B) verursacht. Da die Kapazität der Zellmembran folgenden Laserschäden zu reparieren ist abhängig von Ca 2 +, eine Zelle, in Gegenwart von Ca 2 + verletzt ist able, um zu reparieren, was die FM Farbstoff Eintrag verursacht (und damit Erhöhung der zellulären Fluoreszenz-Farbstoff FM), um innerhalb einer Minute nach der Verletzung aufhören (2A, obere Platte, 2B, blaue Linie und animierte Video 1 und Abbildung 2). Im Gegenteil, eine Zelle erlaubt, in der Abwesenheit von Ca 2 + zu reparieren, nicht zu reparieren, die in kontinuierlichen Farbstoffeintrag führt und somit kontinuierliche Zunahme FM Farbstofffluoreszenz noch 4 Minuten nach der Verletzung (2A, untere Tafel, 2B, rote Linie und animierte Video 2 und Abbildung 2). So führt Zellmembran Reparatur zu einer Plateaubildung des FM-Farbstoff Färbung, während mangelnde Zellmembran Reparatur verursacht kontinuierlichen Farbstoffeintrag, der auf Plateau ausfällt.
Protokoll Nr. 3 beschreibt die Verwendung von Groß (Glasperlen) Verletzung Ansatz zur Zelloberfläche Translokation von Vesikeln und Proteinen in Reaktion auf eine Verletzung zu überwachen. Hier thE-Zellen werden in Gegenwart von TRITC-Dextran dadurch verletzt, während die unverletzten Zellen nicht rot (3A) markiert, sondern alle verletzten Zellen rot (3B und 3C) gekennzeichnet. Die unverletzten Zellen, die nicht mit primärem Antikörper zeigen Hintergrundniveau Kennzeichnung für Zelloberflächen LAMP1 (3A LAMP1 Panel) behandelt werden. Wenn jedoch Zellen verletzt und können in Gegenwart von Calcium zu heilen, Lysosomen zogen Exozytose und somit gibt es erhöhte LAMP1 Färbung auf der Oberfläche der verletzten (rot markiert)-Zellen (Fig. 3B). Diese Zunahme der Zelloberfläche LAMP1 Kennzeichnung ist in Zellen, die berechtigt sind, in Abwesenheit von Calcium (3C) heilen viel niedriger. Dies zeigt die Calcium reguliert Natur der lysosomale Exozytose und damit Aussehen der Oberfläche LAMP1. Somit können sowohl die Quantifizierung der Anzahl von Zellen mit hoher Zelloberflächenfärbung LAMP1 sowie Messen des Pegelsder Zelloberfläche LAMP1 Färbung von einzelnen verletzten Zellen bieten Maßnahmen für die Fähigkeit der Zelle zu unterziehen Verletzung ausgelöst lysosomale Exozytose.
Protokoll Nr. 4 zur direkten Überwachung der Kinetik, die Art und Lage der einzelnen Lysosomen-Fusion als Antwort auf Zellmembran Verletzungen verwendet werden. Die Zellen werden durch den Impulslaser und Zelloberflächen verletzt Lysosomen von TIRF-Bildgebung, die Überwachung Verletzungen ausgelöst Exozytose von Lysosomen in einzelnen Zellen (Fig. 4A und animierte Video 3). 4A zeigt eine Zelle (in grün dargestellt) durch visualisiert ermöglicht abzubildenden Phasenkontrast-Bildgebung (links) und von TIRF-Mikroskopie (Mitte), vor der Verletzung. Rechte Bild zeigt TIRF-Bild der gleichen Zelle 105 Sekunden nach der Verletzung. Verschiedene Verletzungen ausgelöst Antworten der Lysosomen sind in den Abbildungen beschrieben 4B-E. 4B zeigt Verletzungen ausgelöst Rekrutierung von einem Lysosom (markiertvon grauer Kreis) an die Zellmembran, gefolgt von Exozytose (animierte Video 4 und Abbildung 4). Diese Lysosom nicht sichtbar in TIRF Bild vor der Verletzung (Figur 4B: Platte -2.5 s), aber nach der Verletzung das Lysosom kommt an der Zellmembran und detektierbar (Figur 4B: Platte 102,5 s), da die Bläschen bewegt sich näher an die Zellmembran ist es besser, durch die TIRF-Beleuchtung angeregt und die lysosomalen FITC Dextran Fluoreszenz erreicht Maximalwert, wenn der Fusionspore öffnet verursacht Neutralisation des lysosomalen pH-Wert und damit Dequenching der FITC-Dextran Fluoreszenz (4B: Panel 104,8 s). Anschließend das Dextran aus der Vesikel an die Außenseite der Zelle verursacht FITC Fluoreszenz seitlich ausbreiten und die Vesikel Fluoreszenz abgegeben allmählich abnimmt (Fig. 4B: Platte 107.1 s). In der zweiten Kategorie, dem Lysosom (von Orangen-Kreis markiert, animierte Video 5 Abbildung 4) vorhanden ist, bevor Verletzungen (4C: Panel -2,5 s), bleibt es dort an der Membran (4C: Feld 91 s), bis die Bläschen exocytoses. Hier ist der Lysosom exocytosed teilweise (4C: Panel 93 s) und hinterließ einige FITC-Dextran im Vesikel nach Fusion (4C: 94,5 s). Die dritten und vierten Gruppen von Bläschen nicht an die Membran zu fixieren. Die in 4D gezeigt Lysosom (von blauen Kreis markiert) bewegt sich axial zu und weg von der Zellmembran (animierte Video 6 und Abbildung 4). Das Lysosom ist nicht sichtbar, an der Zellmembran vor Verletzungen (4D: Panel -2,5 s), aber bei Annäherung Zellmembran nach Verletzung durch TIRF-Mikroskopie (4D: Panel 59,3 s) sichtbar wird. Es erreichte am nächsten an der Zellmembran (4D: Panel 59,6 s) und bewegt sich ohne zu schmelzen (4D dann: pAnel 63,7 s). Das Lysosom in der vierten Kategorie kommt nahe an der Membran und bewegt sich horizontal entlang der Zellmembran (Bereich von der lila Box in 4A markiert, animierte Video 7 und Abbildung 4). 4E (Panel 8.7 s) zeigt die Ankunft des Lysosom , die dann entlang der Membran bewegt sich und kann in der Folge von Bildern gesehen werden Verletzungen verfassen (4E: Platten 10,7, 11,9, 12,8, 18,8 s). Basierend auf der obigen Beschreibung Quantifizierung des FITC-Dextran Fluoreszenzintensität jedes Lysosom - Sicherung (Fig. 4B und 4C), axial bewegt (Fig. 4D) oder horizontal bewegt (Fig. 4E) ermöglicht die Bestimmung Lysosom Reaktion auf eine Verletzung.
Abbildung 1. Bulk. Zellmembran Verletzungen durch Glasperlen Bilder zeigen Kernfärbung (Hoechst, links), Verletzungen (grüne Färbung - FITC Dextran), nicht reparierten Zellen (rote Färbung - TRITC-Dextran) und fusionierte Bilder (Merge). (A) Unverletzte Zellen in Gegenwart von Calcium, (B) verletzten Zellen in Gegenwart von Calcium, und (C) verletzten Zellen in Abwesenheit von Calcium. Maßstabsbalken 10 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. . Echtzeit-Bildgebung von Zell-Membran-Reparatur in Reaktion auf Laser-Verletzung (A) Bild von Zellen (orange umrandet) vor Verletzungen [linke Tafel - Hellfeld (BF) undEpifluoreszenz (epi)], 5 sec, 1 min und 4 min nach der Verletzung. Die Verletzungsstelle wird durch einen weißen Pfeil angedeutet. Obere Feld zeigt eine Zelle in der Gegenwart von Calcium-und Unterplatte verletzt zeigt eine Zelle in der Abwesenheit von Calcium verletzt. (B) Graph, der die Veränderung der FM-Farbstoff Färbung (ΔF/F0) der Zellen in A in Gegenwart von Calcium (blau) oder in Abwesenheit von Calcium (rot) verletzt. Der Bereich, in dem FM-Farbstoff tritt und damit die Fluoreszenzmarkierung erhöht wurde für die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität verwendet. Maßstabsbalken = 10 um). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Imaging lysosomale Exozytose in Reaktion auf Großschäden. Bilder zeigen Hoechst Kernfärbung (blau), Zelloberflächen LAMP1 Färbung (grün), TRITC-Dextran (rot) und Zusammenführen aller Kanäle (Überlagerung) von (A) unverletzt Zellen nicht mit primären Antikörper markiert, (B) Verletzt Zellen zu reparieren erlaubt in Gegenwart von Calcium, und (C) verletzten Zellen erlaubt, in Abwesenheit von Calcium zu reparieren. Maßstabsbalken 10 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
4. Echtzeitabbildung von lysosomalen Exozytose in Reaktion auf Laser Verletzung. Zellen mit FITC-Dextran markierten Lysosomen wurden von einem gepulsten Laser in Gegenwart von Calcium verletzt. (A) Die Grenze der Zelle,verletzt wurde skizziert (in grün): links-Panel - Hellfeld vor Verletzung, Mitteltafel - TIRF vor Verletzungen und rechte Tafel - TIRF 105 s nach der Verletzung. Der Ort der Verletzung ist durch die Cyan-Box und der von weiß / lila-Boxen und farbige Kreise dargestellt werden innerhalb Platten vergrößert werden repräsentativen Bereich markiert. Die Farbe der Vesikel in der gesamten Bildzelle (grau, orange und blau) entspricht der Farbe in Bildern von den einzelnen Lysosomen erkennen. (B) Linke Wand zeigt ein Diagramm für die ΔF/F0 Wert für die FITC-Fluoreszenz von einem Vesikel nach der Verletzung rekrutiert. Rechte Bild zeigt Momentaufnahmen der Vesikel vor Verletzungen (-2,5 s), prefusion (102,5 s), Fusion (104,8 s) und postfusion (107,1 s). (C) Linke Wand zeigt ein Diagramm für die ΔF/F0 Wert für die FITC-Fluoreszenz von einem Vesikel vor Verletzungen angedockt. Rechte Bild zeigt Momentaufnahmen der Vesikel vor Verletzungen (-2,5 s), prefusion (91 s), Fusion (93 s) und postfusion (94,5 s). (<strong> D) Linke Wand zeigt ein Diagramm für die ΔF/F0 Wert für die FITC-Fluoreszenz von einem Vesikel axial bewegt (hin und weg von der Zellmembran). Rechte Bild zeigt Momentaufnahmen der Vesikel vor Verletzungen (-2,5 s) und nach Verletzungen an verschiedenen Position in der Nähe der Membran bei 59,3, 59,6 und 63,7 s. (E) Snapshots der Vesikel, die an verschiedenen Positionen vor Verletzungen (-2,5 s) und nach Verletzungen bei (8,7, 10,7, 11,9, 12,8 und 18,8 s) horizontal entlang der Zellmembran bewegt. Maßstabsbalken (A = 10 um, B, C, D, E = 1 um). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Animierte Video 1 Abbildung 2: . Echtzeit-Bildgebung von Zell-Membran-Reparatur in Reaktion auf Laser Verletzung in Anwesenheit von Calcium-Farbstoff FM-Eintrag in einer Zelle (orange umrandet) durch gepulste verletztLaser in Gegenwart von Calcium. Der Film stellt 200 Bilder alle 2 Sek. erworben. Die Zelle wurde (Region durch die Cyan-Quadrat markiert), nachdem Rahmen 4 verletzt. Der Zeitstempel zeigt die Zeit in h: min: sec: ms-Format. Maßstabsbalken = 10 um.
Animierte Video 2 Abbildung 2: . Echtzeit-Bildgebung von Zell-Membran-Reparatur in Reaktion auf Laser Verletzung in Abwesenheit von Calcium-Farbstoff FM-Eintrag in einer Zelle (orange umrandet) durch gepulste Laser in Abwesenheit von Calcium verletzt. Der Film stellt 200 Bilder alle 2 Sek. erworben. Die Zelle wurde (Region durch die Cyan-Quadrat markiert), nachdem Rahmen 4 verletzt. Der Zeitstempel zeigt die Zeit in h: min: sec: ms-Format. Maßstabsbalken = 10 um.
Animierte Video 3 Abbildung 4: Echtzeit-Bildgebung von lysosomalen exocytose in Reaktion auf Laser Verletzung. Verschiedene Reaktionen der Lysosomen in einer Zelle durch gepulste Laser verletzt (grün, Video 3 beschrieben). Der Film stellt 2 min von sequentiellen Zeitreihen-Aufnahmen von TIRF-Mikroskopie mit 5 Bildern / s erworben. Hell Bilder wurden alle 20 sec erworben. Die Zelle wurde bei 2 Sekunden in diesem Video verletzt (mit dem Cyan-Feld angegeben ist). Die farbigen Kreise (grau, orange und blau) und die lila Box markieren Sie die in Abbildung 4 beschrieben Lysosomen und animierten Videos 4-7, demonstrieren ihre vielfältigen Schicksale folgenden Zellschädigung. Der Zeitstempel zeigt die Zeit in h: min: sec: ms-Format. Maßstabsbalken = 10 um.
Animierte Video 4. Abbildung 4 zeigt Exozytose Lysosom von grauen Kreis, der mit der Membran in Reaktion auf eine Verletzung rekrutiert wird markiert. Um 7 Sek. (5 sec nach der Verletzung) in diesem Video das Lysosom wird an der Zellmembran rekrutiertund dann Sicherungen an dieser Stelle bei 1 min und 47 sek. Maßstabsbalken = 1 mm.
Animierte Video 5 Abbildung 4 zeigt Exozytose Lysosom von Orangen-Kreis, der an der Membran vor, um Verletzungen und Sicherungen an dieser Stelle 1 min und 35 sec angedockt wurde markiert. Maßstabsbalken = 1 mm.
Animierte Video 6 Abbildung 4 zeigt Lysosomen durch blauen Kreis markiert Weg zu und dann von der Zellmembran. Maßstabsbalken = 1 mm.
Animierte Video 7 Abbildung 4 zeigt einen Bereich der Zelle durch lila Box in Video 3, wo nach der Verletzung einer der Lysosomen gekennzeichnet (weißer Kreis) bewegt sich alOng der Zellmembran. Maßstabsbalken = 1 mm.
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Discussion
Zellmembranschäden in vivo auftritt, aufgrund einer Vielzahl von physiologischen Belastungen und verschiedene experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um diese zu imitieren. Dazu gehören verletzen Zellmembran von adhärenten Zellen durch Abschaben sie von der Schale oder durch Passagieren durch eine enge Bohrung Spritze 9,10. Nach solchen Verletzungen heilen die Zellen in Suspension und nicht an die extrazelluläre Matrix eingehalten, wie sie normalerweise in dem Gewebe zu tun. Wieder andere, wie die Verwendung von porenbildenden Toxinen Zellmembran chemisch zu verändern durch Extrahieren Lipide, wie Cholesterin, also nicht in vivo nachahmt mechanischen Verletzungen 5. So kann für die Zellschäden verwendete Methode beeinflussen, was man über die Reparatur Antwort gelernt werden. Dies erfordert Vorsicht walten nicht nur in der Wahl der Zellschädigung Assay, sondern auch die Wahl Ansätze, die besser imitieren die mechanische Verletzungen in vivo. Solche Ansätze sind Kratzverletzung (wo eine Monoschicht von Zellen werden verletztdurch ein Skalpell oder Nadel) und Glasperlen Verletzung (wo Verletzung durch Glasperlen rollen über halten Zellen verursacht). Diese Ansätze sind für verletzte Zellen en masse geeignet, aber nicht zugänglich sind Echtzeit-Bildgebung von Zell-Membran-Reparatur-Prozess. Verwendung von Mikronadeln und gepulste Laser, um lokalisierte und gut kontrollierte Verletzungen an der Aufprallstelle zu schaffen imitieren die mechanischen und traumatischen Verletzung in vivo und sind zugänglich für eine Echtzeitabbildung des Reparaturreaktion, sondern gibt Einblick in die Reparatur von einer Zelle zu einer Zeit. Es ist erwähnenswert, dass die Impulslaser-Verletzung ist gekennzeichnet durch die Verwendung von längeren Bestrahlung Zellmembran mit nonpulsed Laser, wo die Membran Schädigung durch lokalisierte Erwärmung, die bekanntlich nicht-physiologischen Wirkungen wie photoxidative und photothermische Schäden induzieren Lipide Membran verursacht und cytosolischen Komponenten 11.
Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen, das Potenzial von einem of die en masse Verletzungen Ansatz, der auf der Verwendung von Glasperlen beruht und eine der lokalisierten Verletzungen Ansatz (gepulste Laser) zur Überwachung der Fähigkeit, die Kinetik und die subzelluläre Handel in der Reparatur von Zellmembranen folgende Mikrometergröße Verletzungen beteiligt. Diese Ansätze sind gegenseitig kostenlos - Großschäden können mit einer Population von Zellen, um ein Defizit in der Reparaturfähigkeit und subzellulärer Handel mit ihm verbunden zu identifizieren. Durch die Aktivierung Echtzeit-Visualisierung der Reparatur in einzelnen Zellen, ermöglicht Laser Verletzungen Ansatz identifizieren, was Schritt der Zellmembran Reparatur und welche subzellulärer Ereignisse werden mit dem Defizit der Reparatur verbunden. Dieser Ansatz ist für die Überwachung der Zellmembran Reparatur in Säugetier-und wirbellosen Organismen 7,12,13 verwendet. Basierend auf den Anforderungen des Experiments dieser beiden Ansätze könnte allein verwendet werden. Wenn jedoch die Art der Reparatur Defizit nicht bekannt ist und die subzelluläre Mechanismus in t beteiligtsein Verfahren nicht bekannt ist, durch eine Kombination dieser Ansätze ist nützlich.
Aufgrund der inhärenten Variabilität in der Anzahl der Zellen zwischen zwei Abtastungen Endpunkt basierend Zellschädigung Assays verletzt ist es notwendig, unabhängig identifizieren alle Zellen, die verletzt sind, die zur Reparatur verwaltet und diejenigen, die zu reparieren ist fehlgeschlagen. Das Glasperlen Verletzungen Ansatz haben wir hier beschrieben ermöglicht die Identifizierung dieser Zellen. Bei der Durchführung des Glasperlen Verwundung, ist es wichtig, dass bei der Herstellung, um die Anzahl von Zellen verletzt, die Verletzungen selbst sind mild zu maximieren, so Zellen nicht mehrere Treffer erhalten. Dies ist wichtig, da wiederholte Verletzung bewirkt, dass die Zellen (selektiv diejenigen, die bei der Reparatur arm sind), um während des Verfahrens sterben und lösen sich von der Deckglas. Dies würde zu einer Unterschätzung der Zellen, die zur Reparatur fehlgeschlagen führen. Es ist auch wichtig, jede Roll der Glasperlen bei der Handhabung und dem Waschen der Deckgläser zu vermeiden, jede neue Verletzung zu beseitigen diewird mit einer roten Färbung (falsch-positive Zellen) führen. Dieser Ansatz für die Verletzung ermöglicht auch die Überwachung einer Population von Zellen für Zelloberflächen Translokation des Proteins von Interesse, da hier seit Lysosom assoziiertes Membranprotein 1 (LAMP1) demonstriert. Bei der Überwachung nur die Zelloberfläche lokalisierten Proteine durch Immunfluoreszenz eine wichtige Voraussetzung ist, um Antikörper, die die extrazelluläre Domäne des Proteins von Interesse und immunolabel Zellen vor der Fixierung binden zu verwenden. Dies ermöglicht den Vergleich der LAMP1 Ebene an der Zellmembran in verletzten Zellen mit unverletzten Zellen oder zwischen den verschiedenen Populationen von Zellen. Während dieses Protokoll wurde mit LAMP1 dargestellt ist, kann es zu einem anderen Protein der Wahl, für die eine spezifische extrazelluläre Domäne des Proteins Antikörper angewendet werden. Bei Verletzungen ausgelöst lysosomale Exozytose muss zwischen zwei Zelllinien, die nicht festgestellt worden sind, um ähnliche Basalrate (nicht durch Verletzungen ausgelöst) von lysosomalen Exozytose haben verglichen werdenZelloberflächenfärbung LAMP1 auf unverletzten Zellen sollten ebenfalls gemessen werden. Hierzu wird eine weitere Probe wie Probe C2, außer dass in Schritt 9 sollten die Zellen mit dem Primärantikörper inkubiert werden, behandelt. Dies liefert ein Maß für die Basalrate der lysosomalen Exozytose.
Für die Laser Verletzungen Protokoll die Zellmembranen durch eine hohe Intensität Einzelphotonen ns Impulslaser verletzt. Verwundung wird in Anwesenheit von Zell impermeante Farbstoff, dessen Fluoreszenzsteigerungen bei Bindung endomembrane (zB FM 1-43) durchgeführt. Damit folgt der Zelle zugeordneten Fluoreszenzfarbstoff liefert ein Maß für die Zeit von der Zelle aufgenommen zu 3 zu heilen. Laserschäden bewirkt, daß die FM-Farbstoff in die Zelle eindringen und binden Endomembranen, was zu einem Anstieg in der FM-Farbstoff-Fluoreszenz. Reparatur des beschädigten Zellmembran verhindert weiteren Farbstoff Eintritt in die Zelle. Somit ist für eine Zelle, die Reparatur, Fluoreszenz des Farbstoffs ein Plateau erreicht, während für eine Zelle, die zu reparieren Farbstoff ausfälltFluoreszenz kontinuierlich zunimmt.
Lebenden Zellen einzelner subzelluläre Ereignisse in Zellmembranen Reparatur beteiligt erfordert die Überwachung der Zellmembran bei hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Totalreflexion (TIRF) Mikroskopie ist ein Ansatz gut geeignet für die Bildgebung der Zelloberfläche Ereignisse zu einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis von 14 bis 16. Es gibt mehrere im Handel erhältlich TIRF-Systemen und einem dieser Systeme mit Live-Cell-Imaging kompatibel sind, können verwendet werden. Darüber hinaus haben wir Ansätze für den Aufbau hausgemachte TIRF Mikroskope anderer Stelle beschrieben 17,18. Unabhängig von der TIRF-Setup besteht ein Bedarf an Methoden, die Überwachung verschiedener Schicksal von subzellulären Vesikeln vor und nach der Verletzung erlauben herzustellen. An anderer Stelle haben wir eine Diskussion solcher Ansätze, die Überwachung Art, Dauer und Grad der Verschmelzung der einzelnen Lysosom 19 ermöglichen. Um Verletzungen zu überwachen ausgelöst Exozytose von FITC-Dextran lysoso beschriftetProtokoll 4 in das Hauptmerkmal zu beobachten, beschrieben mes sind die blinkt. Die Blitz beinhaltet Freisetzung von FITC-Dextran in einzelnen Lysosomen in einem einzigen Schritt, was zu seitlichen Ausbreitung der Fluoreszenz enthalten. Während jeder der Regel auf einen Flash-Exozytose-Fusion von Einzel Lysosom, ist es wichtig, dies durch die Überwachung, wie viele Lysosomen sind an der Fusionsstelle vor und nach den Blitz zu etablieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants AR055686 und AR060836 und Postdoc-Stipendium an n. Chr. von Französisch Gesellschaft für Muskeldystrophie (AFM) unterstützt. Die zelluläre Bildgebung Anlage in dieser Studie verwendet wird, von der National Institutes of Health Grants HD040677 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
References
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