Imaging Cell Membrane Skador och Subcellulära processer som ingår i reparations

Summary

Läkningsprocessen skadade celler innebär handel med specifika proteiner och subcellulära fack till platsen av cellmembranet skada. Detta protokoll beskriver analyser för att övervaka dessa processer.

Abstract

Förmågan hos skadade celler att läka är en grundläggande cellulär process, men cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i läkning skadade celler är dåligt kända. Här analyser beskrivs att övervaka förmåga och kinetik av läkning av odlade celler efter lokaliserad skada. Den första protokoll beskriver en slutpunkt baserad metod för att samtidigt bedöma cellmembran reparationsförmåga av hundratals celler. Den andra protokoll beskriver en realtidsavbildningsteknik för att övervaka kinetiken för cellmembran reparation i enskilda celler efter lokal skada med en pulsad laser. Eftersom healing skadade celler innebär handel med specifika proteiner och subcellulära fack till platsen för skadan, beskriver användningen av ovan slutpunkt baserad metod för att bedöma en sådan handel händelse (lysosomala exocytos) i hundratals celler skadade samtidigt och den sista protokollet den tredje protokollet beskriver användningen av pulsad laser skada tillsammans med TIRF microskopia för att övervaka dynamiken i enskilda subcellulära fack i skadade celler med hög spatial och temporal upplösning. Även om protokollen beskriver det användningen av dessa metoder för att studera sambandet mellan cellmembran reparation och lysosomala exocytos i odlade muskelceller, kan de användas som sådan för alla andra anhängare odlade celler och subcellulära fack av val.

Introduction

Cellmembranet upprätthåller integriteten för celler genom att tillhandahålla en barriär mellan cellen och den extracellulära omgivningen. En kemisk, elektrisk eller mekanisk stimulans som överstiger den normala fysiologiska tröskeln samt förekomsten av invaderande patogener kan varje resultat i skada till cellmembranet och utlösa en efterföljande cellulärt svar att reparera denna skada. För att överleva dessa skador till cellmembranet, celler har en effektiv mekanism för reparation. Denna mekanism är kalciumberoende och innebär intracellulär handel med proteiner såsom annexiner och MG53 bland andra samt subcellulära fack såsom endosomer, lysosomer, Golgi härledda vesikler och mitokondrier till den skadade cellmembran ^1-7. Dock förblir detaljerna i sekvensen av molekylära och subcellulära händelser för att reparera skadade cellmembran dåligt kända.

Cells reparationssvar kan uppdelas i öratly och sena svar. Tidiga reaktioner, som uppträder inom några sekunder till minuter tidsskala, är oerhört viktiga för att bestämma vilken typ av svar som leder till framgångsrik cell reparation eller celldöd. Slutpunkt analyser baserade på bulk biokemiska och cellulära analyser har bidragit till att fastställa medverkan av molekylära och cellulära processer i reparation. Men, på grund av heterogenitet och snabba cellulära reparationssvar, slutpunkt analyser inte ger de kinetiska och rumsliga detaljer i händelseförloppet som leder till reparation. Tillvägagångssätt som möjliggör kontrollerad skada av cellmembranet och tillåter övervakning av cellmembranet reparation och tillhörande subcellulära svaret vid hög rumslig och tidsmässig upplösning är idealiska för sådana studier. Här har sådana metoder lagts fram. Två av de protokoll som beskriver metoder för att övervaka realtids kinetiken för cellmembran reparation och subcellulära reaktioner i samband med reparationen i levande celler efter laser injury. Som ett komplement till dessa levande cell imaging baserade analyser, har slutpunktanalyser också beskrivits som ger en befolkningsbaserat mått för övervakning reparation av enskilda celler och tillhörande subcellulära svaren. För att visa sin nytta dessa metoder har använts för att övervaka handel och exocytos av lysosomer som svar på cellmembranskada.

Protocol

1. Imaging Cell Membrane Reparation Använda Bulk (glaspärla) sårbildning

Detta protokoll möjliggör separat märkning av skadade celler och de som misslyckas med att läka. Kvantifiera dessa populationer av celler kräver användning av tre villkor: 1. Test (C1) - Celler tillåts att reparera i närvaro av Ca ^{2 +,} 2. Kontroll 1 (ingen skada C2) - Cellerna odlades i närvaro av ^{Ca2 +,} men inte skadade, och 3. Kontroll 2 (ingen reparation C3) - celler tillåts att reparera i frånvaro av ^{Ca2 +.}

1. Odla cellerna till> 50% sammanflytning på tre sterila täckglas och tvätta C1 och C2 två gånger med CIM vid 37 ° C och C3 med PBS vid 37 ° C och överföra täckglas om silikon O-ringar.
2. Lägg till 100 pl förvärmd FITC dextranlösning i CIM på C1 och C2 eller i PBS på C3.
3. Skada plasmamembranet på C1 och C3 med mjukt böljande 40 mg glaspärlor över täckglas vid rumstemperatur genom att manuellt tipptäck tillbaka ochvidare 6-8 gånger i en vinkel på 30 °.
   Obs: För mild skada, se glaspärlor sprids jämnt, vilket minimerar återkommande skador. För att förbättra reproducerbarheten av skada mellan prover, samtidigt utföra glaspärla skada av de olika prover som ska jämföras.
4. Undvikande av ytterligare valsning av pärlorna och överför alla täckglas till en 37 ° C inkubator vid omgivande _CO2 och tillåta reparation fortgå under 5 min.
5. Utan att låta kulorna rulla, ta bort glaspärlor och FITC dextran genom tvättning med CIM (C1 och C2) eller PBS (C3) vid 37 ° C.
6. Placera täck tillbaka på O-ringen och tillsätt 100 l av förvärmd lysin fastställbara TRITC dextranlösning i CIM på C1 och C2 eller i PBS på C3.
7. Inkubera vid 37 ° C under 5 min vid omgivande _CO2.
8. Tvätta täck två gånger med förvärmd CIM och fäst med 4% PFA i 10 min vid RT.
9. Tvätta två gånger med PBS och inkubera i 2 minuter vid RT i Hoechst färgämne.
10. Wash samples två gånger med PBS, montera på en bild med hjälp av monterings media och bildceller med hjälp av ett epifluorescensmikroskop.
11. Använd celler från C2 att bestämma bakgrund röd och grön färgningsintensitet och använda detta värde för att tröskeln de röda och gröna kanaler för alla prover (C1-C3).
12. Betyg totala antalet celler som är a) grön (skadade och repareras) och b) röd eller både rött och grönt (skadade, men misslyckats med att reparera) i C1 och C3-prover.
13. Greven> 100 gröna celler för varje tillstånd och uttrycker den fraktion av celler som misslyckats med att reparera som en procent av alla celler som skadats (grön och röd).

2. Live avbildning av kinetiken för cellmembran Reparation Efter laserskada

1. Tvätta cellerna med förvärmd CIM och sedan lägga täckglas i CIM med FM färgämne.
2. Placera täckglas i en hållare i stadiet topp inkubator som hölls vid 37 ° C.
3. Välj ett 1-2 mm ^2-regionen av cellmembranet, och bestråla för <, 10 msek med den pulsade lasern. Dämpa lasereffekten genom programvara för att 40 till 50% av toppeffekten. Optimal kraft möjliggör konsekvent, men nonlethal skada och det måste bestämmas genom trial and error för varje enskilt instrument och cellinje som används.
4. För att övervaka reparation, bild var 10 sekund i epifluorescence och ljusfält, med början före skadan och fortsätta i 3-5 min efter skada.
   OBS: För ingen reparation kontroll, upprepa steg 2,1-2,4 med cellerna skadade i PBS som innehåller FM färgämne.
5. För att kvantifiera kinetiken för reparation, mäta cellulär FM färgämne fluorescens och rita förändringen i intensitet (ΔF/F0) under avbildning. Dessa uppgifter bör i genomsnitt mer än 10 celler i varje tillstånd och ritas som medelvärde eller enskilda cellens värde, efter behov.

3. Imaging Bulk (glaspärla) Skada Induced Lysosomala Exocytos

Proven omfattar följande celler odlade till> 50%sammanflödet: 1. Test (C1) - Celler tillåts att reparera i närvaro av Ca ^{2 +,} 2. Kontroll 1 (C2, Inga skador) - Celler varken skadade eller inkuberade med primär antikropp, och 3. Kontroll 2 (C3; Nej reparation) - Celler tillåts att reparera i frånvaro av ^{Ca2 +.}

1. Tvätta täck C1 och C2 två gånger med CIM vid 37 ° C och C3 med PBS vid 37 ° C och överföra dem på silikon O-ringar.
2. Tillsätt 100 l av förvärmd lysin fastställbara TRITC dextran i CIM på C1 och C2 och i PBS på C3.
3. Skada plasmamembranet på C1 och C3 som i steg 1.3.
4. Undvikande av ytterligare valsning av pärlorna och överför alla täckglas till en 37 ° C inkubator vid omgivande _CO2 och tillåta reparation fortgå under 5 min.
5. Avlägsna de glaspärlor och TRITC dextran genom att tvätta täckglasen i kallt odlingsmedium, vilket ger garanterat ingen rullning av glaspärlor på cellerna.
6. Skölj täckglasen två gånger med kallt odlingsmedium och överför till O-ringarna.
7. För C1 och C3, Tillsätt 100 l av råtta anti-mus LAMP1 antikropp i kalla fullständiga tillväxtmedier och lägg den kalla, fullständig tillväxtmedia till C2.
8. För att möjliggöra antikroppsbindning Inkubera täckglas för 30 minuter vid 4 ° C.
9. Tvätta täckglasen tre gånger med kall CIM och fixa alla täckglas med 4% PFA i 10 min vid RT och skölj sedan 3x med CIM.
10. Inkubera alla täckglas i 100 | il blockeringslösning under 15 min vid RT
11. Inkubera alla täckglas i 100 | il Alexa Fluor 488 anti-råtta antikropp under 15 min vid 4 ° C.
12. Tvätta två gånger med PBS och inkubera under 2 min vid RT i Hoechst.
13. Tvätta cellerna två gånger med PBS, montera på en bild med hjälp av monterings media och bild med hjälp av ett epifluorescensmikroskop.
14. Med hjälp av bilder av C2-celler, bestämma ospecifik bakgrundsfärgning i den röda (TRITC dextran) och grön (Alexa Fluor 488 antikropp) kanaler och använda dessa bakgrundsfärgning värden för tröskel de röda och gröna kanaler för alla prover (C1-C3). </ Li>
15. Använd> 100 röda märkta celler från C1 och C3 för att mäta intensiteten i LAMP1 färgning (grön) i skadade celler. För ett lyckat experiment i LAMP1 färgning i celler från C3 kommer att vara betydligt lägre än i celler från C1.

4. Live avbildning av cellmembranskada Triggered Subcellulär Trafficking

1. Fluorescerande märka fack av intresse genom att transfektera lämpliga reporter (t ex CD63-GFP för lysosomer ⁸⁾ eller genom användning av fluorescerande färgämnen ^9.
2. För märkning lysosomer med fluorescerande färg, inkubera celler som odlas till 50% sammanflödet i tillväxtmedier innehållande FITC-dextran
3. Tillåt dextran som skall endocyteras under 2 timmar (eller längre som behövs för tillräcklig endosomala märkning med dextran av cellinjen av intresse) i _CO2 inkubator.
4. Tvätta cellerna med förvärmda tillväxtmedier och inkubera i det för 2 timmar i en _{CO2-inkubator} för att låta allaendocyteras dextran ansamlas i lysosomen.
5. Innan avbildning, skölj täckglas i förvärmd CIM och montera i ett täckhållare på scenen topp inkubator vid 37 ° C.
6. Utför widefield (för rörlighet i hela cellen) eller TIRF (rörelse vid cellytan och exocytos) imaging - celler som inte har trångt FITC dextran märkta lysosomer är idealiska för avbildning av rörelse och exocytos av enskilda lysosomer.
7. Rikta in TIRF lasrar för avbildning mikroskop: Användning 60X eller 100X mål med> 1,45 NA. Ställ in vinkeln för infallande TIRF laserstråle med hjälp av tillverkarens förhållningssätt.
8. Skada cellmembranet genom bestrålning av en liten (1-2 mm ²⁾ region för <100 ms, med pulsad laser vid 40 till 50% dämpning.
9. För att kontrollera svaret från lysosom till cellskador, bildceller vid 4-6 bilder / sek under minst 2 minuter eller längre beroende på dynamiken i exocytos i cellerna av intresse.

Representative Results

Protokoll som beskrivs här för enskild cell imaging är att övervaka förmågan och kinetik av cellmembran reparation (protokoll 1 och 2) och den subcellulära handel och fusion av lysosomer under reparation (protokoll 3 och 4).

Protokoll 1 visar en bulkanalys som gör att markera alla skadade celler och identifiera de skadade celler som misslyckats med att reparera. Resultaten i figur 1 visar att medan de oskadade celler (Figur 1A) förblir omärkt, celler som skadats av glaspärlor i närvaro av FITC-dextran märkta gröna (figurerna 1B och 1C). När cellerna får reparera i närvaro av ^{Ca2 +} de flesta av de skadade (grön) celler lyckas reparera och är inte märkta (röd) från TRITC dextran (Figur 1B). När celler tilläts att reparera i frånvaro av ^{Ca2 +,} de flesta av de skadade cellerna är också märkta röd av TRITC dextran (Figur 1C). Celler som aldrig skadades visar ingen märkning med TRITC dextran. Således, i varje enskilt prov att kvantifiera antalet celler endast märkt grönt ger ett mått på de celler som skadas av glaspärlor och repareras, samtidigt kvantifiera antalet dubbel (röda och gröna) märkta celler ger ett mått på de celler som misslyckats att reparera från skada.

Protokoll 2 beskriver bedöma kinetiken hos cellmembranet reparation genom att övervaka inträdet av FM färgämnet i cellen. Då odlades i FM färgämne, intakta celler visar cellmembranfärgning (Figur 2A innan skadan WF panel). Efter lokaliserad laser skada av cellmembran FM färgämne börjar komma in i cellen och bindande endomembranes, som orsakar en plötslig ökning av FM färgämne fluorescens (Figur 2B). Eftersom kapaciteten av cellmembranet för att reparera följande laserskada är beroende av Ca ^{2 +,} en cell skadas i närvaro av Ca ^{2 +} är able att reparera, vilket gör att FM-dye posten (och därmed öka i cellulär FM färgämne fluorescens) att upphöra inom en minut efter skada (Figur 2A, övre panelen, figur 2B, blå linjen, och animerade video 1 och Figur 2). Tvärtom är en cell tillåts att reparera i frånvaro av ^{Ca2 +,} inte reparera, vilket resulterar i kontinuerlig färg inträde och därmed sammanhängande ökning av FM färgämnesfluorescens även 4 min efter skada (Figur 2A, nedre fältet, fig. 2B, röda linjen och animerade Video 2 och figur 2). Således leder cellmembran reparation till en plateauing av FM färgämne färgning, medan brist på cellmembran reparation orsakar kontinuerlig färgämne post som inte platå.

Protokoll 3 beskriver användningen av bulk (glaspärlor) skada metod för att övervaka cellytan sloka av vesiklar och proteiner som svar på skada. Här the cellerna skadas i närvaro av TRITC dextran sålunda medan oskadade celler inte är märkta röda (figur 3A), men alla skadade celler är märkta röda (fig. 3B och 3C). De oskadade celler som inte är behandlade med primär antikropp visar bakgrundsnivån för märkning av cellyt LAMP1 (figur 3A LAMP1 panel). Emellertid, när cellerna är skadade och får läka i närvaro av kalcium, lysosomer undergår exocytos och det finns därför en ökad nivå av LAMP1 färgning på ytan av de skadade (röda märkt)-celler (figur 3B). Denna ökning i cellytan LAMP1 märkning är mycket lägre i celler som får läka i frånvaro av kalcium (Figur 3C). Detta visar att kalcium reglerade karaktär lysosomala exocytos och därmed yta utseende LAMP1. Således båda, kvantifiering av antalet celler med hög cellytan LAMP1 färgning liksom mätning av nivånav cellytan LAMP1 färgning på enskilda skadade celler, ange åtgärder för cellens förmåga att genomgå skada utlöst lysosomala exocytos.

Protokoll 4 kan användas för direkt övervakning av kinetiken, natur och placering av enskilda lysosom fusion som svar på cellmembranskada. Cellerna skadas av pulsad laser och cellytan lysosomer avbildas av TIRF avbildning, vilket möjliggör övervakning skada utlöst exocytos av lysosomer i enskilda celler (Figur 4A och animerade Video 3). Figur 4A visar en cell (som skisseras i grönt) visualiseras genom faskontrast avbildning (till vänster) och TIRF mikroskopi (mitten panel), före skadan. Höger panel visar TIRF bild i samma cell 105 sek efter skada. Olika skador utlöste svar lysosomerna beskrivs i figurerna 4B-E. Figur 4B visar skada utlöst rekryteringen av en lysosom (markeratav grå cirkel) till cellmembranet följt av exocytos (animerad Video 4 och figur 4). Denna lysosome syns inte i TIRF bild före skada (Figur 4B: panel -2.5 s), men efter en skada lysosomen anländer till cellmembranet och blir detekterbar (Figur 4B: panel 102.5 s), som vesikler närmar sig cellmembranet är det bättre upphetsad av TIRF belysning och det lysosomala FITC dextran fluorescens når maximalt värde när fusions por öppnas orsakar neutralisering av det lysosomala pH och därmed dequenching av FITC dextran fluorescens (Figur 4B: panel 104.8 s). Därefter dextranet utmatas från vesikeln till utsidan av cellen orsakar FITC-fluorescens för att sprida sig i sidled och vesikeln fluorescens gradvis minska (Figur 4B: panelens 107,1 s). I den andra kategorin, lysosomen (markerad med orange cirklar, animerade Video 5 Figur 4) är närvarande före skada (Figur 4C: panel -2.5 s), är det fortfarande där på membranet (Figur 4C: panel 91 s) tills vesikler exocytoses. Här lysosomen exocytosed delvis (Figur 4C: panel 93 s) lämnar bakom några FITC dextran i vesikler efter fusionen (Figur 4C: 94.5 s). De tredje och fjärde grupper av vesiklar som inte smälter till membranet. Lysosomen visas i Figur 4D (markerad med blå cirkel) rör sig axiellt till och bort från cellmembranet (animerad video 6 och Figur 4). Denna lysosome syns inte på cellmembranet före skada (Figur 4D: panel -2.5 s), men på närmar cellmembranet efter skada den blir synlig genom TIRF mikroskopi (Figur 4D: panel 59.3 s). Det nådde närmast till cellmembranet (figur 4D: panel 59,6 s) och sedan rör sig bort utan fusering (Figur 4D: panel 63,7 s). Lysosomen i den fjärde kategorin anländer nära membranet och rör sig horisontellt längs cellmembranet (område markeras med lila rutan i figur 4A, animerad Video 7 och Figur 4). Figur 4E (panel 8,7 s) visar ankomsten av lysosomen , vilken sedan rör sig längs membranet och kan ses i den sekvens av bilder efter skada (figur 4E: paneler 10,7, 11,9, 12,8, 18,8 s). Baserat på beskrivningen ovan kvantifiera FITC dextran fluorescensintensiteten hos varje lysosom - fusing (figur 4B och 4C), rör sig axiellt (Figur 4D) eller rör sig horisontellt (Figur 4E) möjliggör bestämning lysosom svar på skada.

Figur 1. Bulk. Cellmembran skada genom glaspärlor Bilder visar nukleär färgning (Hoechst, vänstra panelen), skada (grön färgning - FITC dextran), oreparerade celler (röd färgning - TRITC dextran), och fusione bilder (Merge). (A) oskadda celler i närvaro av kalcium, (B) Skadade celler i närvaro av kalcium, och (C) Skadade celler i frånvaro av kalcium. Skala bar 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. . Realtids avbildning av cellmembran reparation som svar på laserskada (A) Bild av celler (med orange kontur) innan skada [vänster panel - ljust fält (BF) ochepifluorescens (epi)], 5 sek, 1 min och 4 min efter skada. Den skadestället indikeras av en vit pil. Övre panelen visar en cell skadas i närvaro av kalcium och den nedre panelen visar en cell skadas i frånvaro av kalcium. (B) Diagram som visar förändringen i FM färgämne färgning (ΔF/F0) av cellerna i panel A skadade i närvaro av kalcium (blå) eller i frånvaro av kalcium (röd). Regionen där FM färgämne inträder och därmed fluorescensmärkning ökad användes för kvantifiering av den fluorescensintensitet. Skala bar = 10 nm). Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. Imaging lysosomala exocytosis svar på bulk skada. Bilder visar nukleär färgning Hoechst (blå), cellytan LAMP1 färgning (grön), TRITC dextran (röd) och sammanfogning av alla kanaler (overlay) av (A) oskadade celler som inte är märkta med primär antikropp, (B) Skadade celler får reparera i närvaro av kalcium, och (C) Skadade celler tillåts att reparera i frånvaro av kalcium. Skala bar 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4. Realtids avbildning av lysosomala exocytos som svar på laserskada. Celler med FITC dextran märkta lysosomer skadades av en pulsad laser i närvaro av kalcium. (A) Gränsen för den cell somskadades beskrivs (i grönt): vänstra panelen - ljusa fältet innan skadan, mellersta panel - TIRF före skadan och höger panel - TIRF 105 s efter skada. Platsen för skadan präglas av cyanrutan och det representativa området markeras med vita / lila lådor och färgade cirklar inom har zoomat in paneler BE. Färgen på vesikler i hela cellen bilden (grå, orange och blå) motsvarar färgen i den inzoomade bilder av enskilda lysosomer. (B) Vänster panel visar en tomt för ΔF/F0 värdet för FITC fluorescens av en vesikel rekryterats efter skada. Höger panel visar ögonblicksbilder av vesikler före skadan (-2,5 s), prefusion (102.5 s), fusion (104.8 s) och postfusion (107,1 s). (C) Vänster panel visar en tomt för ΔF/F0 värdet för FITC fluorescens av en vesikel dockad före skadan. Höger panel visar ögonblicksbilder av vesikler före skadan (-2,5 s), prefusion (91 s), fusion (93 s) och postfusion (94.5 s). (<strong> D) Vänster panel visar en kurva för ΔF/F0 värdet för FITC-fluorescens av en vesikel rör sig axiellt (i riktning mot och bort från cellmembranet). Höger panel visar ögonblicksbilder av vesikler före skadan (-2,5 s), och efter skada på annan position nära membranet på 59,3, 59.6 och 63.7 s.. (E) Ögonblicksbilder av vesikler som flyttas horisontellt längs cellmembranet på olika positioner innan skadan (-2,5 s) och efter skada på (8,7, 10,7, 11,9, 12,8 och 18,8 s). Skala bar (A = 10 um, B, C, D, E = 1 mikrometer). Klicka här för att visa en större bild.

Animerad video 1 Figur 2: . realtid avbildning av cellmembran reparation som svar på laserskada i närvaro av kalcium FM färgämne post i en cell (med orange kontur) skadas av pulsadlaser i närvaro av kalcium. Filmen representerar 200 bilder som förvärvats varje 2 sek. Cellen var skadad (region präglad av cyan torget) efter ram 4. Tidsstämpeln visar tiden i tim: min: sek: ms format. Scale bar = 10 | im.

Animerad video 2 Figur 2: . realtid avbildning av cellmembran reparation som svar på laserskada i frånvaro av kalcium FM färgämne post i en cell (med orange kontur) skadas av pulsad laser i frånvaro av kalcium. Filmen representerar 200 bilder som förvärvats varje 2 sek. Cellen var skadad (region präglad av cyan torget) efter ram 4. Tidsstämpeln visar tiden i tim: min: sek: ms format. Scale bar = 10 | im.

Animerad video 3 Bild 4: Realtids avbildning av lysosomala exocytOsis som svar på laserskada. Olika svar lysosomer i en cell (som skisseras i grönt, Video 3) skadas av pulsad laser. Filmen utgör 2 min av sekventiella tidsförlopp bilder förvärvats av TIRF mikroskopi på 5 bilder / sek. Brightfield bilder förvärvades var 20 sek. Cellen var skadad (indikerad med cyan box) vid 2 sek i denna video. De färgade cirklar (grå, orange och blå) och den lila rutan markerar lysosomerna som beskrivs i figur 4 och animerade filmer 4-7, vilket visar deras olika öden efter cellskada. Tidsstämpeln visar tiden i tim: min: sek: ms format. Scale bar = 10 | im.

Animerad video 4 figur 4 visar exocytisk lysosom markerad med grå cirkel som rekryteras till membranet som svar på skada. Vid 7 sek (5 sek efter skada) i den här videon lysosomen blir rekryterade till cellmembranetoch sedan säkringar på denna webbplats på 1 min och 47 sek. Skalstreck = 1 mm.

Animerad video 5 figur 4 visar exocytisk lysosom markerad med orange cirklar som var dockad vid membranet före skadan och säkringar på denna plats 1 min och 35 sek. Skalstreck = 1 mm.

Animerad video 6 figur 4 visar lysosomer markerade med blå cirkel rör sig mot och bort från cellmembranet. Skalstreck = 1 mm.

Animerad video 7 figur 4 visar en region i cellen markerad med lila ruta Video 3 där efter skada en av lysosomen (vit cirkel) flyttar along cellmembranet. Skalstreck = 1 mm.

Discussion

Cellmembranskada in vivo uppstår på grund av en mängd olika fysiologiska stressfaktorer och flera experimentella metoder har utvecklats för att efterlikna dem. Dessa inkluderar att skada cellmembran av vidhäftande celler genom att skrapa bort dem från skålen eller genom att passera genom en smal borrning spruta ^9,10. Efter sådana skador cellerna läka i suspension och inte vidhäftar till den extracellulära matrisen, som de gör normalt i vävnaden. Ytterligare andra, såsom användning av pore bildar toxiner kemiskt förändra cellmembranet genom att extrahera lipider såsom kolesterol, alltså inte härma in vivo mekaniska skador ^5. Således kan metoden användas för cellskada påverkar vad man kan lära om reparationssvar. Detta kräver inte bara att utöva försiktighet vid valet av analyscellskada, utan också att välja metoder som bättre efterliknar de mekaniska skador in vivo. Sådana metoder innefattar scratch skada (där ett monolager av celler skadasmed en skalpell eller nål) och glaspärlor skada (där skada orsakas av glaspärlor rullande över vidhäftade celler). Dessa metoder är väl lämpade för att skada celler i massor, men är inte mottagliga för realtid avbildning av cellmembranet reparationsprocessen. Användning av mikronålar och pulsad laser för att skapa lokaliserade och välkontrollerade skador vid anslagspunkten härma den mekaniska och traumatiska skador in vivo och är mottagliga för realtidsavbildning av reparationssvar, men erbjuder insikt i reparation av en cell i taget. Det är värt att notera att den pulsade laserskada tillvägagångssätt skiljer sig från användningen av utvidgade bestrålning av cellmembranet med nonpulsed lasrar där membranet skada orsakas av lokal uppvärmning, som är känd för att inducera icke-fysiologiska effekter såsom photoxidative och fototermisk skador membranlipider och cytosoliska komponenter ^11.

De protokoll som beskrivs här tillåter tillvarata den potential som ett of det en masse tillvägagångssätt skada, som bygger på användning av glaspärlor och en av de lokala system skada (pulsad laser) för övervakning av förmåga, kinetik och subcellulära handeln inblandade i reparation av cellmembranet efter mikrometerstorlek skada. Dessa metoder är ömsesidigt kostnadsfri - bulk skada gör med hjälp av en population av celler för att identifiera ett underskott i reparationsförmåga och subcellulär människohandel i samband med det. Genom att möjliggöra realtidsvisualisering av reparation i enskilda celler, gör laserskada förhållningssätt identifiera vilken steg av cellmembranet reparation och vad subcellulär händelser är förknippade med underskott i reparationen. Denna metod har använts för att övervaka cellmembran reparation i däggdjurs-och ryggradslösa organismer ^7,12,13. Baserat på behoven hos försöket endera av dessa två metoder kan användas av sig själv. Men när den typ av reparation underskottet inte är känd eller subcellulära mekanism inblandad i thans process inte känd, genom att använda en kombination av dessa metoder är användbara.

På grund av normala variationer i antalet celler som skadats mellan prover i slutpunkt baserade cellskada analyser är det nödvändigt att självständigt identifiera alla celler som är skadade, som lyckades reparera och de som misslyckades med att reparera. Den glaspärla skada metod som vi har beskrivit här gör att identifiera dessa celler. Vid genomförandet av glaspärla såra det är viktigt att samtidigt göra ansträngningar för att maximera antalet celler skadade skadorna själva är mild så att cellerna inte får flera träffar. Detta är viktigt eftersom upprepad skada gör att cellerna (selektivt de som är dåliga på reparation) att dö och lossas från täckglas under proceduren. Detta skulle leda till en underskattning av celler som misslyckats med att reparera. Det är också viktigt att undvika rullning av glaspärlorna under hantering och tvättning av de täckglas för att eliminera varje ny skada somkommer att resultera i en röd färgning (falskt positiva celler). Detta tillvägagångssätt för skada gör det också möjligt att övervaka en population av celler för cellytan slokation av protein av intresse, som har visats här för lysosome associerat membranprotein 1 (LAMP1). Vid övervakning av endast de cellyt lokaliserade proteiner genom immunofluorescens ett nyckelkrav är att använda antikroppar som binder den extracellulära domänen av proteinet av intresse och immunolabel celler före fixering. Detta gör det möjligt att jämföra den LAMP1 nivån vid cellmembranet i skadade celler med oskadade celler eller mellan olika populationer av celler. Även om detta protokoll har illustrerats med hjälp LAMP1, kan den tillämpas på varje annan protein valt för vilken det finns en antikropp specifik för proteinets extracellulära domänen. När skada utlöst lysosomala exocytos måste jämföras mellan två cellinjer som inte har inrättats för att ha liknande basaldos (ej utlöst av skada) av lysosomala exocytosis, Cellytan LAMP1 färgning på oskadade celler bör också mätas. För detta ytterligare ett prov behandlas på samma sätt som prov C2 med undantag av att i steg 9 cellerna bör inkuberas med den primära antikroppen. Detta kommer att ge ett mått på basaldosen av lysosomala exocytos.

För laserskadeprotokoll cellmembranen skadas av en hög intensitet enda foton nsec pulsad laser. Sårskada utföres i närvaro av cell impermeant färgämne vars fluorescens ökar vid bindning endomembrane (t ex FM 1-43). Sålunda efter det att cellassocierad färgämnesfluorescens ger ett mått för den tid det tar för cellen att läka ^3. Laserskadeorsakerna FM färgämnet in i cellen och binda endomembranes, vilket resulterar i ökning av FM färgämne fluorescens. Reparation av skadade cellmembran hindrar ytterligare färgämne inträde i cellen. Således, för en cell att reparationer, fluorescens av färgämnet når en platå, medan det för en cell som inte reparera färgämnefluorescens ökar kontinuerligt.

Levande cell imaging av individuella subcellulära händelser som är involverade i cellmembranet reparation kräver övervakning av cellmembranet vid högt signalbrusförhållande. Total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi är en metod väl lämpad för avbildning cellyte-händelser på ett högt signal-brusförhållandet ^14-16. Det finns flera kommersiellt tillgängliga TIRF-system och något av dessa system som är kompatibla med levande cell imaging kan användas. Dessutom har vi beskrivit metoder för att sätta upp hemgjorda TIRF mikroskop andra håll ^17,18. Oberoende av TIRF installationen finns det ett behov av att upprätta strategier som gör det möjligt att övervaka olika öden subcellulära blåsor före och efter skadan. På andra håll har vi en diskussion om sådana metoder som möjliggör övervakning av natur, varaktighet och grad av fusion av varje lysosomen ^19. För att övervaka skada utlöst exocytos av FITC-dextran märkt lysosomes som beskrivs i protokoll 4 som utgör kärnan för att observera är de blinkar. Blixten involverar frisättning av FITC-dextran som finns i individuella lysosomen i ett enda steg resulterar i lateral spridning av fluorescens. Medan varje blinkning indikerar vanligtvis en exocytisk fusion av enstaka lysosom, är det viktigt att fastställa detta genom att övervaka hur många lysosomer är närvarande vid fusionsstället före och efter blixten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS