Imaging cellemembranen Injury og subcellulære prosesser involvert i reparasjons

Summary

Prosessen med healing skadde celler innebærer smugling av spesifikke proteiner og subcellulære avdelinger til stedet av cellemembranen skade. Denne protokollen beskriver analyser for å overvåke disse prosessene.

Abstract

Muligheten av skadde celler for å helbrede er en grunnleggende cellulære prosessen, men cellulære og molekylære mekanismene som er involvert i healing skadde celler er dårlig forstått. Her assays er beskrevet for å overvåke egenskaper og kinetikk for helbredelse av dyrkede celler etter lokalisert skade. Den første protokollen beskriver et sluttpunkt basert tilnærming for å vurdere cellemembranen reparasjon evne til hundrevis av celler samtidig. Den andre protokoll beskriver en sanntids avbildning tilnærmingen til å overvåke kinetikken til cellemembran reparasjon i de enkelte celler følgende lokalisert skade med en pulset laser. Som healing skadde celler innebærer smugling av spesifikke proteiner og subcellulære avdelinger til skadestedet, beskriver den tredje protokollen bruk av ovennevnte endepunkt basert tilnærming for å vurdere en slik handel hendelse (lysosomal eksocytose) i hundrevis av celler skadet samtidig, og den siste protokoll beskriver bruk av pulset laser skade sammen med TIRF mikroerkopi til overvåke dynamikken i enkelte subcellulære avdelinger i skadde celler med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Mens protokollene her beskriver bruken av disse metoder for å studere sammenhengen mellom cellemembranen reparasjon og lysosomal exocytose i dyrkede muskelceller, kan de anvendes som sådan for en hvilken som helst annen vedheftende dyrket celle, og subcellulære rommet av valget.

Introduction

Cell membranen opprettholder integriteten av celler ved å gi en barriere mellom cellen og det ekstracellulære miljø. En kjemisk, elektrisk eller mekanisk stimulus som overstiger det normale fysiologiske terskelen, så vel som tilstedeværelse av invaderende patogener kan hver resultere i skade på cellemembranen og utløse en påfølgende cellerespons for å reparere skaden. For å overleve disse skadene til cellemembranen, cellene har en effektiv mekanisme for reparasjon. Denne mekanismen er kalsium avhengig og innebærer intracellulær trafficking av proteiner som annexins og MG53 blant andre så vel som subcellulære avdelinger som endosomes, lysosomer, Golgi avledet vesikler og mitokondrier til den skadde cellemembranen ^1-7. Men fortsatt detaljene i sekvens av molekylære og subcellulære hendelser involvert i å reparere skadet cellemembranen dårlig forstått.

Cells reparasjon respons kan bli separert i øretly og sene svar. Tidlige tiltak, som oppstår i løpet av sekunder til minutter tidsskala, er enormt viktig for å bestemme arten av sene svar som fører til vellykket celle reparasjon eller celledød. Endepunkts analyser basert på bulk biokjemiske og cellulære analyser har bidratt til å etablere involvering av molekylære og cellulære prosesser i reparasjon. Men, på grunn av heterogeniteten og hurtighet av cellulære reparasjonsrespons, endepunkts assays mislykkes i å gi den kinetiske og romlige informasjon om sekvensen av hendelser som fører til reparere. Tilnærminger som muliggjør kontrollert skade cellemembranen og tillater overvåking cellemembranen reparasjon og tilhørende subcellulære responser ved høy romlig og tidsmessig oppløsning er ideell for slike studier. Her har slike tilnærminger blitt presentert. To av protokollene beskrive framgangsmåter for å overvåke sanntid kinetikk av cellemembranen reparasjon og subcellulære responser knyttet til reparasjonsprosessen i levende celler følgende laser injury. Som et supplement til disse levende celle bildebehandling baserte analyser, har endepunkts analyser også blitt beskrevet som gir en befolkningsbasert mål for overvåking reparasjon av individuelle celler og de tilhørende subcellulære svar. For å demonstrere sin nytte disse tilnærmingene har blitt brukt til å overvåke handel og eksocytose av lysosomer som svar på cellemembranen skade.

Protocol

En. Imaging cellemembranen Repair Bruke Bulk (Glassperle) såret

Denne protokollen tillater separat merking de skadde celler og de som ikke klarer å helbrede. Kvantifisere disse populasjoner av celler krever bruk av tre forhold: 1. Test (C1) - Celler ble tillatt å reparere i nærvær av Ca ^{2 +,} 2. Kontroll 1 (ingen skade C2) - Celler blir inkubert i nærvær av ^{Ca2 +,} men ikke skades, og 3.. Kontroll 2 (ingen reparasjon C3) - celler tillates å reparere i fravær av Ca ^{2 +.}

1. Dyrk celler til> 50% sammenløp på tre sterile dekkglass og vaske C1 og C2 to ganger med CIM ved 37 ° C, og C3 med PBS ved 37 ° C og overføring av dekkglass på silikon O-ringer.
2. Legg 100 mL av prewarmed FITC dekstranoppløsning i CIM på C1 og C2 eller i PBS på C3.
3. Skade plasma membran på C1 og C3 av bølgende 40 mg glassperler over dekkglass ved romtemperatur ved å manuelt vippe Dekk tilbake ogvidere 6-8 ganger i en vinkel på 30 °.
   Merk: For mild skade, sikre glassperler er spredt jevnt, og dermed minimere gjentatte skader. For å forbedre reproduserbarheten for skade mellom prøvene, samtidig utføre glassperle skade på de forskjellige prøver som skal sammenlignes.
4. Å unngå ytterligere rulling av kuler, overføre alle dekkglass i et 37 ° C inkubator ved omgivelses CO ₂ og tillate reparasjons forløpe i 5 min.
5. Uten å la perlene rulle, fjerne glassperler og FITC dekstran ved å vaske med CIM (C1 og C2) eller PBS (C3) ved 37 ° C.
6. Place Dekk tilbake på O-ringen og legge 100 mL av prewarmed lysin fikses TRITC dekstranoppløsning i CIM på C1 og C2 eller i PBS på C3.
7. Inkuber ved 37 ° C i 5 min ved værelses CO _2.
8. Vask Dekk to ganger med prewarmed CIM, og fikse med 4% PFA etter 10 min ved RT.
9. Vask to ganger med PBS og inkuberes i 2 min ved RT i Hoechst fargestoff.
10. Vask samples to ganger med PBS, montere på et lysbilde med feste media og bildet celler ved hjelp av en epifluorescence mikroskop.
11. Bruk celler fra C2 til å bestemme bakgrunns røde og grønne fargeintensitet og bruker denne verdien til terskelen de røde og grønne kanaler for alle prøvene (C1-C3).
12. Resultat totalt antall celler som er a) grønn (skadet og reparert) og b) rød eller både rød og grønn (skadet, men ikke klarte å reparere) i C1 og C3 prøver.
13. Count> 100 greener celler for hver tilstand og uttrykker brøkdel av celler som ikke klarte å reparere som en prosent av alle celler skadet (grønn og rød).

2. Live-Imaging av Kinetics av ​​cellemembranen Repair Følger Laser Injury

1. Vask cellene med prewarmed CIM og deretter sette dekkglass i CIM med FM fargestoff.
2. Plasser dekkglass i en holder i den fasen toppen inkubator holdt ved 37 ° C.
3. Velg en 1-2 mm ² område av cellemembranen, og bestråles for <; 10 msek med pulset laser. Attenuere lasereffekten gjennom programvaren til 40-50% av den toppeffekt. Optimal effekt tillater jevn, men nonlethal skade, og dette må bestemmes ved prøving og feiling for hver enkelt instrument og cellelinje som brukes.
4. For å overvåke reparasjon, bilde hver 10 sek i epifluorescence og lysfelt, som starter før skaden og fortsette i 3-5 min etter skade.
   Merk: For ingen reparasjon kontroll, gjenta trinn 02.01 til 02.04 med cellene skadet i PBS som inneholder FM fargestoff.
5. Å kvantifisere kinetikk for reparasjon, måle cellulær FM fargestoff fluorescens og plotte endring i intensitet (ΔF/F0) i løpet av bildebehandling. Denne informasjonen bør i gjennomsnitt over 10 celler i hver tilstand og plottet som gjennomsnitt eller individuelle cellens verdi, etter behov.

Tre. Imaging Bulk (Glassperle) Injury Induced Lysosomal eksocytose

Prøvene består av følgende celler dyrket til> 50%samløpet: 1. Test (C1) - Celler lov til å reparere i nærvær av Ca ^{2 +,} 2. Kontroll 1 (C2; Ingen skade) - Cells verken skadet eller ruges med primær antistoff, og tre. Kontroll 2 (C3, No reparasjon) - Celler lov til å reparere i fravær av Ca ^{2 +.}

1. Vask Dekk C1 og C2 to ganger med CIM ved 37 ° C, og C3 med PBS ved 37 ° C og overføre dem på silikon O-ringer.
2. Legg 100 mL av forvarmet lysin fikses TRITC dekstran i CIM på C1 og C2 og i PBS på C3.
3. Skade plasma membran på C1 og C3 som i trinn 1.3.
4. Å unngå ytterligere rulling av kuler, overføre alle dekkglass i et 37 ° C inkubator ved omgivelses CO ₂ og tillate reparasjons forløpe i 5 min.
5. Fjern glassperler og TRITC dekstran ved vasking av dekkglass i kaldt vekstmedium, på nytt sikrer ingen rulling av glassperler på cellene.
6. Skyll Dekk to ganger med kaldt vekstmedium og overføre til O-ringene.
7. Til C1 og C3, Tilsett 100 mL av rotte anti muse lamp1 antistoff i kalde komplette vekstmedier og legge den kalde, komplett vekstmedier til K2.
8. For å tillate antistoffbinding Inkuber dekkglass i 30 min ved 4 ° C.
9. Vask Dekk tre ganger med kaldt CIM og fikse alle dekkglass med 4% PFA for 10 min ved RT og deretter skylle 3x med CIM.
10. Inkuber alle dekkglass i 100 ul blokkeringsløsning i 15 minutter ved RT
11. Inkuber alle dekkglass i 100 pl Alexa Fluor 488 anti-rotte antistoff i 15 min ved 4 ° C.
12. Vask to ganger med PBS og inkuberes i 2 min ved RT i Hoechst.
13. Vask cellene to ganger med PBS, montere på et lysbilde med feste medier og bilde ved hjelp av en epifluorescence mikroskop.
14. Ved hjelp av bilder av C2-celler, bestemme den ikke-spesifikke bakgrunnsfarging i det røde (TRITC dekstran) og grønn (Alexa Fluor 488 antistoff) kanaler og bruke disse bakgrunnsfargeverdier til terskelen de røde og grønne kanaler for alle prøvene (C1-C3). </ Li>
15. Bruk> 100 røde merkede celler fra C1 og C3 for å måle intensiteten av lamp1 farging (grønt) i skadde celler. For en vellykket eksperiment for lamp1 farging i celler fra C3 vil være betydelig lavere enn i celler fra C1.

4. Levende Imaging av cellemembranen Injury Utløst subcellulære Trafficking

1. Fluorescently merke rommet av interesse ved transfeksjon passende reporter (f.eks CD63-GFP for lysosomes ⁸⁾ eller ved hjelp av fluorescerende fargestoffer ^ni.
2. For merking lysosomer med fluorescerende fargestoff, ruge celler dyrket i 50% samløpet i vekstmedier som inneholder FITC-dekstran
3. Tillat dekstran som skal endocytosed i 2 timer (eller lenger etter behov for tilstrekkelig endosomal merking med dekstran ved cellelinje av interesse) i _{CO2-inkubatoren.}
4. Vask cellene med forvarmet vekstmedier og inkuberes i det for to timer i en CO ₂ inkubator å tillate alleendocytosed dekstran å akkumulere i lysosomer.
5. Før bildebehandling, skyll dekk i prewarmed CIM og montere i en dekk holder på scenen toppen inkubator ved 37 ° C.
6. Gjennomføre widefield (for bevegelse i hele cellen) eller TIRF (bevegelse på celleoverflaten og eksocytose) bildebehandling - celler som ikke har overfylt FITC dekstran merket lysosomer er ideelle for å avbilde bevegelse og eksocytose av individuelle lysosomer.
7. Justere TIRF lasere for bildebehandling mikroskop: Bruk 60X eller 100X objektiv med> 1,45 NA. Sett opp vinkelen for hendelsen TIRF laserstrålen ved hjelp av produsentens tilnærming.
8. Skade på cellemembranen ved å bestråle en liten (1-2 mm ²⁾ region for <100 ms, og den pulserende laser ved 40-50% dempning.
9. For å overvåke responsen lysosome til celle skade, bildet celler på 4-6 bilder / sek i minst 2 min eller lenger avhengig av dynamikken i eksocytose i cellene av interesse.

Representative Results

Protokoller som beskrives her for enkeltcelle-avbildning, er å overvåke evnen og kinetikk av cellemembranen reparasjon (Protokoller 1 og 2) og subcellulære handel og sammensmelting av lysosomer under reparasjon (Protocols 3 og 4).

Protokoll 1 viser en bulk analyse som tillater merking av alle skadde celler og identifisere de skadde celler som ikke klarte å reparere. Resultatene i figur 1 viser at mens de uskadde celler (Figur 1a) forblir umerket, er celler skadet av glass perle i nærvær av FITC dekstran merket grønt (Tall 1B og 1C). Når cellene har lov til å reparere i nærvær av Ca ^{2 +} de fleste av de skadede celler (grønn) klarer å reparere og er ikke merket (rød) av TRITC dekstran (figur 1B). Når cellene har lov til å reparere i fravær av Ca ^{2 +,} er de fleste av de skadede cellene også merket rødt ved TRITC dekstran (Figure 1C). Celler som aldri ble skadet ikke viser noen merking med TRITC dekstran. Således, i en hvilken som helst gitt prøve kvantifisere antallet celler merket bare grønt gir et mål for de cellene som ble skadet av glassperler og repareres, mens kvantifisere antallet dobbel (røde og grønne) merkede celler gir et mål for de cellene som sviktet å reparere fra skade.

Protokoll 2 beskriver vurdering av kinetikken til cellemembran reparasjon ved å overvåke oppføring av FM-fargestoff i cellen. Når ruges i FM fargestoff, intakte celler viser cellemembranen farging (Figur 2A før skaden WF panel). Etter lokalisert laserskade av cellemembranen FM fargestoff begynner å skrive inn i cellen og bindende endomembranes, som forårsaker en plutselig økning i FM fargestoff fluorescens (figur 2B). Da kapasiteten av cellemembranen for å reparere etter laserskade er avhengig av Ca ^{2 +,} en celle skadet i nærvær av Ca ^{2 +} er able å reparere, noe som fører til at FM fargestoff oppføring (og dermed øke i mobilnettet FM fargestoff fluorescens) å opphøre innen et minutt etter skade (Figur 2A, øvre panel, Figur 2B, blå linje, og animerte Video 1 og Figur 2). Tvert imot, en celle tillatt å reparere i fravær av Ca ^{2 +,} unnlater å reparere, noe som resulterer i kontinuerlige fargestoff inngang og dermed kontinuerlig økning i FM fargestoff fluorescens og med 4 min etter skade (figur 2A, nedre panel, figur 2B, rød linje og animerte Video 2 og Figur 2). Dermed fører cellemembranen reparasjon til en plateauing av FM fargestoff flekker, mens mangel på cellemembranen reparasjon fører kontinuerlig fargestoff oppføring som ikke klarer å platå.

Protokoll 3 beskriver bruken av bulk (glassperler) skade tilnærmingen til å overvåke celleoverflaten translokasjon av vesikler og proteiner som respons på skade. Her the-celler er skadet i nærvær av TRITC dekstran således, mens den uskadde celler ikke er merket rødt (figur 3A), men alle de skadede celler er merket rødt (figurene 3B og 3C). De uskadde celler som ikke blir behandlet med primær antistoff viser bakgrunnsnivået merking for celleoverflaten lamp1 (figur 3A lamp1 panel). Imidlertid, når cellene er skadet og tillatt å gro i nærvær av kalsium-, lysosomer gjennomgå exocytose og det er dermed økt nivå av lamp1 flekker på overflaten av de skadde (rød merket) celler (Figur 3B). Denne økningen i celleoverflaten lamp1 merking er mye lavere i celler som får lov til å gro i fravær av kalsium (Figur 3C). Dette demonstrerer kalsium regulert natur lysosomal eksocytose og dermed overflate utseende av lamp1. Således begge, kvantifisere antallet celler med høy celleoverflatefarging lamp1 samt å måle nivåetav celleoverflaten lamp1 flekker på enkelte skadde celler, gir mål for cellenes evne til å gjennomgå skade utløst lysosomal eksocytose.

Protokoll 4 kan brukes for direkte overvåkning av kinetikken, natur og plassering av individuelle lysosomer fusjon som respons på cellemembranskade. Cellene blir skadet av den pulserende laser og celleoverflaten lysosomer er fotografert av TIRF bildebehandling, som tillater overvåking skade utløst eksocytose av lysosomer i enkelte celler (Figur 4A og animerte Video 3). Figur 4A viser en celle (skissert i grønt) visualisert ved fasekontrast imaging (venstre panel) og etter TIRF mikroskopi (midtre panel), forut for skader. Høyre panel viser TIRF bilde av den samme cellen 105 sek etter skade. Forskjellige skader utløst responsene til lysosomene er beskrevet i Figurene 4B-E. Figur 4B viser skader utløst rekruttering av lysosomer (markertav grå sirkel) til cellemembranen fulgt av exocytose (animert bilde 4 og figur 4). Denne lysosomer er ikke synlig i TIRF bilde forut for skade (Figur 4B: panel -2,5 s), men etter skade lysosomer ankommer til cellemembranen og blir påvisbar (figur 4B: panel 102,5 e), som vesikkel beveger seg nærmere cellemembranen det er bedre opphisset av TIRF belysning og lysosomal FITC dekstran fluorescens når maksimal verdi når fusion pore åpnes forårsaker nøytralisering av lysosomale pH og dermed dequenching av FITC dekstran fluorescens (Figur 4B: panel 104,8 s). Deretter dekstran tømmes fra vesikkel til det ytre av cellen forårsaker FITC fluorescens å spre seg sideveis og vesikkel fluorescens for gradvis å avta (figur 4B: panel 107,1 s). I den andre kategorien, det lysosome (markert med oransje sirkel, animerte Video 5 Figur 4) er til stede før skade (Figur 4C: panel -2,5 s), er det fortsatt det på membranen (Figur 4C: panel 91 s) till vesikel exocytoses. Her lysosome exocytosed delvis (Figur 4C: panel 93 s) etterlot noen FITC dekstran i vesikkel etter fusjon (Figur 4C: 94,5 s). De tredje og fjerde grupper av vesikler ikke smelter sammen til membranen. Den lysosomer vist i figur 4D (merket med blå sirkel) beveger seg aksialt til og bort fra cellemembranen (animert video 6 og figur 4). Dette lysosome er ikke synlig på cellemembranen før skade (Figur 4D: panel -2,5 s), men ved nærmer cellemembranen etter skade det blir synlig ved TIRF mikroskopi (Figur 4D: panel 59,3 s). Den nådde nærmest til cellemembranen (figur 4D: panel 59,6 r), og deretter beveger seg bort uten å smelte sammen (figur 4D: pAnel 63,7 s). Den lysosomer i fjerde kategori kommer nær membranen, og beveger seg horisontalt langs cellemembranen (område som er merket med den lilla boksen i figur 4A, animert bilde 7 og figur 4). Figur 4E (panel 8,7 e) viser ankomsten av lysosomer , som beveger seg deretter langs membranen, og kan sees i sekvensen av bilder poste skade (Figur 4E: paneler 10.7, 11.9, 12.8, 18.8 s). På bakgrunn av beskrivelsen ovenfor kvantifisere FITC-dekstran fluorescensintensiteten av hver lysosomer - fiksering (figurene 4B og 4C), beveger seg aksialt (fig. 4D), eller bevege seg horisontalt (fig. 4E) tillater bestemmelse av lysosomer respons på skade.

Figur 1. . Bulk cellemembranen skade ved glassperler Bildene viser atom farging (Hoechst, venstre panel), skade (grønn farging - FITC Dextran), ureparert celler (røde flekker - TRITC Dextran), og fusjonerte bilder (Merge). (A) det uskadde celler i nærvær av kalsium-, (B) Skadet-celler i nærvær av kalsium-, og (C) Skadet celler i fravær av kalsium. Scale bar 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.

Figur 2. . Sanntid avbildning av cellemembranen reparasjon svar på laserskader (A) Bilde av celler (merket med oransje farge) før skaden [venstre panel - lyse feltet (BF) ogepifluorescence (epi)], 5 sek, 1 min, og fire minutter etter skade. Skadestedet er angitt med en hvit pil. Øvre panel viser en skadet celle i nærvær av kalsium og nedre panel viser en skadet celle i fravær av kalsium. (B) graf som viser endringen i FM fargestoff farging (ΔF/F0) av cellene i panel A skadd i nærvær av kalsium (blå), eller i fravær av kalsium (rød). Området hvor FM fargestoff entrer og dermed økt fluorescens-merking ble anvendt for kvantifisering av fluorescens-intensitet. Scale bar = 10 mikrometer). Klikk her for å se større bilde.

Figur 3. Imaging lysosomal eksocytose svar på bulk skade. Bildene viser nukleær farging Hoechst (blå), celleoverflaten lamp1 farging (grønn), TRITC dekstran (rød) og fletting av alle kanaler (overlay) av (A) uskadet celler ikke er merket med primær antistoff, (B) Skadde celler lov til reparasjon i nærvær av kalsium-, og (C) skadde celler tillatt å reparere i fravær av kalsium. Scale bar 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde.

Figur 4. Sanntid avbildning av lysosomal eksocytose svar på laserskader. Celler med FITC dekstran merket lysosomes ble skadet av en pulserende laser i nærvær av kalsium. (A) Grensen for cellenble skadet er skissert (i grønt): venstre panel - lyse feltet før skaden, midtre panelet - TIRF før skade og høyre panel - TIRF 105 s etter skade. Skadestedet er preget av cyan boksen og representanten området som markeres med hvite / lilla bokser og fargede sirkler innenfor har zoomet i paneler BE. Fargen på vesikkel i hele cellebilde (grå, oransje og blå) tilsvarer fargen i zoomet inn bilder av individuelle lysosomer. (B) Venstre panel viser en tomt for ΔF/F0 verdi for FITC fluorescens av en vesikkel rekruttert etter skade. Høyre panel viser snapshots av vesikkel før skaden (-2,5 s), prefusion (102,5 s), fusjon (104,8 s) og postfusion (107,1 s). (C) Venstre panel viser en tomt for ΔF/F0 verdi for FITC fluorescens av en vesikkel dokket før skaden. Høyre panel viser snapshots av vesikkel før skaden (-2,5 s), prefusion (91 s), fusjon (93 s) og postfusion (94,5 s). (<sterke> D) Venstre panel viser et plott for ΔF/F0 verdi for FITC-fluorescens av et vesikkel beveger seg aksielt (mot og bort fra cellemembranen). Høyre panel viser snapshots av vesikkel før skaden (-2,5 s), og etter skade i annen stilling i nærheten av membranen på 59,3, 59,6 og 63,7 s. (E) på stillbilder av vesikkel som beveges horisontalt langs cellemembranen i forskjellige posisjoner før skade (-2,5 s) og etter skade i (8.7, 10.7, 11.9, 12.8 og 18.8 er). Scale bar (A = 10 mikrometer, B, C, D, E = 1 mikrometer). Klikk her for å se større bilde.

Animert video 1 Figur 2: . Real time avbildning av cellemembranen reparasjon i respons til laser skade i nærvær av kalsium FM fargestoff oppføring i en celle (merket med oransje farge) skadet av pulsetlaser i nærvær av kalsium. Filmen representerer 200 bilder ervervet hvert 2. sekund. Cellen ble skadet (region preget av cyan kvadrat) etter ramme fire. Tidsangivelsen viser tid i timen: min: sek: msek format. Scale bar = 10 mikrometer.

Animert video 2 Figur 2: . Real time avbildning av cellemembranen reparasjon i respons til laser skade i fravær av kalsium FM fargestoff oppføring i en celle (merket med oransje farge) skadet av pulset laser i fravær av kalsium. Filmen representerer 200 bilder ervervet hvert 2. sekund. Cellen ble skadet (region preget av cyan kvadrat) etter ramme fire. Tidsangivelsen viser tid i timen: min: sek: msek format. Scale bar = 10 mikrometer.

Animert video 3 Figur 4: Real time avbildning av lysosomal exocytosis svar på laserskader. Ulike reaksjoner fra lysosomer i en celle (skissert i grønt, Video 3) skadet av pulset laser. Filmen representerer 2 min av sekvensielle tid lapse bilder ervervet av TIRF mikroskopi ved 5 bilder / sek. Lysfelt bildene ble kjøpt hver 20 sek. Cellen ble skadet (angitt med cyan-boks) på 2 sekunder til videoen. De fargede sirkler (grå, oransje og blå) og den lilla boksen markere lysosomene beskrevet i figur 4 og animerte videoer 4-7, demonstrerer deres ulike skjebner etter celleskade. Tidsangivelsen viser tid i timen: min: sek: msek format. Scale bar = 10 mikrometer.

Animert video 4 figur 4 viser exocytic lysosomer preget av grått sirkel som er rekruttert til membranen som respons på skade. På 7 sek (5 sek innlegg skade) inn i denne videoen lysosome blir rekruttert på cellemembranenog deretter sikringer på dette området på 1 min og 47 sek. Scale bar = 1 mm.

Animert video fem figur 4 viser exocytic lysosome preget av oransje sirkel som lå ved kai på membranen før skade og sikringer på dette nettstedet 1 min og 35 sek. Scale bar = 1 mm.

Animert video 6 figur 4 viser lysosomer merket med blå sirkel som beveger seg mot og deretter bort fra cellemembranen. Scale bar = 1 mm.

Animert video 7. Figur 4 viser en region av cellen merket med fiolett boksen i Video 3 der etter skade et av lysosomer (hvit sirkel) beveger along cellemembranen. Scale bar = 1 mm.

Discussion

Cellemembranen skade in vivo forekommer på grunn av en rekke fysiologiske belastninger og flere eksperimentelle tilnærminger er blitt utviklet for å etterligne disse. Disse inkluderer å skade cellemembran av adherente celler ved å skrape dem av fatet eller ved passering gjennom en trang boring sprøyte ^9,10. Etter slike skader cellene gro i suspensjon og ikke levd opp til den ekstracellulære matrise som de vanligvis gjør i vevet. Atter andre, slik som bruken av poredannende toksiner kjemisk forandre cellemembranen ved å ekstrahere lipider som for eksempel kolesterol, altså ikke etterligne in vivo mekaniske skader ^5. Således kan fremgangsmåten anvendes for celleskade påvirke det som kan læres om reparasjonsrespons. Dette gjør det nødvendig å utøve forsiktighet ikke bare i valget av celleskade assay, men også å velge tilnærminger som bedre etterligner de mekaniske skader in vivo. Slike tilnærminger inkluderer scratch skade (hvor en monolayer av celler blir skadetmed en skalpell eller nål) og glassperler skade (der skaden er forårsaket av glassperler rulle over levd celler). Disse metodene er godt egnet for å skade cellene i hopetall, men er ikke mottagelig for sanntid avbildning av cellemembranen reparasjonsprosessen. Bruk av microneedles og pulserende lasere for å skape lokaliserte og godt kontrollert skader på treffpunktet ligne den mekaniske og traumatisk skade in vivo, og er mottagelig for sanntids avbildning av reparasjonsrespons, men gir innsikt i reparasjon av en celle om gangen. Det er verdt å merke seg at den pulsede laserskade tilnærming er forskjellig fra bruken av forlenget bestråling av cellemembranen med nonpulsed lasere, der membranskade forårsaket av lokalisert oppvarming, noe som er kjent for å indusere nonphysiological effekter som photoxidative og photothermal skade på membranlipider og cytosoliske komponenter ^11.

De protokoller som er beskrevet her tillater å utnytte potensialet til en of en masse skade tilnærming, som er avhengig av bruk av glassperler, og en av de lokaliserte skade metoden (pulset laser) for å overvåke evnen, kinetikken og subcellulære handel involvert i reparasjon av cellemembranen følgende mikrometerstørrelse skade. Disse metodene er gjensidig gratis - bulk skade gjør at du bruker en populasjon av celler til å identifisere et underskudd i reparasjons evne og subcellulære menneskehandel knyttet til den. Ved å muliggjøre sanntids visualisering av reparasjon i de enkelte celler, tillater laserskade tilnærming identifisere hvilke trinn av cellemembranen reparasjon og det subcellulære arrangementer er forbundet med underskudd i reparasjon. Denne tilnærmingen har vært brukt for å overvåke cellemembranen reparasjon i pattedyr og virvelløse organismer ^7,12,13. Basert på behovene i eksperimentet en av disse to metoder kan brukes for seg selv. Imidlertid, når innholdet av reparasjons underskudd ikke er kjent eller den subcellulære mekanismen som er involvert i tsin prosessen ikke er kjent, ved hjelp av en kombinasjon av disse metodene er nyttige.

På grunn av den iboende variasjon i antallet celler skadd mellom prøvene i endepunktet basert celleskade-analyser er det nødvendig å identifisere uavhengig alle celler som er skadet, som administreres for å reparere og de som ikke klarte å reparere. Den glassperle skade tilnærming har vi beskrevet her gjør det mulig å identifisere disse celler. Ved gjennomføringen av glassperle såret er det viktig at samtidig som man gjør forsøk på å maksimere antallet celler skadet skadene seg er mild slik at cellene ikke mottar flere treff. Dette er viktig siden gjentatt skade vil føre til at cellene (selektivt de som er fattige på reparasjon) for å dø ut og løsner fra dekkglass under prosedyren. Dette vil resultere i en undervurdering av celler som ikke klarte å reparere. Det er også viktig for å unngå rulling av glassperlene under håndtering og vasking av dekkglass for å eliminere eventuelle nye skader hvilkenvil resultere i en rød farging (falske positive celler). Denne fremgangsmåten for skade gjør det også mulig å overvåke en populasjon av celler for celleoverflate-translokasjon av proteinet av interesse, som er vist her i lysosomer forbundet membran protein 1 (lamp1). Ved å overvåke bare den lokaliserte celleoverflateproteiner ved immunfluorescens et nøkkelkrav, er å benytte antistoffer som binder det ekstracellulære domenet av proteinet av interesse og immunolabel celler før fiksering. Dette gjør det mulig å sammenligne lamp1 nivå på cellemembran i skadde celler med uskadde celler eller mellom forskjellige populasjoner av celler. Selv om denne protokoll er blitt illustrert ved hjelp av lamp1, kan den anvendes på enhver annen protein grepet av hvilke det er et antistoff som er spesifikke for proteinet sitt ekstracellulære domene. Når skade utløst lysosomal eksocytose må sammenlignes mellom to cellelinjer som ikke er etablert for å ha lik basaldose (ikke utløst av skade) av lysosomal eksocytose, Celleoverflate lamp1 flekker på uskadde celler bør også måles. For denne ytterligere prøven blir behandlet på samme måte som prøve C2, bortsett fra at i trinn 9 i cellene bør inkubert med det primære antistoff. Dette vil gi et mål på basaldosen av lysosomal eksocytose.

For laser skade protokollen cellemembranene blir skadet av en høy intensitet enkelt foton nsec pulset laser. Såret er utført i nærvær av celle impermeant fargestoff som fluorescens øker ved bindende endomembransystemet (f.eks FM 1-43). Således etter at cellen forbundet fargestoff fluorescens er et mål for tiden tatt av cellen for å helbrede ^3. Laser skade fører til at FM fargestoff å gå inn i cellen og binder endomembranes, noe som resulterer i økning i FM fargestoff fluorescens. Reparasjon av den skadede cellemembranen hindrer ytterligere fargestoff inntreden i cellen. Således, for en celle som reparasjoner, fluorescensen av fargestoffet når et platå, mens det for en celle som ikke klarer å reparere fargestofffluorescens øker stadig.

Levende celle avbildning av individuelle subcellulære hendelser involvert i celle-membran reparasjon krever overvåking av cellemembranen ved høye signal-til-støy-forhold. Total indre refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi er en tilnærming godt egnet for avbildning celleoverflatearrangementer på et høyt signal-til-støy-forhold ^14-16. Det finnes flere kommersielt tilgjengelige TIRF systemer, og et av disse systemene er kompatible med levende celle avbildning kan benyttes. I tillegg har vi beskrevet tilnærminger for å sette opp hjemmelagde TIRF mikroskoper andre steder ^17,18. Uavhengig av TIRF oppsett er det behov for å etablere tilnærminger som tillater overvåking av ulike skjebner av subcellulære vesikler før og etter skade. Andre steder vi har gitt en diskusjon av slike tilnærminger som tillater overvåking art, varighet og grad av sammensmelting av hver Lysosom ^19. For å overvåke skade utløst eksocytose av FITC-dekstran merket lysosomes beskrevet i protokollen fire nøkkelfunksjon for å observere er de blinker. Den flash innebærer frigjøring av FITC-dekstran inneholdt i enkelte lysosomer i et enkelt trinn som resulterer i lateral spredning av fluorescensen. Mens hvert blink indikerer vanligvis en exocytic fusjon av enkelt lysosome, er det viktig å etablere dette ved å overvåke hvor mange lysosomer er til stede på fusjon området før og etter blitsen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS