Protocol
确保涉及动物所有的程序都通过适当的动物使用认可和照顾身体。
1，准备股票缓冲器提前
- 准备2升股票的 Ca 2 +免费台氏（ 表1）。将pH调节至7.4，用NaOH。
- 准备2升股票1.2mM的钙台氏（ 表2）。将pH调节至7.4，用NaOH。
2，在实验当天，准备灌注，转移和消化缓冲器
- 准备150毫升灌注缓冲液中的Ca 2 +免费台氏（ 表3），并通过0.2微米的过滤器过滤。
- 准备35毫升的 Ca 2 +免费接送“缓冲液A”（ 表4）和25ml 钙含“缓冲液B”（ 表5）。每个过滤通过0.2微米的过滤器。
- 准备为0的解决方案0.06，0.24，0.6，和1.2毫米的Ca 2 +混合缓冲液A和B按照表6。
- 制备25毫升消化缓冲液通过在基于鼠标的体重（BW）25毫升灌注缓冲液（ 表7）中溶解消化酶。通过使用前用0.2微米的过滤器过滤。
3，实验装置
- 组装恒定的流量的Langendorff装置，市售或使用蠕动泵，管道和换热器盘管，使为3ml /分的流量的灌流液加热到37°C以上。一个简单的原理设在2011年的审查贝尔等[18]。
- 设置循环水浴中的Langendorff装置的温度（〜47℃），以便从所述套管的外流是在37℃以3毫升/分钟的流速。
- 运行70％的乙醇通过灌注系统15分钟，接着用100ml超纯I型水。通过SYSTE运行灌注缓冲米5分钟，同时消除气泡。
- 消毒所有的手术工具有希望的方法。
- 通过将PE-50管的一小段（约3mm）至23政鲁尔存根适配器的前端创建插管。管散热技巧来创建一个唇在其上主动脉将定位。
4，心肌细胞分离
- 注入小鼠用0.2ml肝素溶液（1,000 IU /毫升）中，通过腹膜内注射。
- 5分钟后，麻醉小鼠异氟烷。当完全麻醉（无反应强烈脚捏），胸部喷用70％乙醇。打开胸腔，迅速摘除心脏，小心不要损坏主动脉，并将其放置在4℃灌注缓冲区。用弯钳抓住并提起下的心脏。这将创建空间修剪后面用细剪刀心脏附件。
- 通过轻轻地抓主动脉的边缘有两对细镊子，小心地拉动openi导管插入心脏纳克主动脉超过套管的唇。确保套管的前端不是过去的主动脉瓣和入脑室，因为这将通过冠状动脉抑制心脏的灌流。
- 通过捆扎的5-0丝线缝合环围绕主动脉立即插管的嘴唇上面固定主动脉插管。
- 注意：步骤4.2至4.4，应尽可能快地提供最好的质量消化完毕。
- 注意：心脏可以直接挂到已附加到的Langendorff装置与流灌注缓冲套管。然而，悬在心脏上连接到一个小注射器的解剖显微镜下灌注缓冲套管已被发现是最成功的。这使得少量的血流灌注缓冲被推至，看的冠状动脉的结算和保证心脏牢固地连接套管。该套管，然后挂在Langendorff离与运行灌注缓冲区。
- 灌注与钙离子游离灌注缓冲的心脏在3毫升/分钟2-3分钟的流量。
- 切换到消化酶和缓冲液灌注7-10分钟，心脏会变得柔软，颜色较浅。
- 注意：消解时间可以根据酶的活性和心脏的大小进行调整。
- 一旦心脏是触觉松弛，在无菌P60菜用缓冲液A（ 钙免费接送缓冲区）移除插管和心脏的地方。
- 卸下心房和大血管。如果需要除去右心室。用钳子，分离心室切成小块。吸管数次，用无菌5毫升移液管，以进一步分散细胞。
- 通过250微米的尼龙网过滤器过滤细胞悬液到50毫升锥形管。
- 使悬浮液沉淀约10分钟。
- 转移球团入0.06毫米的Ca 2 +的解决方案。使细胞沉淀10分钟。健康的细胞会沉淀，而大部分死亡的细胞会漂浮。 吸出上清液，将沉淀转移到0.24毫米的Ca 2 +溶液。
- 重复温育10分钟，吸出，并通过剩余的两个钙离子溶液转移至细胞中的1.2mM的溶液。在这一点上，大多数的细胞应该是杆状细胞。
5，测量收缩和钙瞬变
- 注意：两个收缩力和钙瞬变可以同时测量。
- 由在无水DMSO中重悬浮至1微克/微升的浓度制备的Fura-2 AM溶液。的Fura-2 AM溶液能在-20℃下储存在干燥器中。
- 负载1毫升悬浮细胞用1微升的Fura-2 AM。让细胞坐在黑暗中10分钟，然后吸出上清液。与钙台氏液洗两次，使细胞在黑暗中以沉淀的洗涤之间进行10分钟。
- 放置盖玻片的阶段插入，使加热PErfusion /愿望和电极与心肌细胞领域的刺激起搏。在倒置显微镜地方台刀片设置了荧光测量，如果使用油浸物镜加一滴油镜头。
- 设置加热重力灌注1.2毫米的Ca 2 +台氏液等阶段溶液达到37℃。附吸真空。连接电极。
- 打开显微镜系统上，并打开成比例的荧光和细胞尺寸的数据采集软件。
- 加入几滴的Fura-2 AM负载细胞的阶段插入，阻断血流灌注瞬间，让健康的细胞来解决。
- 使用40倍物镜找到所需的细胞。一个健康的细胞应该是杆形，而不是自发收缩。它应该明显地，均匀地合同时，电池节奏5-20五。
- 注意：某些生理分析需要高品质的消化。它能够具有细胞看起来健康但不啪 CE以及生理分析。消化协议可能需要细化，以获得高品质，健康的细胞。此外，突变体或患病的心脏，可能需要修改的协议。
- 调整镜头旋转和改变光圈，使所需的细胞被一字排开横在屏幕上，背景是不可见的。
- 对齐边缘检测杆到心肌细胞的每一端，并调整阈值。对齐肌检测细胞的均匀肌节的一部分。可以使这条越长，肌节长度的更精确的数学模型将是，只要它不是对肌节的两个群体。
- 吴佩慈细胞2 Hz和5-20 V对于拍摄前10-15秒。
- 跟踪记录。环境光线应尽量减少最佳钙瞬变记录。
6，分析
- 分析使用比率荧光和细胞尺寸数据采集软件的痕迹。
- 这个协议提供了过量的细胞，可用于各种其他实验，包括：固定和染色，评估直接药物作用，短期培养，和原子力显微镜。
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Representative Results
一旦收缩和瞬态描收集（ 图2），数据很容易与适当的软件进行分析。整个跟踪，或它们的部分可以被平均化（ 图3）。收缩可以以各种不同的方式进行分析。对于收缩功能，人们可以评估收缩与缩短分数，或收缩随时间的速度的幅度峰值缩短和收缩速度。舒张功能同样可以用50％的时间缩短，减少速度进行分析。对于钙瞬变，类似的数据可以比包括基线和峰的Fura-2的比率和达峰时间或基线（ 表8）。这些分析提供来自WT和KO心脏上心脏收缩和舒张的细胞收缩功能，以及钙流，其中任何一个可以被改变的心脏具有类似整个器官功能障碍的可比数据。此外，从相同的隔离单元可以可用于其它如在协议中列出的实验，包括免疫组织化学染色（ 图4）。
| Ca 2 +的免费泰洛 | 毫 | FW /浓度 | 量为2升的解决方案 |
| 氯化钠 | 135 | 58.44克 | 15.8克 |
| 氯化钾 | 4 | 74.56克 | 0.596克 |
| 氯化镁 | 1 | 1米 | 2毫升 |
| HEPES | 10 | 238.31克 | 4.77克 |
| 加入NaH 2 PO 4 | 0.33 | 141.96克 | 0.094克 |
表1无钙台氏液 - ReageNTS为2升的股票钙 -free台氏液中。
| 1.2毫米的Ca 2 +台氏 | 毫 | FW /浓度 | 量为2升的解决方案 |
| 氯化钠 | 137 | 58.44克 | 16克 |
| 氯化钾 | 5.4 | 74.56克 | 0.805克 |
| 氯化镁 | 0.5 | 1米 | 1毫升 |
| HEPES | 10 | 238.31克 | 4.77克 |
| 氯化钙2·2H 2 O | 1.2 | 147.01克 | 0.353克 |
表2 1.2毫米的钙台氏液 -试剂为2升的股票1.2毫米的Ca 2 +的解决方案。
| 灌注缓冲 | 毫 | FW | 量在150毫升钙台氏无 |
| 血糖 | 10 | 180.16克 | 0.27克 |
| 2,3 - 丁二酮-肟（BDM） | 10 | 101.11克 | 0.152克 |
| 牛磺酸 | 5 | 125.16克 | 0.094克 |
表3灌注缓冲 -试剂准备灌注缓冲对实验的一天。
| 缓冲区A | 35毫升灌注缓冲 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 0.175克 |
表4缓冲液A -试剂准备缓冲区A对实验的一天。
| 缓冲液B | 毫 | FW | 25毫升钙台氏缓冲 |
| 血糖 | 5 | 180.16克 | 0.0225克 |
表5缓冲液B -试剂对实验当天制备的缓冲液B。
| 传输缓冲区 | 缓冲液A（毫升） | 缓冲液B（毫升） |
| 0.06毫米的Ca 2 + | 9.5 | 0.5 |
| 0.24毫米的Ca 2 + | 8 | 2 |
| 0.6毫米的Ca 2 + | 5 | 5 |
| 1.2毫米的Ca 2 + | 0 | 10 |
表6。传输缓冲区 -试剂准备转移缓冲对实验的一天。
| 酶消化缓冲 | 25毫升灌注缓冲 |
| 胶原酶乙 | 0.4毫克/克体重 |
| 胶原酶ð | 0.3毫克/克体重 |
| 第十四蛋白酶 | 0.05毫克/克体重 |
表7酶消化缓冲液 -试剂制备酶二拥塞缓冲对实验的一天。
| 收缩 | |
| 基线 | 1.73微米 |
| 山顶 | 1.64微米 |
| 短轴缩短率 | 4.70％ |
| 达峰时间 | 0.056秒 |
| 50％的时间基准 | 0.043秒 |
| 钙瞬变 | |
| 基线 | 1.18 |
| 山顶 | 1.32 |
| 达峰时间 | 0.021秒 |
| 50％的时间基准 | 0.083秒 |
表8。收缩和钙瞬变分析。 N = 5。
图中的实验设计1概述。 A）心经冠脉灌注酶消化缓冲液。 二）消化细胞进一步分散成单独的，健康的细胞。 三）细胞通过增加钙离子浓度依次传送使细胞变得耐钙，D）的细胞都含有的钙依赖性染料，而肌节长度，细胞长度和荧光记录的Fura-2 AM。 五）装电池电节奏。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2：A）：试 样项目承包商由肌小节长度与时间的关系。通过的Fura-2的比例随时间变化表示二）样品的钙瞬变Utility处理跟踪代表。 请点击这里查看该图的放大版本。
图3：A）分析。 乙后平均收缩跟踪）分析后钙瞬变的平均。 请点击这里查看该图的放大版本。
图4免疫荧光心肌细胞骨架（α辅肌动蛋白）的染色。
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Discussion
的质量的心肌细胞的分离需要实践和优化的一些水平。该协议包含可大大影响消化的结果的关键步骤。执行和解决方案时，这些应慎重考虑。从拆除的心脏插管灌注的时间应尽量减少，最好不超过五分钟。从鼠标在冰冷的缓冲液去除，并解剖和cannulating的心脏后，在冰冷的缓冲液灌注冲洗，立即的心脏也将增加优质消化的机会。插管本身是关键的一步。插管的尖端必须放在下面主动脉的第一分支，但尚未通过主动脉瓣进入心室，因为这会防止冠状动脉的灌注。冠状动脉灌注是必不可少的素质消化。在这个实验中，套管安装于填充灌注缓冲液的注射器。轻轻注入SMaL公司灌注缓冲安装和看冠状动脉清血可以测试插管充足后升量。
故障排除此协议涉及仔细评估上述关键步骤。如果心脏的消化过程中不会成为触觉柔软，有几个可能的原因。首先，插管时，插管的尖端可能已经被推进超出主动脉瓣，通过冠状动脉防止灌注。这可以挂在Langendorff灌注装置的心脏，但通过套管用注射器推压量小的灌注缓冲液，并仔细观看的冠状动脉到清晰的血液之前进行评估。如果灌注是足够的，但对心脏没有消化不好，可以考虑购买不同批次的酶。由于酶实际上是混合物，很多不相同的行动。我们建议购买少量的酶。当大量被发现，消化不良，PURC长谷较大数量的大量供将来使用。如所讨论的，如果剥离的心脏和插管时间超过5-10分钟，将消化的细胞的质量可能很差。考虑完成隔离与野生型或未经处理的动物，以掌握解剖移动到淘汰赛或治疗的动物之前。消化后，细胞必须缓慢进行耐钙。细胞应至少花10分钟在每个钙的解决方案。冲的这些步骤可以减少细胞中的产率和存活率。
虽然重现性好，生理测量取决于开头的品质消化。当选择小区进行测量，选择的细胞不自发收缩，这表明漏水，损坏细胞膜。节奏时，细胞应收缩均匀。考虑记录测量，以确保一致性收缩前10-15秒的起搏细胞。如果显示单元被均匀地收缩，但共同的测量ntraction幅度急剧变化随着时间的推移，先检查，以确保利益定义的区域只包括一个人群肌节。偶尔两个电池组在一起和感兴趣区域（ROI）的区域可以被测量肌节的两个不同的种群为一体。如果选择了一个适当的ROI但收缩性是可变的单个细胞内时，细胞可以是垂死和另一小区的选择应。对于钙瞬变，至关重要的是稀的Fura-2 AM在干燥的无水DMSO作为水改变的Fura-2 AM在功能上可使用的金额。装载后，允许所述第一洗涤和测量瞬变之间至少20分钟，以允许所有的Fura-2 AM到细胞内脱酯化。正如任何荧光染料，避光的细胞中，后负荷。有些细胞不会摄取染料，因此偶尔没有钙瞬变将在测量的小区进行观察。虽然收缩力和钙瞬变描记，可能会出现“清洁器“的时候，起搏率大大降低（0.5-1赫兹），测量的速度接近小鼠心脏速率，至少2赫兹因而速度优选多个生理。
隔离本身可以根据需要进行修改。这个实验室使用灌注过程中的恒定流量法（3毫升/分钟的小鼠）。有些团体已经找到了重力流更有效。重力流灌注允许消化更容易地被作为流量随着心脏消化可视化。
如所提到的，这些技术做携带限制。作为生理测量的质量依赖于消化的质量，为谨慎起见，测量从多个心脏肌细胞对各实验条件。每个心脏会提供许多细胞来衡量，而是反复消化将确保结果的心之间是一致的。隔离是一个终端程序，因此，如果实验设计涉及FOLL由于动物的心脏功能随着时间的推移，心肌细胞只能使用一次收获。更多小鼠都需要有一个队列可以纵向随后虽然个别处死小鼠，分析心肌细胞。
我们的重点一直在研究的收缩和细胞骨架结构的基因敲除小鼠，但是，孤立的心肌细胞可用于其他多种实验，包括活细胞染色T管，学习从压力或容量超负荷小鼠心肌细胞，研究药理的作用治疗，免疫荧光，转染9，以及转录谱19。这种多用途的技术提供了无数的优势来研究心脏衰竭等方法。各个单元的学习生理学给出，不是由整个器官的研究，例如超声心动图或心电图提供信息，提供的洞察，伴随整个器官F表示细胞变化ailure。此外，分离的细胞是优越的成像亚细胞结构，作为整个细胞能够容易地染色并成像。隔离心肌的收缩，钙瞬变和免疫荧光分析是一个非常通用的技术，提供了从一个巨大的各种实验设计的有价值的信息。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
马克·沃兹尼亚克在细胞与发育生物学录像设备的使用部门。
范德堡大学细胞成像共享资源。
这项工作是由美国心脏协会授予12PRE10950005到ERP系统，美国心脏协会授予11GRNT7690040到DMB，美国国立卫生研究院资助R01 HL037675到DMB的支持。 DMB是格拉迪斯体育斯塔尔曼主席在心血管研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2·2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-Butanedione-monoxime (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurine | Sigma | T-0625 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagenase B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – anhydrous | Sigma | 276855 | |
| IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system | IonOptix | ||
| 250 μm nylon mesh filter | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Luer-stub adaptor | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 tubing | Becton Dickinson | 427410 |
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