Protocol
S'assurer que toutes les procédures impliquant des animaux sont approuvés par l'utilisation des animaux appropriés et soins du corps.
1 Préparer Stock tampons à l'avance
- Préparer 2 L stocks de Ca2 + libre de Tyrode (Table 1). Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH.
- Préparer 2 L stocks 1.2 (la Table 2) de mM Ca2 + Tyrode. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH.
2 Le jour de l'expérience, Préparer la perfusion, transfert et Digestion tampons
- Préparer tampon de perfusion de 150 ml en Ca 2 + libre de Tyrode (tableau 3) et filtrer à travers un filtre de 0,2 um.
- Préparer 35 ml de Ca 2 + libre transfert "tampon A" (Tableau 4) et de 25 ml contenant du Ca2 + "tampon B» (Tableau 5). Filtre chacun à travers un filtre de 0,2 um.
- Préparer des solutions de 00,06, 0,24, 0,6, et 1,2 mM de Ca 2 + par le mélange tampon A et B au tableau 6.
- Préparer du tampon de digestion de 25 ml en dissolvant les enzymes de digestion dans 25 ml de tampon de perfusion (tableau 7) sur la base du poids corporel (BW) de la souris. Filtrer à travers un filtre de 0,2 um avant utilisation.
3. installation expérimentale
- Assemblage d'un appareil de Langendorff à débit constant, disponible dans le commerce ou à l'aide d'une pompe, un tube, et une bobine d'échangeur de chaleur péristaltique pour permettre un débit de 3 ml d'écoulement / min de solution de perfusion chauffé à 37 ° C. Un schéma simple est fourni dans l'examen de 2011 par Bell et al 18.
- Régler la température de circulation du bain d'eau (~ 47 ° C) de l'appareil de Langendorff, afin que la canule de sortie est à 37 ° C à un débit de 3 ml / min.
- Exécuter éthanol à 70% à travers le système de perfusion pendant 15 min, puis 100 ml d'eau de type I ultrapure. Tampon de perfusion courir à travers la systématisationm pendant 5 min, tout en éliminant les bulles d'air.
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec une méthode souhaitée.
- Créer une canule en fixant un morceau court (environ 3 mm) de tube PE-50 à l'extrémité 23 d'un embout Luer-G adaptateur. pointe de chaleur de tube pour créer une lèvre sur laquelle l'aorte sera positionné.
4. cardiomyocytes isolement
- Injecter souris avec 0,2 ml de solution d'héparine (1000 IU / ml), par injection intrapéritonéale.
- Après 5 min, anesthésier la souris avec isofluorane. Une fois complètement anesthésiés (pas de réponse à une forte pincée de pied), pulvériser poitrine avec EtOH à 70%. Ouvrez le coffre, exciser rapidement le coeur, en faisant attention à ne pas endommager l'aorte, et dans 4 ° C tampon de perfusion. Utilisez une pince courbes de saisir et de soulever dans le cœur. Cela crée un espace pour couper les pièces jointes derrière le cœur avec des ciseaux fins.
- Cathétériser coeur en saisissant délicatement le bord de l'aorte avec deux paires de pinces fines et en tirant soigneusement la mise en service:ng de l'aorte au-dessus de la lèvre de la canule. S'assurer que la pointe de la canule n'est pas passé la valve aortique et dans le ventricule, comme cela va inhiber la perfusion du coeur par les artères coronaires.
- Fixer l'aorte à la canule en attachant une boucle de fil de suture en soie 5-0 autour de l'aorte juste au-dessus de la lèvre de la canule.
- Remarque: Les étapes 4.2 à 4.4 devraient être achevés aussi rapidement que possible pour une meilleure digestion de la qualité.
- Remarque: Le cœur peut être accroché directement sur la canule déjà fixé à l'appareil de Langendorff avec coule tampon de perfusion. Cependant, le coeur accroché sur une canule fixée à une seringue de petit tampon de perfusion sous un microscope de dissection a été trouvé pour être plus efficace. Cela permet à une petite quantité de tampon de perfusion pour être poussée à travers, en regardant à la compensation des artères coronaires et d'assurer le coeur est solidement fixé à la canule. La canule est ensuite accroché sur le Langendorff avec la gestion du tampon de perfusion.
- Perfusele coeur de Ca2 + libre tampon de perfusion à un débit de 3 ml / min pendant 2-3 min.
- Mettre à l'enzyme tampon de digestion et perfuser pour 7-10 min, le cœur devient plus doux et plus légers en couleur.
- Remarque: la durée de minéralisation peut être ajustée en fonction de l'activité enzymatique et la taille du cœur.
- Une fois que le cœur est manifestement flasque, retirez le cœur de canule et le placer dans un plat de p60 stérile avec le tampon A (Ca2 + tampon de transfert gratuit).
- Retirer les oreillettes et les gros vaisseaux. Retirer le ventricule droit, si désiré. Avec une pince, séparer le ventricule en petits morceaux. Introduire à la pipette plusieurs fois avec 5 ml d'une pipette de transfert stérile à disperser en outre des cellules.
- On filtre la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml à travers un filtre à mailles de nylon de 250 um.
- Laisser la suspension de culot pour environ 10 min.
- Transférer le culot dans la solution 2 + Ca 0,06 mM. Permettent aux cellules de granulés pour 10 min. Les cellules saines vont sédimenter, tandis que la plupart des cellules mortes flottent. Aspirer le surnageant et transférer le culot à l'mM Ca2 + solution de 0,24.
- Répétez 10 minutes d'incubation, l'aspiration, et de les transférer dans les deux solutions 2 + Ca reste jusqu'à ce que les cellules sont dans la solution de 1,2 mM. A ce moment, la majorité des cellules doit être myocytes en forme de tige.
5. mesure contractilité et calcium transitoires
- Remarque: Les contractilité et transitoires de calcium peuvent être mesurées simultanément.
- Préparer Fura-2 AM solution par remise en suspension dans du DMSO anhydre à une concentration de 1 pg / pl. Solution Fura-2 AM peut être stocké dans un dessiccateur à -20 ° C.
- Charge 1 ml de cellules en suspension avec 1 pi Fura-2 heures. Permettent aux cellules de s'asseoir dans l'obscurité 10 minutes, puis aspirer le surnageant. Laver deux fois avec la solution de Ca2 + Tyrode, permettant aux cellules de granulés dans l'obscurité pendant 10 min entre les lavages.
- Déposer une lamelle de verre dans un insert de phase qui permet chauffé perfusion / aspiration et l'électrode de stimulation d'un stimulateur domaine des myocytes. insert de scène de la Place de microscope inversé mis en place pour la mesure de la fluorescence, en ajoutant une goutte d'huile à l'aide d'un objectif si l'objectif à immersion d'huile.
- Mettre en place une perfusion par gravité chauffée avec une solution de 1,2 mM Ca2 + Tyrode donc solution sur scène atteint 37 ° C. Fixez aspiration à vide. Appliquez les électrodes.
- Allumez le système de microscope, et ouvrir le logiciel de fluorescence et d'acquisition de données de dimensionnement des cellules quotientométrique.
- Ajouter quelques gouttes de cellules chargées de Fura-2 heures à l'insert de la scène, bloquant momentanément la perfusion afin de permettre aux cellules saines de se déposer.
- Utilisez objectif 40X pour localiser la cellule désirée. Une cellule saine doit être en forme de bâton et pas se contractant spontanément. Il faut visiblement et uniformément contrat lorsque la cellule est stimulée à 5-20 V.
- Remarque: l'analyse physiologique nécessite une digestion de haute qualité. Il est possible d'avoir des cellules qui semblent saines, mais ne le font pas pa CE et à l'analyse physiologique. protocole de digestion peut être affinée pour obtenir de haute qualité, les myocytes sains. En outre, coeurs mutantes ou malades peuvent nécessiter des modifications au protocole.
- Régler la rotation de la lentille et le changement ouverture de manière souhaitée cellule est aligné horizontalement sur l'écran et le fond n'est pas visible.
- Aligner les barres de détection de bord à chaque extrémité de myocytes et ajuster seuil. Aligner la détection des sarcomères sur une partie de cellule de sarcomères uniformes. Le plus vous pouvez faire ce bar, le plus précis du modèle mathématique de la longueur de sarcomère sera, tant que ce n'est pas sur deux populations de sarcomères.
- cellules de Pace à 2 Hz et 5-20 V pour 10-15 secondes avant l'enregistrement.
- traçage d'enregistrement. La lumière ambiante doit être minimisée pour le meilleur enregistrement calcium transitoire.
Analyse 6.
- Analyser des traces par fluorescence ratiométrique et logiciel d'acquisition de données de dimensionnement de cellule.
- Ce protocole fournit les cellules excédentaires qui peuvent être utilisés pour une variété d'autres expériences, notamment: la fixation et coloration immunologique, l'évaluation des effets directs de la drogue, de la culture à court terme, et la microscopie à force atomique.
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Representative Results
Une fois la contractilité et de tracés de passage sont recueillies (figure 2), les données sont facilement analysées avec le logiciel approprié. Le tout suivi, ou des parties de ceux-ci peuvent être en moyenne (Figure 3). Contractilité peut être analysé de différentes façons. Pour la fonction systolique, on peut évaluer l'ampleur de la contraction de la fraction de raccourcissement, ou la vitesse de contraction de temps pour culminer raccourcir, et la vitesse de contraction. La fonction diastolique peut être analysé de manière similaire avec le temps à 50% de matière grasse et de la vitesse de relaxation. Pour les transitoires calciques, des données similaires peuvent être comparés y compris la ligne de base et le pic de Fura-2 et des ratios temps au pic ou de base (tableau 8). Ces analyses fournissent des données comparables de WT et KO cœur sur la fonction contractile cellulaire systolique et diastolique, ainsi que le flux de calcium, qui peuvent tous être modifiés dans un cœur à un dysfonctionnement organique similaire entier. En outre, les cellules de la même isolement peutêtre utilisé pour d'autres expériences énumérées dans le protocole, y compris la coloration immunohistochimique (figure 4).
| Ca 2 + Tyrode sans | mM | FW / concentration | Montant pour 2 L solution |
| NaCl | 135 | 58,44 g | 15,8 g |
| KCl | 4 | 74,56 g | 0,596 g |
| MgCl2 | 1 | 1 M | 2 ml |
| HEPES | 10 | 238,31 g | 4,77 g |
| NaH 2 PO 4 | 0,33 | 141,96 g | 0,094 g |
Tableau solution de calcium 1.-libre Tyrode - Réagents pour 2 L de la solution de stocks de Ca2 + exempt de Tyrode.
| 1,2 mM de Ca2 + Tyrode | mM | FW / concentration | Montant pour 2 L solution |
| NaCl | 137 | 58,44 g | 16 g |
| KCl | 5.4 | 74,56 g | 0,805 g |
| MgCl2 | 0,5 | 1 M | 1 ml |
| HEPES | 10 | 238,31 g | 4,77 g |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 1.2 | 147.01 g | 0,353 g |
Tableau 2 1,2 mM de calcium solution de Tyrode - Réactifs pour 2 L de stock mM de Ca 2 + 1.2solution.
| Perfusion tampon | mM | FW | Montant dans 150 ml de Ca2 + Tyrode sans |
| Glucose | 10 | 180.16 g | 0,27 g |
| 2,3-Butanedione-monoxime (BDM) | 10 | 101.11 g | 0,152 g |
| Taurine | 5 | 125.16 g | 0,094 g |
Tableau 3 Perfusion Buffer - Réactifs pour la préparation du tampon de perfusion, le jour de l'expérience.
| Tampon A | 35 ml de tampon de perfusion |
| L'albumine de sérum bovin (BSA) | 0,175 g |
Tableau 4 Tampon A - Réactifs Tampon A pour préparer le jour de l'expérience.
| Tampon B | mM | FW | 25 ml de tampon de Tyrode Ca2 + |
| Glucose | 5 | 180.16 g | 0,0225 g |
Tableau 5 tampon B - Réactifs pour la préparation du tampon B, le jour de l'expérience.
| Transfert tampon | Tampon A (ml) | Tampon B (ml) |
| 0,06 mM Ca2 + | 9.5 | 0,5 |
| 0,24 mM Ca2 + | 8 | 2 |
| 0,6 mM de Ca2 + | 5 | 5 |
| 1,2 mM de Ca2 + | 0 | 10 |
Tableau 6 - Transfert de tampons réactifs pour préparer le tampon de transfert sur le jour de l'expérience.
| Tampon de digestion enzymatique | 25 ml de tampon de perfusion |
| Collagénase B | 0,4 mg / g de poids corporel |
| Collagénase D | 0,3 mg / g de poids corporel |
| Protéase XIV | 0,05 mg / g de poids corporel |
Tableau 7 tampons digestion enzymatique - Réactifs pour préparer enzyme diGestion du tampon le jour de l'expérience.
| Contractilité | |
| Baseline | 1.73 pm |
| Pic | 1.64 pm |
| La fraction de raccourcissement | 4,70% |
| Temps au pic | 0,056 sec |
| Le temps de référence de 50% | 0,043 sec |
| transitoires calciques | |
| Baseline | 1.18 |
| Pic | 1,32 |
| Temps au pic | 0,021 sec |
| Le temps de référence de 50% | 0,083 sec |
Tableau 8 analyse la contractilité et de calcium transitoire. N = 5.
Figure 1 Vue d'ensemble de la conception expérimentale. A) coeur est digéré par perfusion coronaire avec un tampon de digestion enzymatique. B) Les cellules sont ensuite dispersées dans individuels, les myocytes sains. C) Les cellules sont transférées de manière séquentielle à travers des concentrations croissantes de calcium si les cellules deviennent tolérant au calcium. D) Les cellules sont chargées avec le calcium dépendante colorant, Fura-2 cellules AM. E) Loaded sont électriquement rythme tout en longueur de sarcomère, longueur de la cellule, et la fluorescence sont enregistrées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 A) contraction de l'échantillontilité traçage représentée par la longueur des sarcomères en fonction du temps. transitoires B) de calcium de l'échantillon représenté par Fura-2 rapport en fonction du temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 A) contractilité du tracé moyen après analyse. B) Moyenne des transitoires de calcium après analyse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 La coloration par immunofluorescence des cardiomyocytes cytosquelette (α-actinine).
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Discussion
Isolation des cardiomyocytes de qualité nécessite un certain niveau de pratique et d'optimisation. Ce protocole contient des étapes clés qui peuvent grandement influer sur le résultat de la digestion. Ceux-ci devraient être examinés avec soin lors de l'exécution et le dépannage du protocole. Le temps de retrait de la canule de coeur et la perfusion doit être réduit au minimum, de préférence moins de cinq minutes. Rinçage du coeur immédiatement dans un tampon de perfusion glacé après le retrait de la souris et de dissection et canulation du coeur dans un tampon glacé permettra également d'augmenter les chances d'une digestion de la qualité. La canule elle-même est une étape critique. La pointe de la canule doit être placée au-dessous des premières branches de l'aorte, mais pas à travers la valve aortique dans le ventricule, comme cela empêchera la perfusion des artères coronaires. Perfusion coronaire est essentiel à une digestion de qualité. Dans ce laboratoire, la canule est attachée à une seringue remplie avec le tampon de perfusion. Injecter doucement un small Le montant de tampon de perfusion après le montage et regarder les artères coronaires claires de sang peuvent tester l'adéquation de la canule.
La résolution de ce protocole consiste à évaluer soigneusement les étapes critiques mentionnées ci-dessus. Si le cœur ne devienne pas manifestement doux au cours de la digestion, il ya quelques causes possibles. Tout d'abord, lors de la canulation, le bout de la canule a pu être avancé au-delà de la valve aortique, la prévention de la perfusion à travers les artères coronaires. Elle peut être évaluée avant de raccrocher le coeur sur l'appareil de Langendorff mais poussant une petite quantité de tampon de perfusion à travers la canule avec une seringue et regarder attentivement pour les artères coronaires à claire de sang. Si la perfusion est adéquate, mais le cœur ne digère pas bien, envisager l'achat de lots différents d'enzymes. Parce que les enzymes sont en fait des mélanges, beaucoup n'agissent pas de manière identique. Nous recommandons d'acheter de petites quantités de chaque enzyme. Lorsque les lots sont a constaté que bien digérer, PURCHase de grandes quantités de ce lot pour une utilisation future. Tel que discuté, si la dissection et cathétérisme du cœur prennent plus de temps que 5-10 minutes, la qualité des cellules digérées peut être pauvre. Envisager de remplir isolements de type sauvage ou des animaux non traités pour maîtriser la dissection avant de passer au coup de grâce ou les animaux traités. Après digestion, les cellules doivent être lentement être tolérant au calcium. Les cellules doivent passer au moins 10 min dans chacune des solutions de calcium. Rushing ces étapes peut diminuer le rendement et la viabilité des cellules.
Bien reproductible, les mesures physiologiques dépendent en commençant par une digestion de la qualité. Lors de la sélection des cellules à mesurer, choisir les cellules qui ne sont pas spontanément contractantes, ce qui indique une membrane cellulaire qui fuit, endommagé. Les cellules doivent contracter uniformément rythme. Pensez à la stimulation des cellules pendant 10-15 secondes avant l'enregistrement des mesures pour assurer la cohérence de contraction. Si la cellule semble se contracter de façon uniforme, mais les mesures de coopérationntraction ampleur varie considérablement au fil du temps, vérifiez d'abord pour s'assurer que la région d'intérêt définie couvre une seule population de sarcomères. Parfois deux cellules de regrouper et de la région d'intérêt (ROI) peuvent être la mesure de deux populations différentes de sarcomère comme l'un. Si un retour sur investissement approprié est choisi, mais la contractilité est variable dans une seule cellule, la cellule peut être en train de mourir et une autre cellule doit être choisi. Pour les transitoires calciques, il est essentiel de diluer Fura-2 heures dans du DMSO anhydre déshydraté que l'eau modifie la quantité de Fura-2 heures qui est fonctionnellement disponible. Après le chargement, attendez au moins 20 minutes entre le premier lavage et transitoires de mesure pour permettre à tous Fura-deux heures à désestérifier intérieur de la cellule. Comme avec n'importe quel colorant fluorescent, de protéger les cellules de la lumière pendant et après le chargement. Certaines cellules ne seront pas l'absorption du colorant, donc de temps en temps pas transitoires de calcium seront observés dans une cellule de mesure. Bien que la contractilité et de calcium transitoires tracés peuvent apparaître "nettoyeur "lorsque la fréquence de stimulation est fortement réduit (de 0,5 à 1 Hz), les mesures sont plus physiologique à un débit plus proche de la fréquence cardiaque de la souris, ainsi un rythme d'au moins 2 Hz est préférée.
L'isolation elle-même peut être modifié si on le souhaite. Ce laboratoire utilise une méthode de débit constant (3 ml / min pour les souris) pendant la perfusion. Certains groupes ont trouvé une densité de flux plus efficace. perfusion par gravité avec la digestion de visualiser plus facilement que les augmentations de débit que le cœur est digéré.
Comme mentionné précédemment, ces techniques ne portent limites. Comme la qualité des mesures physiologiques dépend de la qualité de la digestion, il est prudent de mesurer les myocytes de plus d'un cœur pour chaque condition expérimentale. Chaque coeur offrira de nombreuses myocytes à mesurer, mais digestions répétées veillera à ce que les résultats sont conformes entre les cœurs. L'isolement est une procédure terminale, donc, si la conception expérimentale implique Follen raison de la fonction cardiaque d'un animal au fil du temps, les cardiomyocytes ne peuvent être récoltés une fois. Plus de souris sont nécessaires pour une cohorte peuvent être suivis longitudinalement tandis que les souris individuelles sont sacrifiés pour analyser les cardiomyocytes.
Notre objectif a été d'étudier la contractilité et la structure du cytosquelette dans une souris knock-out, cependant, les cardiomyocytes isolés peuvent être utilisés pour une variété d'autres expériences, y compris la coloration de cellules vivantes pour les T-tubules, l'étude de cardiomyocytes de pression ou des souris de volume surchargé, l'examen des effets de pharmacologique traitement, immunofluorescence, la transfection 9, et la transcription de profilage 19. Cette technique polyvalent offre de nombreux avantages sur les autres méthodes utilisées pour étudier l'insuffisance cardiaque. Étude de la physiologie des cellules individuelles donne des informations qui ne sont pas offerts par des études d'organes entiers tels que l'échocardiographie ou l'électrocardiographie, offrant un aperçu des changements cellulaires qui accompagnent organe f toutedéfailla-. En outre, les cellules isolées sont supérieurs pour les structures sous-cellulaires d'imagerie, comme l'ensemble de la cellule peut être facilement teinté et imagée. Isoler cardiomyocytes pour l'analyse de la contractilité, transitoires de calcium, et immunofluorescence est une technique extrêmement polyvalent qui offre de précieuses informations à partir d'une grande variété de modèles expérimentaux.
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Disclosures
Nous n'avons rien à divulguer.
Acknowledgments
Marc Wozniak pour l'utilisation du Département de biologie cellulaire et de l'équipement de la vidéographie de développement.
Université Vanderbilt imagerie cellulaire de ressources partagées.
Ce travail est soutenu par AHA subvention 12PRE10950005 à l'ERP, AHA subvention 11GRNT7690040 de DMB, NIH R01 HL037675 à DMB. DMB est le président Gladys P. Stahlman en recherche cardiovasculaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2·2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-Butanedione-monoxime (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurine | Sigma | T-0625 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagenase B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – anhydrous | Sigma | 276855 | |
| IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system | IonOptix | ||
| 250 μm nylon mesh filter | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Luer-stub adaptor | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 tubing | Becton Dickinson | 427410 |
References
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