Multilayer Montering for Long-term Lett Sheet Mikroskopi av Sebrafisk

Summary

Utviklingen av sebrafisk kan følges over dager med lys ark mikros når embryo er innebygd i optisk klare polymer rør med lav konsentrasjon agarose.

Abstract

Lett ark mikroskopi er det ideelle avbildningsteknikk å studere sebrafisk embryoutvikling. På grunn av minimal fototoksisitet og bleking, er det spesielt egnet for langsiktig time-lapse bildebehandling over mange timer opp til flere dager. Imidlertid er en egnet prøvemontering strategi trengs som tilbyr både innesperring og normal utvikling av prøven. Multilayer montering, en ny embedding teknikk med lav konsentrasjon agarose i optisk klare rør, overvinner nå denne begrensningen, og slipper løs det fulle potensialet av lys ark mikroskopi for sanntids utviklingsbiologi.

Introduction

For å forstå de komplekse hendelser og interaksjoner under embryogenese, er forskning i utviklingsbiologi mer og mer å flytte fra mikroskopi av enkeltceller og organer til in vivo avbildning av hele organismer. Tradisjonelle mikroskopi teknikker vanligvis ikke klarer å tilby den romlig og tidsmessig oppløsning til å følge raske hendelser over en lengre periode, og ofte føre til bleking eller fototoksiske effekter i utvalget ^en. Vi og andre funnet lette ark mikroskopi (figur 1) til å være en ideell teknikk for in vivo avbildning av sebrafisk ^2-4. Belysningen av prøven med et tynt ark av laserlys, ortogonalt i forhold til deteksjonsaksen, og har fast optisk snitting med høy romlig oppløsning og minimale ^bilde-5 toksisitet. På samme tid, på grunn av denne unike optiske arrangement, tradisjonelle eksempelmonteringsteknikker ved hjelp av petriskåler eller kulturkamre er ikke egnet. I en typisk lettark mikroskop tre translasjonelle motorer og en rotasjonsmotor holde prøven, slik at det kan bli nøyaktig plassert, vendte og betraktes fra alle retninger. I de siste prøvene for lys ark mikroskopi har ofte vært forankret i 1-2% agarose inne i et glass kapillær ^6,7. I dette tilfelle ble den størknede agarose sylinder med de innleirede prøven ekstruderes ut av glasskapillært inn i prøvekammeret fylt med vannlignende medium for avbildning. Agarose har en brytningsindeks i nærheten av vann, og er derfor godt egnet for in vivo lett ark mikroskopi som muliggjør vann korrigert belysning-og deteksjonsoptikken. Prøven innesperret i den stive agarose og kan avbildes godt for en kort periode, men morfogenetiske forandringer og vekst av embryoet blir sterkt svekket når avbildning i flere timer ^7,8. Selv om løsninger for andre applikasjoner har blitt utviklet ^ni, den ikke-invasiv langsiktig time-lapse sebrafisk avbildning potensial av lys mikros arket kan ikke utnyttes ved hjelp av den konvensjonelle 1,5% agarose innebygging.

Vi har derfor utviklet en ny montering strategi for in vivo lys ark mikroskopi av sebrafisk embryo ^10. Prøven er montert i 0,1% agarose med 200 mg / L Tricaine inne i et rør laget av optisk klar polymer fluorert etylenpropylen (FEP). Den innebygde embryoet utvikles normalt på grunn av lav viskositet av mediet. På samme tid, begrenser den FEP røret mediet og prøven for varigheten av eksperimentet. Her gir vi en detaljert protokoll av den nye monteringsteknikk og presentere data som gjenspeiler dens fordeler fremfor den konvensjonelle protokollen. Vi viser at med vår metode sebrafisk utvikling kan være kontinuerlig avbildes med høy romlig og tidsmessig oppløsning over en periode på mer enn to dager.

5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
Figur 1. Prinsippet for lys ark mikroskopi. A sebrafisk montert i et rør laget av Fluor etylenpropylen (FEP) kan oversettes og roteres gjennom midtplanet av målet deteksjon. Et tynt ark av laserlys (lys sheet) anslås ved belysning av målet til fokalplanet for det formål deteksjon og lyser bare en tynn optisk seksjon av prøven. Den emitterte fluorescens-signalet blir oppsamlet ved målet deteksjon og tatt opp på en kamerabrikke.

Protocol

En. Materiale Forberedelse

1. Utarbeidelse av FEP-rør
   1. Rengjør FEP tube (Figur 2A) ved å skylle væsker (i fremgangsmåten beskrevet nedenfor) gjennom røret og ved hjelp av en sprøyte festet med en butt ende kanyle (figur 2B) Note 1:.. Bruk hansker hele prosedyren Note 2: Vi anbefaler kutte røret i stykker av ca. 1 m i lengde og rensing de i parallell.
      1. Spyle det første røret med 1 M NaOH gjentatte ganger. Deretter overføres røret til et 50 ml sentrifugerør fylt med 0,5 M NaOH og ultrasonicate det i 10 min.
      2. Overfør polymer røret til en liten kum med DDH ₂ O. Skyll røret først med DDH ₂ O og deretter med 70% EtOH.
      3. Deretter overføre FEP tube til en frisk sentrifugerør med 70% EtOH. Igjen ultrasonicate denne sentrifugerør i 10 min.
   2. Skjær den rensede FEP tube i biterpå ca 3 cm (en typisk lengde til bruk i sebrafisk montering og bildebehandling) og rette dem om nødvendig. Oppbevar de rengjorte FEP rør i en frisk 50 ml sentrifugerør fylt med DDH ₂ O (figur 2C).
2. Utarbeidelse av Tricaine stamløsning
   1. Forbered 0,4% Tricaine stamløsning ved oppløsning av 400 mg Tricaine (MS-222) i 97,9 ml DDH ₂ O. Etter at pulveret er fullstendig oppløst, juster pH til 7,0 med 2,1 ml 1M Tris (pH 9,0). Beskytt løsning mot lys. Oppbevar alikvoter ved -20 ° C.
3. Fremstilling av 3% metylcellulose
   1. Forbered 3% methylcellulose-løsning for den indre belegg av FEP-rør som er beskrevet nedenfor. Varm opp E3 ¹¹ i en glassflaske til ca 60-70 ° C og legge til riktig mengde methylcellulose pulver. Legg til en rørestav og omrør ved 4 ° C. Så snart løsningen er avkjølt til under 30 ° C, tilsett Tricaine løsningen til en slutt-concentration av 100 mg / L. Hold omrøring ved 4 ° C over natten.
4. Fremstilling av 1,5% og 0,1% agarose i E3
   1. Oppløs den riktige mengde av lavt smeltepunkt agarose pulver i et definert volum av E3 i en glasskolbe. Varm opp blandingen i en mikrobølgeovn og rist den gang på en stund, inntil agarose løsning vises homogen, uten eventuelle gjenværende krystaller.
   2. Tilbered en ml alikvoter av 0,1% agarose-løsning i 1,5 ml reaksjonsrørene. De alikvoter kan lagres ved 4 ° C.
   3. Bruk 1,5% oppløsning for å belegge en plastpetriskål. Tykkelsen av agarose lag bør være ca. 2 mm. Etter agarose er størknet, tilsett E3 medium på toppen av laget for å hindre at den tørker. Den belagte fatet kan lagres ved 4 ° C.
5. Utarbeidelse av sebrafisk
   1. Hold Sebrafisk (Danio rerio) voksne og embryoer ved 28,5 ° C og håndtere dem i henhold til de etablerte protokoller ^11,12.
   2. Sett opp mannlige og kvinnelige fisk i ettermiddag og skille dem ved hjelp av en skillevegg. Fjern skillet følgende morgen for å ta tiden på parring av fisken.
   3. Samle embryoene i en skål fylt med E3 og undersøke dem ved hjelp av en stereomikroskop.
   4. På 24 HPF (eller utviklingsstadiet av interesse), velg sebrafisk embryo for fluorescens uttrykk og overføre de positive til en ny rett med fersk E3.
   5. Nøye dechorionate embryoene ved hjelp av to skarpe tang (Tall 2D og 2E). Bruk første pinsett til å fange og holde chorion og de ​​andre pinsett til å rive det åpne og trekke den av Note 1:. Utfør dette trinnet ved hjelp av en stereomikroskop.

2. Multilayer Montering

1. Belegg FEP tube
   1. Fest en butt ende kanyle til en sprøyte. Sett kanylen omhyggelig i omtrent 3 mm i en ende av et renset og skåret stykke. FEP tube (Tall 2F og 2G) Note 1: Bruk hansker og unngå å bøye eller klemme på røret.
   2. Dypp den frie ende av FEP røret i 3% metylcellulose og fylle røret med løsningen.
   3. Langsomt frigjøre methylcellulose ved å skyve på sprøyten. Oppløsningen kasseres.
   4. Gjenta trinn 2.1.2 og 2.1.3 hjelp E3 Note 1:. De belagte rør må brukes for montering umiddelbart.
2. Overføre sebrafisk til agarose
   1. Varm opp en aliquot på 0,1% agarose i 70 ° C i en varmeblokk. Vortex kort reaksjonsrøret og overføre den til en varmeblokk er satt til 38 ° C (figur 2H).
   2. Ta reaksjonsrøret ut fra varmeblokk og la den kjøle seg ned en kort stund. Legg Tricaine til en endelig konsentrasjon på 133-200 mg / l og vortex igjen (fig. 2i).
   3. Velg ett av de dechorionated sebrafisk embryo og overfør. r det til reaksjonsrøret med forvarmet 0,1% agarose ved hjelp av en glass Pasteur-pipette (figurene 2J og 2K) Note 1: Forsøk for å overføre så lite ekstra E3 som mulig.
3. Montering av sebrafisk
   1. Ta opp embryoet med sprøyte-festet FEP tube (Figur 2L). . Røret fylles helt med 0,1% agarose med embryoet plassert nær hver ende av røret, og med hodet pekende mot åpningen av røret Note 1: Kontroller for å ta opp noen agarose lot seg fisken. Merknad 2: Trekk svært forsiktig på sprøyten for å unngå bobler Note 3:. Hold røret i en horisontal orientering for å unngå lekkasje av sitt innhold (Tall 2M og 2N).
4. Plugging røret
   
   Figur 2. Multilayer montering for sebrafisk embryo. A) Fluor Ethylene Propylene (FEP) rør på en kabeltrommel før tilberedning. B) en sprøyte med en butt ende kanyle festet. C) En renset og kuttet FEP tube. D, E) Dechorionation av 24 HPF sebrafisk embryoer. F) Festing av røret til den butte ende kanyle. G) Den sprøyte med kanyle og røret er festet. H) En alikvot på 0,1% agarose i et reaksjonsrør ved overføring av den i en varmeblokk. I) virvling av smeltet agarose. J) Opptak av en dechorionated embryo ved hjelp av et glass pipette. K) Overføring av embryoet inn i smeltet agarose. L) Inntak av embryoet med omkring agarose inn i FEP tube. M, N) Den sebrafisk embryo inne i FEP tube . P) Plugging røret ved anvendelse av en agarose-overtrukket fatet. Q) Et ​​embryo på innsiden av røret plugges. R) Den endelige prøvepreparering i en metallholder. klikk her se større bilde.
   
   1. Bruk et barberblad for å kutte røret av kanylen (Figur 2o).
   2. Sakte feste enden av røret som inneholder fisken gjennom hele lag med 1,5% agarose i plast fatet for å plugge røret (figur 2P) Note 1:. Unngå dannelsen av bobler og prøve å oppnå en rett pluggflate ved å holde . tube nøyaktig vinkelrett på agarose overflaten Merknad 2: Roter røret litt for å få en fin plugg.
   3. Hold montert prøven i et 1,5 ml reaksjonsrøret med E3 for å unngå tørking. Prøven er now klar til å bli avbildet. Før bildebehandling, sjekk om fisken sitter rett på toppen av pluggen (Tall 2Q og 2R). Sørge for å også legge Tricaine til mediet inne i avbildningskammeret ved samme konsentrasjon som i monteringsmedium.

Representative Results

Multiday Imaging av sebrafisk vasculature Development

Vi bruker en dpf Tg (kdrl: GFP) ¹³ sebrafisk for å demonstrere fordelene med flerlags monterings strategi for langsiktig lys sheet mikroskopi. Det tas sikte på å avbilde utviklingen av blodkar i hele sebrafisk over en periode på 2 dager. Den sebrafisk embryo ble montert i 0,1% agarose i en metylcellulose belagte polymerrøret. Her er sebrafisk ikke er begrenset av monteringsmedium og kan utvikle seg normalt. Dens hode hever, halen strekker og vaskulær spirende vises uhindret (figur 3).

Figur 3. Multiday avbildning av sebrafisk blodkar utvikling. Blodkar i en mulyer montert en dpf Tg (kdrl: GFP) ¹³ sebrafisk utvikler uhindret i en lys ark mikroskop i løpet av to dager. En 488 nm laserlys ark begeistret fluorescens og signalet ble oppdaget ved hjelp av 10X/0.3 W objektiv og en EMCCD kamera. Z-stabler ble kjøpt på fire tilstøtende posisjoner hvert 10 min og deretter sydd med Fiji ^15. Maksimal intensitet projeksjoner av en undergruppe av tidspunkter vises. Målestokk:. 500 mikrometer Klikk her for å se større bilde.

Imaging av Early sebrafisk embryogenese

Her viser vi evnen til FEP rør som monteringsstøtte for lys ark mikroskopi av tidlig sebrafisk embryogenese under den første dagen etter befruktning. Den 8 HPF Tg (H2A: GFP) ¹⁴ sebrafisk embryo ble montert med sin intakt chorion inne en E3-fylt røret med en inner diameter på 1 mm. Dette resulterer i en svak klemming av chorion. Alle utviklingsprosesser under embryogenesis er upåvirket av montering, og kan være optimalt visualisert ved hjelp av lys ark mikroskopi. I dette eksempelet har vi fotografert prøven over en periode på 12 timer (figur 4). Typiske formendringer i tidlig embryogenese, slik som økende forlengelse av eggeplomme og fortykkelse av vev langs midtlinjen, vil bli undertrykt ved bruk av tradisjonell montering uten chorion i 1,5% agarose.

. Figur 4 Imaging av tidlig sebrafisk embryogenese En Tg (H2A: GFP). ¹⁴ sebrafisk passerer gjennom tidlig embryogenesis. En 488 nm laserlys ark spent GFP og fluorescens signalet ble oppdagetmed en 10X/0.3 W objektiv og en EMCCD kamera. Z-stabler fra to vinkler ble kjøpt hver 3 min over en periode på 12 timer. Normalisert maksimal intensitet projeksjoner av en undergruppe av time-lapse vises. Synlig motion blur på 19 HPF resultater fra embryo rykninger under oppkjøpet, som ingen bedøvelse ble brukt. Målestokk:. 150 mikrometer Klikk her for å se større bilde.

Discussion

Avanserte mikroskopi teknikker som lys ark mikros gjør oss i stand til å ta opp bildedata med høy tidsmessig og romlig oppløsning i løpet av flere dager, men krever også prøvemonterings teknikker for å forbedre. Vi presenterer en detaljert protokoll for flerlags montering for lys ark mikroskopi av sebrafisk utvikling. Metoden er enkel å implementere og vi bruker den i vår lab på en daglig basis.

FEP-rør

Viktige deler av vår monterings strategi er rør laget av polymer Fluor Ethylene Propylene (FEP). Vi besluttet å bruke FEP hovedsakelig på grunn av dets brytningsindeks på 1,338, som er lik for vann og derfor velegnede for lys mikros arket med vann for-å dyppe mål og prøven som krever vandige medier. De rør med 0,8 mm indre diameter og 0,4 mm veggtykkelse at den passer til å utvikle sebrafisk meget godt, kan brukes sammen med typiske eksempler på holdere som passer for 1,6 mmkapillærer og er vårt førstevalg for den presenterte monteringsmetode. Vi testet dem grundig i våre hjemmebygde oppsett så vel som i det kommersielle systemet "Lightsheet Z.1" av Carl Zeiss Mikros og fant at FEP rør tilby langsiktig stabilitet, har bare minimal innvirkning på optisk ytelse og er nonfluorescent ^10. De er imidlertid ikke egnet for anvendelser med prøver som krever en annen brytningsindeks, f. eks erte prøven.

Rør samt folier laget av FEP er tilgjengelige i et utvalg av diametre og tykkelser. I tillegg kan FEP bli smeltet ved 260 ° C og gir dermed nesten uendelige muligheter for skreddersydde sample monterings støtter. De polymer rør tendens til å bli levert steril, noe som er grunnen til rengjøring protokollen inneholder flere tiltak for å sikre beste optiske kvaliteten. Belegget med methylcellulose sikrer at ingen del av den voksende sebrafisk embryo fester seg til polymeren.

Avgjørelsen for 0,1% agarose er basert på omfattende tester av vekst og immobilitet i ulike konsentrasjoner av agarose og metylcellulose ^10. Agarose konsentrasjoner over 0,1% allerede viste en alvorlig innvirkning på vekst på 24 HPF sebrafisk. I tillegg bruker vi lave doser av bedøvelse narkotika Tricaine. Tricaine blokker aksjonspotensialer, hemmer dermed signaloverføringen mellom hjernen og musklene og undertrykker muskelsammentrekninger ^16. En konsentrasjon av 133-200 mg / L sikrer tilstrekkelig immobilisering av sebrafisk mellom 24-72 HPF. Men Tricaine og andre bedøvelse narkotika vi testet showet doseavhengig bivirkninger som hjerteødem. I tillegg har den nødvendige dose av Tricaine varierer med utviklingsstadiet av embryoet. Vi anbefaler derfor å redusere Tricaine konsentrasjon til det beløpet som trengs for utviklingsstadier som er fotografert. For å sikre best mulig performance og hindre dannelsen av giftige biprodukter, bør nylaget eller tinet Tricaine stamløsning anvendes, beskyttet mot lys, og ikke oppvarmet over 30 ° C.

Den innebygging i FEP-rør gir også mulighet for enkel modifisering av monteringsmedium å ta hensyn til spesielle behov. For time-lapse avbildning av hjertet, anbefaler vi å bruke 3% methylcellulose og 100 mg / L Tricaine i stedet for 0,1% agarose og 200 mg / L for montering. Metylcellulose er mer viskøs enn 0,1% agarose og dermed gi høyere ubevegelighet av seg selv og mindre Tricaine må brukes for å sikre innesperring av embryoet.

Tricaine er følsomt for temperaturer over 30 ° C, og kan også være fortynnet med mediet i avbildningskammeret, noe som fører til redusert ytelse og mulig rykning av embryoet. Derfor, sørg for å bruke Tricaine også i bilde medium der den montert prøven er nedsenket. Hvis eksperimentene krever bruk av høyeretemperaturer, anbefales det å bytte ut medium i avbildningskammeret enten kontinuerlig ved hjelp av en perfusjon system eller manuelt med et rør, og en sprøyte mellom to tids-punkter.

Kritiske trinn

De kritiske trinn under prosessen med prøven festet er inntaket av prøven inn i røret, og innsetting av den agarose pluggen. Inntaket definerer utgangsstilling av embryo, noe som er tungvint å bytte etterpå. Flere prøver skal være tilgjengelig for å montere og bør overvåkes monterings kvalitet med en stereomikroskop. Hvis prøven orientering er ikke tilfredsstillende, kan endre hastigheten på å utarbeide prøven og unngå senere bevegelser av stempelet hjelpe da dette ofte vrir embryoet. Den 1,5% agarose pluggen er nødvendig for å unngå lekkasje av 0,1% agarose. Overflaten av pluggen inne i røret må være flat for å ikke påvirke prøven orientering under utvikling. For å oppnå en god surfess, forskjellige tykkelser av de agarose lag må bli testet, og røret må bli satt inn i agarose normal til overflaten. Roterende røret litt og trekke ut røret utgivelser nøye pluggen fra fatet. Kvaliteten på montering bør kontrolleres med et stereomikroskop før avbildning.

Multiview bildebehandling

En stor fordel med lys ark mikroskopi er Multi bildebehandling, evnen til å rotere prøven, erverve z-stabler fra flere vinkler, og deretter registrere seg og smelte dem. En etablert metode for å registrere z-stabler i 3D-rom er perle-basert registrering ved hjelp av fluoriserende perler rundt prøven som tillits markører ^17. Denne metoden er avhengig men på en solid monteringsmedium for eksempel 1,5% agarose og dermed synes å være uforenlig med flerlags montering presenteres her. Men flere alternative løsninger fungerer, avhengig av programmet. Først, de fluoriserende perler kanskal innlemmes i agarose plugg, som må være i synsfeltet under overtakelsen. For det andre kan de sceneplassering kalibreres før den faktiske eksperimenter ved hjelp av en 1,5% agarose kolonne med fluoriserende perler. For det tredje, kan alternative markører slik som fluorescerende kjerner brukes til å identifisere posisjonen til z-stablene i forhold til hverandre.

Fordampning

Typiske lett ark mikros oppsett bruke en åpen prøvekammeret, som uunngåelig fører til fordampning av mediet. Siden mediet er viktig for overlevelsen av prøven, for å begrense fordamping av monteringsmedium og for den korrekte brytningsindeks mellom optikk og prøven, anbefales det å utføre et eller flere av de følgende tiltak for å hindre fordampning. For det første kan mediet i kammeret bli kontinuerlig utvekslet med en perfusjons-system. For det andre, kan mediet være manuelt etterfylt. For det tredje, kan kammeret være dekket med et lokk eller en fleksibel folie.

Polymeren FEP ble utviklet for å tåle et stort utvalg av kjemikalier og er derfor robust, er kjemisk inert og nonpermeable til gass. I tilfelle av flerlagsmonterings oksygen kan bare trenge gjennom agarose pluggen og agarose-luft-grenseflaten, men det gjenstår å bli vist hvis oksygentilførselen i flerlags montering er sterkt lavere i forhold til montering i 1,5% agarose, uten støtte polymerrøret. Men som montering i 1,5% agarose kan bare brukes i omtrent to timer før sebrafisk morfologi påvirkes flerlags montering synes å være den samlede overlegen løsning for langvarig avbildning.

Imaging tidligere utviklingsstadier

Multilayer montering har nå blitt vår standard embedding teknikk for time-lapse lys ark mikroskopi av sebrafisk eldre enn 24 HPF. Bortsett fra det, vi også bruke polymer rør for avbildning av tidligere stadium embryoer. Det embryos forbli i sine chorions og er montert i en FEP-rør med en indre diameter på 1 mm og fylt med E3. Sebrafisk kan fritt utvikle inne i chorion og kan fortsatt bli fotografert godt med lys ark mikroskopi.

Outlook

Den presenterte flerlags prøvemontering slipper løs det fulle potensialet av lys ark mikroskopi for sanntidsutviklingsbiologi med sebrafisk. Det kan lett bli vedtatt for andre mikroskopi teknikker som optisk projeksjon tomografi (OPT) og andre organismer. Vi tror at standard-sized FEP-rør er bare de første skritt mot prøvemonterings teknikker skreddersydd for spesifikke behov.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes	Bola	S 1815-04	0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe	B. Braun Melsungen AG	9161406 V
Sterican Single-Use Cannula, blunt	B. Braun Melsungen AG	9180109	0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube	Corning	430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH
70% EtOH
Methylcellulose	Sigma	M0387	supplied as powder
E3 medium (for zebrafish embryos)
1.5 ml Reaction Tube	Eppendorf	3810X
Agarose, low gelling temperature	Sigma	A9414	supplied as powder
Petri Dish	Greiner	633180	plastic, 94 mm x 16 mm
Tricaine	Sigma	E10521	synonyms:  Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate
10X/0.3 W Microscope Objective Lens	Leica	HCX APO L
EMCCD Camera	Andor Technology	iXon 885 EMCCD