Multilayer Montering för Långsiktigt Ljus ark Mikroskopi av Zebrafish

Summary

Utvecklingen av zebrafisk kan följas över dagar med ljus ark mikroskopi när embryona är inbäddade i optiskt klara polymerrören med låg koncentration agaros.

Abstract

Ljus ark mikroskopi är den perfekta bildteknik för att studera zebrafisk embryonal utveckling. På grund av minimal fototoxicitet och blekning, är det särskilt lämpad för långsiktiga tidsförlopp avbildning under flera timmar upp till flera dagar. Det krävs dock en lämplig provmontering strategi som erbjuder både instängdhet och normal utveckling av provet. Multilayer montering, en ny inbäddning teknik med hjälp av låg koncentration agaros i optiskt klara rör, övervinner nu denna begränsning och släpper loss den fulla potentialen av ljus plåt mikroskopi för realtidsutvecklingsbiologi.

Introduction

För att förstå de komplexa händelser och interaktioner under embryogenes är forskning inom utvecklingsbiologi mer och mer flyttar från mikroskopi av enskilda celler och organ för in vivo avbildning av hela organismer. Traditionella mikroskopitekniker misslyckas oftast att erbjuda tidsmässiga och geografiska följa snabba händelser under en lång tid och ofta orsakar blekning eller fototoxiska effekter i prov ^1. Vi och andra fann ljus ark mikroskop (figur 1) för att vara den perfekta tekniken för in vivo avbildning av zebrafisk ^2-4. Den belysning av provet med ett tunt ark av laserljus, som är vinkelrät mot detekteringsaxeln, erbjuder snabb optisk sektionering med hög rumslig upplösning samt minimerad fototoxicitet ^5. Samtidigt, på grund av denna unika optiska arrangemang, traditionell provmonteringsteknik som använder petriskålar eller odlingskammare är inte lämpliga. I en typisk ljusark mikroskop tre translation motorer och en rotationsmotor håller provet, så att den kan vara exakt placerad, vände och sedd från alla håll. Under de senaste proverna för ljus plåt mikroskopi har ofta inbäddade i 1-2% agaros i en glaskapillär ^6,7. I detta fall är den stelnade agarosen cylinder med de inbäddade provet strängsprutas ut ur glaset kapillären in i provkammaren fylld med vattenliknande medium för avbildning. Agaros har ett brytningsindex nära vatten och är därför perfekt för in vivo lätt blad mikroskopi som underlättar vatten korrigerade belysning-och detekteringsoptiken. Provet läggs in i den styva agaros och kan avbildas väl under en kort tidsperiod, men morfogenetiska förändringar och tillväxt av embryot är starkt nedsatt vid avbildande av flera timmar ^7,8. Även lösningar för andra tillämpningar har utvecklats ^9, den icke-invasiv långsiktiga tidsförlopp zebrafisk avbildning potential ljus ark mikroskopi inte kan utnyttjas med användning av konventionell 1,5% agaros inbäddning.

Vi utvecklade därför en ny monterings strategi för in vivo lätt ark mikroskopi av zebrafisk embryon ^10. Provet monteras i 0,1% agaros med 200 mg / L Tricaine inuti ett rör tillverkat av optiskt klar polymer, fluorerad etylenpropylen (FEP). Den inbäddade embryot utvecklas normalt på grund av låg viskositet hos mediet. Samtidigt, begränsar FEP röret mediet och provet under hela experimentet. Här ger vi ett detaljerat protokoll av den nya monteringsteknik och presentera data som återspeglar dess fördelar jämfört med konventionella protokoll. Vi visar att med vår metod zebrafisk utveckling kan kontinuerligt avbildas med hög rumslig och tidsmässig upplösning under en period på mer än två dagar.

5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
Figur 1. Principen för ljus ark mikroskopi. Ett zebrafisk monterad i ett rör gjort av fluorerad etylenpropylen (FEP) kan translateras och roteras genom fokalplanet hos detekteringsmålet. Ett tunt laserljus (ljus ark) beräknas av belysningsmålet i fokalplan detekteringsmålet och lyser bara en tunn optisk del av provet. Den emitterade fluorescenssignalen uppsamlas genom detekteringsmålet och registrerades på en kamerachip.

Protocol

1. Material Preparation

1. Beredning av FEP-rör
   1. Rengör FEP rör (Figur 2A) genom att spola vätskor (i de steg som anges nedan) genom röret och med hjälp av en spruta fäst med en trubbig ände kanyl (Figur 2B) Not 1:.. Använd handskar under hela proceduren Anm 2: Vi rekommenderar skära röret i bitar av ca. 1 meter och rengöring dem parallellt.
      1. Spola först röret med 1 M NaOH upprepade gånger. Därefter överförs röret till ett 50 ml centrifugrör fyllda med 0,5 M NaOH och ultrasonicate den för 10 min.
      2. Överför polymerröret till en liten bassäng med DDH ₂ O. Spola sonden först med DDH ₂ O och sedan med 70% EtOH.
      3. Därefter överför FEP röret till en färsk centrifugrör med 70% EtOH. Igen ultrasonicate denna centrifugrör under 10 min.
   2. Skär den rengjorda FEP röret i bitarpå ca 3 cm (en typisk längd för användning i zebrafisk montering och bildbehandling) och räta ut dem om det behövs. Förvara de rengjorda FEP-rör, i en färsk 50 ml centrifugrör fyllda med DDH ₂ O (figur 2C).
2. Framställning av Tricaine stamlösning
   1. Bered 0,4% Tricaine förrådslösning genom att lösa 400 mg Tricaine (MS-222) i 97,9 ml DDH ₂ O. När pulvret är fullständigt upplöst, justera pH till 7,0 med användning av 2,1 ml 1 M Tris (pH 9,0). Skydda lösningen från ljus. Förvara alikvoter vid -20 ° C.
3. Framställning av 3% metylcellulosa
   1. Bered 3% metylcellulosa-lösning för den inre beläggningen av FEP-rör såsom beskrives nedan. Värm upp E3 ¹¹ i en glasflaska till ca 60-70 ° C och tillsätt lämplig mängd metylcellulosa pulver. Lägg till en omrörningsstav och rör om vid 4 ° C. Så snart som lösningen kyls ner till under 30 ° C, tillsätt Tricaine lösning till en slutlig concentration av 100 mg / L. Håll under omröring vid 4 ° C över natten.
4. Beredning av 1,5% och 0,1% agaros i E3
   1. Lös upp den lämpliga mängden av lågsmältande agaros pulver i en definierad volym av E3 i en glaskolv. Värm upp blandningen i en mikrovågsugn och skaka den då och då, tills agaroslösningen förefaller homogen, utan några kvarvarande kristaller.
   2. Bered en ml alikvoter av 0,1% agaros-lösning i 1,5 ml reaktionsrör. Alikvoterna kan lagras vid 4 ° C.
   3. Använd 1,5% lösning för att belägga en plastpetriskål. Tjockleken på agaros skiktet bör vara ca. 2 mm. Efter att agarosen stelnat, till E3 medium på toppen av skiktet för att förhindra den från att torka. Den belagda skålen kan lagras vid 4 ° C.
5. Framställning av zebrafisk
   1. Håll Zebrafisk (Danio rerio) vuxna och embryon vid 28,5 ° C och hantera dem i enlighet med de fastställda protokoll ^11,12.
   2. Inrätta manliga och kvinnliga fisk på eftermiddagen och separera dem med en avdelare. Ta bort avdelaren följande morgon och då parningen av fisken.
   3. Samla embryona i en skål fylld med E3 och undersöka dem med hjälp av ett stereomikroskop.
   4. Vid 24 HPF (eller utvecklingsstadiet av ditt intresse), väljer zebrafisk embryot för fluorescens uttryck och överföra de positiva till en ny skål med färska E3.
   5. Försiktigt dechorionate embryon med två vassa pincett (figur 2D och 2E). Använd de första pincett för att ta tag i och hålla chorion och den andra pincett för att riva upp den och dra bort 1:. Utför detta steg med hjälp av ett stereomikroskop.

2. Flerskikts Monterings

1. Beläggning av FEP röret
   1. Fäst en trubbig ände kanyl till en injektionsspruta. Sätt kanylen försiktigt under ca 3 mm in i ena änden av en rengjord och skuren bit av. FEP rör (figur 2F och 2G) Not 1: Använd handskar och undvika böjning eller klämning av röret.
   2. Doppa den fria änden av FEP röret i 3% metylcellulosa och fylla röret med lösningen.
   3. Släpp långsamt metylcellulosa genom att trycka på sprutan. Kassera lösningen.
   4. Upprepa steg 2.1.2 och 2.1.3 med hjälp av E3 Anmärkning 1:. De belagda rören måste användas för direkt montering.
2. Överföra zebrafisk till agarosen
   1. Värm upp en alikvot av 0,1% agaros till 70 ° C i ett värmeblock. Vortex reaktionsröret kort och överföra den till en värmeblock satt till 38 ° C (figur 2H).
   2. Ta reaktionsröret ut från värmeblocket och låt den svalna en kort stund. Lägg Tricaine till en slutlig koncentration av 133 till 200 mg / l och vortexa igen (fig 2i).
   3. Välj ett av de dechorionated zebrafisk embryon och transfe. r det till reaktionsröret med den förvärmda 0,1% agaros med hjälp av ett glas Pasteur pipett (figur 2J och 2K) 1: Försök att överföra så lite extra E3 som möjligt.
3. Montering av zebrafisk
   1. Ta upp embryot med sprutan ansluten FEP rör (figur 2L). . Röret ska fyllas helt med 0,1% agaros, med embryot placeras nära vardera änden av röret och med huvudet pekar mot öppningen av röret Not 1: Se till att ta upp några agaros innan upp fisken. Not 2: Dra mycket försiktigt på sprutan för att undvika bubblor 3:. Förvara slangen i ett horisontellt läge för att förhindra läckage av dess innehåll (Siffror 2M och 2N).
4. Ansluta tuben
   
   Figur 2. Multilayer montering av zebrafisk embryon. A) fluorerad etylen (FEP) rör på en kabeltrumma före tillagningen. B) en spruta med en trubbig ände kanyl fäst. C) En rengjord och skär FEP röret. D, E) Dechorionation av 24 HPF zebrafiskembryon. F) Fastsättning av röret till den trubbiga änden kanylen. G) Sprutan med kanylen och röret fastsatt. H) En alikvot av 0,1% agaros i ett reaktionsrör under överföring av det till ett värmeblock. I) Vortexblandning av smält agaros. J) Upptag av en dechorionated embryo med hjälp av ett glas pipett. K) Överlåtelse av embryot i den smälta agaros. L) Intag av embryot med närliggande agaros i FEP röret. M, N) Den zebrafisk embryot inne i FEP röret . P) Ansluta röret med hjälp av en agaros-belagda maträtt. Q) Embryot inuti ansluten röret. R) Den slutliga provberedning i en metallhållare. Klicka här för att visa en större bild.
   
   1. Använda ett rakblad för att skära tuben av kanylen (Figur 2O).
   2. Sakta stick i slutet av röret med fisken genom hela lagret av 1,5% agaros i plastskål att plugga röret (figur 2P) Anmärkning 1:. Undvik bildning av bubblor och försöka få en rak kontakt yta genom att hålla . tub exakt vinkelrätt mot agaros ytan 2: Vrid röret något för att få en fin kontakt.
   3. Håll monterade provet i en 1,5 ml reaktionsröret med E3 för att undvika uttorkning. Provet är now redo som skall avbildas. Innan avbildning, kontrollera att fisken sitter ovanpå kontakten (figur 2Q och 2R). Se till att också lägga Tricaine till mediet inuti avbildningskammaren vid samma koncentration som i monteringsmedium.

Representative Results

Multiday avbildning av Zebrafish kärl utveckling

Vi använder 1 dpf Tg (kdrl: GFP) ¹³ zebrafisk för att demonstrera fördelarna med flerskiktade monterings strategi för långsiktig ljus ark mikroskop. Syftet är att bilden utvecklingen av kärlsystemet i hela zebrafisk under loppet av 2 dagar. Den zebrafisk embryot monterades i 0,1% agaros i en metylcellulosa belagd polymerröret. Här är den zebrafisk som inte begränsas av monteringsmedium och kan utvecklas normalt. Dess huvud höjer, svansen förlänger och kärl groning visas obehindrat (Figur 3).

Figur 3. Multiday avbildning av zebrafisk kärlutvecklingen. Vaskulaturen hos en multilateralayer monterad 1 dpf Tg (kdrl: GFP) ¹³ zebrafisk utvecklas obehindrat i en ljus ark mikroskop under loppet av två dagar. En 488 nm laserljus arket exciteras fluorescensen och signalen detekterades med användning 10X/0.3 W objektiv och en EMCCD kamera. Z-stackar förvärvades på fyra intilliggande positioner var 10 min och därefter sys med Fiji ^15. Maximal intensitet projektioner av en delmängd av tidspunkter visas. Skala bar:. 500 ^ Klicka här för att visa en större bild.

Imaging av tidig Zebrafish Embryogenesis

Här visar vi kapaciteten av FEP-rör som monteringsstöd för lätt ark mikroskopi av tidig zebrafisk embryogenes under den första dagen efter befruktningen. Den 8 HPF Tg (H2A: GFP) ¹⁴ zebrafisk embryo monterades med sin intakta chorion inuti en E3 fyllt rör med en inner diameter av 1 mm. Det resulterar i en lätt fastspänning av chorion. Alla utvecklingsprocesser under embryogenes är opåverkade av montering och kan optimalt visualiseras med hjälp av ljus plåt mikroskop. I detta exempel avbildas vi preparatet under en loppet av 12 h (fig 4). Typiska formförändringar under tidig embryogenes, såsom ökande töjning av gulan och förtjockning av vävnaden längs mittlinjen, skulle vara förtryckta vid användning av traditionell montering utan chorion i 1,5% agaros.

. Figur 4 Imaging av tidig zebrafisk embryogenes A Tg (H2A: GFP). ¹⁴ zebrafisk passerar genom tidig embryogenes. En 488 nm laserljus blad glada GFP och fluorescenssignalen detekteradesmed en 10X/0.3 W objektiv och en EMCCD kamera. Z-stackar från två vinklar förvärvades var 3 min under en kurs på 12 timmar. Normaliserade maximal intensitet projektioner av en delmängd av tidsförlopp visas. Synligt rörelseoskärpa vid 19 HPF resultat från embryot ryckningar under förvärv, eftersom ingen bedövning användes. Skala bar:. 150 um Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Avancerad mikroskopi tekniker såsom ljusmikroskop ark möjligt för oss att spela in bilddata med hög temporal och spatial upplösning under loppet av flera dagar, men kräver också provmonteringsteknik för att förbättra. Vi presenterar ett detaljerat protokoll av flerskiktsmontering för ljus plåt mikroskopi av zebrafisk utveckling. Metoden är enkel att implementera och vi använder den i vårt laboratorium på en daglig basis.

FEP-rör

Viktiga komponenter i vår monteringsstrategi är rör tillverkade av polymeren fluorerade Etylenpropylen (FEP). Vi beslutade att använda FEP främst på grund av dess brytningsindex av 1,338, vilket liknar vatten och därför idealiskt lämpad för ljus ark mikroskopi med vattendopp mål och prov som kräver vattenhaltiga medier. Rören med 0,8 mm innerdiameter och 0,4 mm väggtjocklek passa framkallningszebrafisk mycket väl kan användas med typiska provhållare lämpade för 1,6 mmkapillärer och är vårt första val för den presenterade monteringsmetoden. Vi testade dem grundligt på våra hemmabyggda uppställningar och i det kommersiella systemet "Lightsheet Z.1" av Carl Zeiss Mikroskopi och fann att FEP-rör ger långsiktig stabilitet, har endast minimal påverkan på optiska prestanda och är icke-fluorescerande ^10. De är dock inte lämpad för applikationer med prover som kräver ett annat brytningsindex, t ex rensas exemplar.

Rör samt folier gjorda av FEP finns i en mängd olika diametrar och tjocklekar. Dessutom kan FEP smältas vid 260 ° C och därmed ger nästan oändliga möjligheter för skräddarsydda provmonteringsstöd. Polymer rören tenderar att levereras osterila, varför rengöringsprotokoll innehåller flera åtgärder för att säkerställa bästa optiska kvalitet. Beläggningen med metylcellulosa ser till att ingen del av den växande zebrafisk embryot fastnar på polymeren.

Beslutet för 0,1% agaros är baserad på omfattande tester av tillväxt och orörlighet i olika koncentrationer av agaros och metylcellulosa ^10. Agaros koncentrationer över 0,1% redan visade en allvarlig inverkan på tillväxten i 24 HPF zebrafisk. Dessutom använder vi låga doser av anesthetizing drog Tricaine. Tricaine blockerar aktionspotentialer, hämmar därigenom signalöverföringen mellan hjärna och muskler och dämpar muskelsammandragningar ^16. En koncentration på 133-200 mg / L säkerställer tillräcklig immobilisering av zebrafisk mellan 24-72 HPF. Men Tricaine och andra anesthetizing droger vi testade show dosberoende biverkningar såsom hjärtödem. Dessutom har den erforderliga dosen av Tricaine varierar med utvecklingsstadiet för embryot. Vi rekommenderar därför att minska Tricaine koncentrationen till den mängd som behövs för de utvecklingsstadier som avbildas. För att säkerställa bästa performance och förhindra bildandet av giftiga biprodukter, bör nygjord eller tinad Tricaine stamlösning användas, skyddas från ljus och inte upphettning över 30 ° C.

Den inbäddning i FEP-rör möjliggör också enkel modifiering av monteringsmedel att ta hänsyn till specifika behov. För tidsförlopp avbildning av hjärtat, rekommenderar vi användning av 3% metylcellulosa och 100 mg / L Tricaine i stället för 0,1% agaros och 200 mg / l för montering. Metylcellulosa är mer trögflytande än 0,1% agaros vilket ger högre orörlighet på egen hand och mindre Tricaine måste användas för att säkerställa inneslutning av embryot.

Tricaine är känsligt för temperaturer över 30 ° C och kan också spädas genom mediet i avbildningskammaren, vilket leder till försämrad prestanda och möjlig ryckningar av embryot. Se därför till att använda Tricaine även i bildmediet i vilket det monterade provet är nedsänkt. Om dina experiment kräver användning av högretemperaturer, rekommenderar vi utbyta mediet i avbildning kammare antingen konstant med hjälp av en perfusion system eller manuellt med en slang och en spruta mellan två tidpunkter.

Kritiska steg

De kritiska steg under processen för prov montering är intaget av provet i röret och införing av agaros pluggen. Intaget definierar den initiala positionen av embryot, som är besvärligt att ändra efteråt. Flera exemplar ska finnas tillgängliga för att montera och monteringskvaliteten bör övervakas med ett stereomikroskop. Om provet orientering inte är tillfredsställande, kan ändra hastigheten för utarbetandet av provet och man slipper rörelser kolven hjälp eftersom det ofta vrider embryot. Den 1,5% agaros kontakten är nödvändig för att undvika läckage av 0,1% agaros. Ytan av pluggen inuti röret bör vara platt för att inte påverka provets orientering under utvecklingen. För att uppnå en bra surfess, olika tjocklekar av agarosen lagren måste testas och röret behöver sättas in i agaros normal till ytan. Rotera röret lite och dra ut slangen släpper försiktigt ut kontakten ur skålen. Bör kontrolleras kvaliteten på monteringen med ett stereomikroskop före avbildning.

Multi avbildning

En stor fördel med ljus plåt mikroskopi är multiview avbildning, förmågan att rotera provet, förvärva z-stackar från flera vinklar och därefter registrera sig och smälta dem. En etablerad metod för att registrera z-stackar i 3D-rymden är bead-baserade registreringen med hjälp av fluorescerande pärlor som omger provet som förvaltnings markörer ^17. Denna metod förlitar sig dock på ett fast monteringsmedium såsom 1,5% agaros och verkar därför vara oförenligt med den flerskiktade montering presenteras här. Men flera alternativa lösningar fungerar beroende på applikation. Först de fluorescerande pärlorna kaninförlivas i agaros pluggen, som måste vara i synfältet under förvärvet. För det andra kan de scenens position kalibreras före den verkliga försök med användning av en 1,5% agaros-kolonnen med fluorescerande pärlor. För det tredje kan alternativa markörer såsom fluorescerande kärnor användas för att identifiera positionen av z-stackar i förhållande till varandra.

Indunstning

Typiska ljus ark mikroskopi inställningar använder en öppen provkammaren, som oundvikligen leder till avdunstning av mediet. Eftersom mediet är väsentligt för överlevnaden av provet, för att begränsa avdunstning av monteringsmedium och för rätt brytningsindex mellan optik och provet rekommenderar vi att ta en eller flera av följande åtgärder för att förhindra avdunstning. För det första kan det medium i kammaren kontinuerligt utbytas genom en perfusions-system. För det andra, kan mediumet manuellt återfyllas. För det tredje, kan kammaren vara täckt med ett lock eller en flexibel folie.

Polymeren FEP har utvecklats för att klara en stor variation av kemikalier och är därför robust, kemiskt inert och icke permeabel för gas. I fallet med flerskiktsmontering syre kan bara tränga igenom agarosplugg och agaros-luftgränssnittet, men det återstår att visa om syreförsörjningen i flera lager montering är kraftigt lägre jämfört med montering i 1,5% agaros utan att stödja polymerröret. Men eftersom montering i 1,5% agaros kan användas endast under omkring två timmar före den zebrafisk morfologi påverkas flerskikts montering verkar vara den övergripande överlägsen lösning för långvarig avbildning.

Imaging tidigare utvecklingsstadier

Multilayer montering har nu blivit vår standard inbäddning teknik för time-lapse ljus ark mikroskopi av zebrafisk äldre än 24 HPF. Förutom det använder vi också polymerrören för avbildning av tidigare embryon scen. I embryos kvar i sina chorions och är monterade i en FEP-rör med en innerdiameter på 1 mm och fylld med E3. Den zebrafisk kan fritt utvecklas inuti chorion och kan fortfarande avbildas väl med hjälp av ljus plåt mikroskop.

Outlook

Den presenterade skiktade provmontering släpper loss den fulla potentialen av ljus plåt mikroskopi för realtidsutvecklingsbiologi med zebrafisk. Den kan lätt anpassas till andra mikroskopi tekniker såsom optisk projektionstomografi (OPT) och andra organismer. Vi tror att de normalstora FEP-rör är bara de första stegen mot provmonteringstekniker anpassade för specifika behov.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes	Bola	S 1815-04	0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe	B. Braun Melsungen AG	9161406 V
Sterican Single-Use Cannula, blunt	B. Braun Melsungen AG	9180109	0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube	Corning	430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH
70% EtOH
Methylcellulose	Sigma	M0387	supplied as powder
E3 medium (for zebrafish embryos)
1.5 ml Reaction Tube	Eppendorf	3810X
Agarose, low gelling temperature	Sigma	A9414	supplied as powder
Petri Dish	Greiner	633180	plastic, 94 mm x 16 mm
Tricaine	Sigma	E10521	synonyms:  Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate
10X/0.3 W Microscope Objective Lens	Leica	HCX APO L
EMCCD Camera	Andor Technology	iXon 885 EMCCD