Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

doi: 10.3791/51135 Published: April 9, 2014
* These authors contributed equally

Summary

ويتحقق عالية الدقة حيوي داخلي التصوير مع تعزيز النقيض تصل إلى 120 ميكرومتر في عمق الغدد الليمفاوية من الفئران الكبار عن طريق تحوير مكانيا نمط الإثارة من متعدد التنسيق المجهر ثنائي الفوتون. في عمق 100 ميكرون قمنا بقياس قرارات من 487 نانومتر (الأفقي) و 551 نانومتر (المحوري)، وبالتالي الالتفاف على تشتت وحيود حدود.

Abstract

رصد الاتصالات الخلوية من قبل حيوي داخلي الأنسجة العميقة متعددة الفوتون المجهري هو المفتاح لفهم مصير الخلايا المناعية داخل عينات من الأنسجة سميكة والأجهزة في الصحة والمرض. من خلال التحكم في نمط المسح في متعدد الفوتون المجهري وتطبيق الخوارزميات العددية المناسبة، قمنا بتطوير نهج مخطط في الإضاءة، والتي مكنتنا من تحقيق 3 أضعاف أفضل قرار محوري وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، أي النقيض من ذلك، في أكثر من 100 عمق الأنسجة ميكرون داخل نثر غاية أنسجة الأجهزة اللمفاوية بالمقارنة مع معيار متعدد الفوتون المجهري. سرعة اكتساب وكذلك photobleaching من photodamage والآثار كانت مشابهة لتقنية تستند الصور مضاعف القياسية، في حين كان عمق التصوير أقل قليلا نظرا لاستخدام أجهزة الكشف الميداني. باستخدام نهج مخطط في الإضاءة، ونحن قادرون على مراقبة ديناميات الودائع مجمع المناعي على الخلايا الجذعية الجريبي الثانوية ̵1؛ على مستوى عدد قليل من جزيئات البروتين في مراكز جرثومي.

Introduction

ثنائي الفوتون الليزر المجهر (TPLSM)، مع مزاياها للتصوير الأنسجة العميقة المتصلة الأشعة تحت الحمراء فائقة قصيرة الإثارة نابض وقد رأينا ثورة على العمليات الحيوية على مستوى الخلية واحد من خلال الكشف عن الحركة والتفاعل أنماط مختلفة مجموعات فرعية الخلايا في الحيوانات التي تعيش 2-5. ومع ذلك، التكنولوجيا الحالية لا تزال غير كافية لتوضيح آليات وظيفة الجهاز وضعف كشرط أساسي لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة، لأنه يجعل سوى معلومات قليلة حول الأساس الجزيئي للاستجابة الخلوية داخل أنسجة في الصحة والمرض. التكنولوجيا الحالية تتيح سوى نافذة المكاني لبضع مئات من ميكرون بسبب تناثر وموجة آثار تشويه الجبهة على القرار المكانية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء والتي هي واضحة وخاصة في الأنسجة المدمجة للغاية من الحيوانات البالغة. هذه نثر وآثار موجة تشويه الجبهة هي نتيجة لوغير متجانسة للغايةتوزيع متباين الخواص د معامل الانكسار في الأنسجة، مما يؤدي في خطوة أولى إلى تدهور تعتمد عمق القرار المكانية 3D وأخيرا إلى فقدان تام للإشارة القادمة من الفوتونات الإثارة الباليستية، أي فقدان نسبة الإشارة إلى الضوضاء. من حيث bioscientific والطبية الحيوية التطبيقات الأنسجة العميقة، وهذا يعني أن التكنولوجيا الحالية غير قادرة على الكشف لا لبس فيه الاتصالات الخلوية بسبب ضعف القرار من شأنه أن يؤدي إلى تفاعلات إيجابية زورا حين أن انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء من شأنه أن يتسبب في النظام نغفل بعض التفاعلات بين الهياكل قاتمة.

من أجل الكشف عن التفاعلات الخلوية بشكل لا لبس فيه بطريقة ديناميكية، هناك حاجة إلى تحسين درجة عالية القرار المكانية عميقة داخل الأنسجة. تقنيات nanoscopy قوية أدخلت حاليا على أساس خوارزميات عددية خاصة، مثل النهج بنية الإضاءة، على استنفاد أول دولة متحمس، على سبيل المثال مثل dSTORM، النخيل، وقد وجدت العديد من التطبيقات في خلايا ثابتة وكذلك في مزارع الخلايا الحية 7. ومع ذلك، من أجل توسيع نطاق هذه التطبيقات إلى أقسام الأنسجة، والأنسجة الحية والكائنات الحية ما زلنا بحاجة للتغلب على الصعوبات التقنية الشديدة. اثنين من الفوتون الإثارة STED مع أطوال موجية مختلفة وكذلك مع طول موجة واحدة (sw2PE-STED) عن الإثارة وحفز تم تطبيق القرار لتحسين الانبعاثات الجانبية في شرائح الدماغ 8 أو في مصفوفات اصطناعية مع خلايا جزءا لا يتجزأ من على التوالي، في نفس القرار المحوري كما TPLSM القياسية. باستخدام فوتون واحد STED، يمكن تصوير ديناميات العمود الفقري شجيري على سطح القشرة الدماغية (تصل إلى 10-15 ميكرومتر العمق) في لقمة العيش Thy1 EGFP الماوس في قرار من 67 نانومتر 10. يتم توفير أداة مرنة للالبيولوجيا التطورية من متعدد البؤر المجهري منظم في الإضاءة، الذي يوفر تحسين شقين 2Dالقرار. ومع ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها فقط في الكائنات الحية مع الميل منخفضة من تشتت الضوء مثل أجنة سمك الزرد 11. لا يزال، فإن أيا من هذه التقنيات يمكن تطبيقها في الأنسجة نثر عالية من الحيوانات البالغة في عدة مئات من ميكرومتر، والتي هي نماذج حاسمة للبحوث الطبية الحيوية والسريرية للأمراض، مع ظهور بعد الولادة.

مستقلة عن التقريب المستخدمة لحساب موجة شكل الجبهة محدودة الحيود، أي وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية)، وبعد التركيز من خلال العدسة، والعرض من قوات الأمن الفلسطينية على طول المحور البصري (القرار المحوري) هو على الأقل ثلاث مرات أكبر من عرض PSF عمودي على المحور البصري (القرار الوحشي) 12. موجة التشوهات أمام أوامر مختلفة كميا بواسطة معامل Zernike في تعديل كبير على شكل موجة من الموجات الكهرومغناطيسية الجبهة تركيزا في مجال التصوير الأنسجة العميقة مما يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير PSFS، وخصوصا على طول البصريةمحور آل 13-15. وبالتالي، فإن القوانين حيود وآثار موجة التشويه أمامية على حد سواء تشير إلى قرار على طول المحور البصري كما العامل المحدد في التصوير الأنسجة العميقة. في حين أن التركيز على تقنيات nanoscopy مواجهة حدود الحيود فقط، هناك حاجة إلى التكنولوجيا مما يحسن القرار المحوري والتباين من خلال مواجهة كل من حيود والموجة الأمامية آثار التشويه عالية الدقة intravital التصوير. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هذا الأسلوب أيضا سريع بما يكفي للسماح رصد ديناميات الخلوية.

التصحيح في الوقت الحقيقي من الانحرافات قوات الأمن الفلسطينية وفقدان التباين باستخدام البصريات التكيفية في TPLSM وقد درس على نطاق واسع وتحسينها في العقد الماضي 13،14،16-18 وبالتالي فإنه هو أفضل الخيارات المتاحة حاليا مما يؤدي إلى إدارة أفضل للالإثارة الباليستية فوتونات الضوء 14. لا يزال، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن معظم موجة التصحيح الأمامي النهج المستخدمة في البصريات التكيفية هي تكرارية وأنهم هكتارلقد لتكرارها لمناطق صغيرة (10 × 10 بضعة ميكرومتر 2) نظرا لعدم تجانس عالية من معامل الانكسار في الأنسجة، وسرعة اكتساب هو أقل بكثير مما هو ضروري لحركية الخلية التصوير والاتصالات. وعلاوة على ذلك، وتحسين الحد المادية في البصريات التكيفية-TPLSM لا يزال يحدده حيود.

التشكيل المكاني للإضاءة (SPIN) والتشكيل الزماني على الجانب الكشف (SPADE) وقد اقترحت نظريا ليتم تطبيقها على الليزر المجهر لتحسين القرار. التطبيق العملي في intravital التصوير ما زال يتعين تظاهر 19.

أخذت معا، وهناك طلب كبير على تطوير التكنولوجيات، التي من شأنها تحسين القرار لتصوير الأنسجة العميقة في الحيوانات الحية الكبار. في هذا العمل، ونحن تحقيق التشكيل المكاني للنمط الإثارة عن طريق التحكم في عملية المسح متعددة الحزم في مخطط في الإضاءة متعدد الفوتون الليزر لياليتعليب المجهري (MB-SI-MPLSM) 20. خلافا للنهج منظم الإضاءة، حيث يتم التضمين قسم الإثارة شعاع عبر مكانيا، ونحن نستخدم فقط عملية المسح لتحقيق التشكيل المكاني للإثارة. من خلال توسيع الإثارة إلى الطول الموجي الأطول، ونحن قادرون على تحسين كل من القرار المكانية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في عمق الأنسجة من نثر للغاية الأنسجة (مثل العقدة الليمفاوية، نثر حرة مسار 47 ميكرومتر 6)، بصرف النظر عن بصري إشارة غير الخطية اكتشفنا، على سبيل المثال مضان، الجيل الثاني التوافقي أو تردد أخرى خلط الظاهرة. باستخدام هذا النهج في موجات الإثارة تصل إلى 900 نانومتر ونحن قادرون على حيوي صورة هياكل البروتين الخلوي على مقياس من جزيئات قليلة في مراكز جرثومي من الغدد الليمفاوية الماوس. وبالتالي، يمكننا تصور أفضل التفاعل بين وحدات المستضد تحمل على سطح الخلايا الجذعية الجريبي والخلايا B في عملية سبر المضادةجنرال خلال الاستجابة المناعية في الأجهزة اللمفاوية الثانوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الإعداد متعدد شعاع للمخطط في الإضاءة TPLSM

الإعداد المستخدمة هنا هي وكالة متخصصة متعددة الحزم اثنين من الفوتون ليزر المسح المجهر، كما هو موضح سابقا 6،20. ويتضح النظام في الشكل 1. يمكن تطبيق هذا النهج إلى غيرها من اثنين من الفوتون المجاهر الليزر المسح الضوئي، والتي هي قادرة على مزامنة اقتناء الكاميرا مع حركة المرايا galvoscanner، حتى لو كانت قادرة فقط على أداء واحد العارضة المسح الضوئي . في هذه الحالة، سوف يكون العيب سرعة أقل الاستحواذ، ولكن مماثلة لسرعة اكتساب القياسية في TPLSM مقرها PMT. من أجل تحقيق الجودة المثلى حتى الآن بوصفه القرار والتباين هي المعنية، وعند أدنى photobleaching من وphotodamage وأسرع الاستحواذ، ومن المفضل أن تنظر في الخطوات التالية من التكيف الإعداد:

  1. تحقق قوة الليزر ليزر تيزا: تحقق في 100٪، مقارنة مع القيم المصنع الأصلي وprevioتملك لنا قراءات واستخدامه كما هو إذا كان الطول الموجي الإثارة في نطاق 700-1،000 نانومتر هو ضروري.
  2. اختبار مؤشر التحكم عن بعد لتي: سا شعاع الخائن، أي تحقق 0٪ و 100٪ الإعدادات. إذا هناك المتبقية تيزا شعاع عند 100٪، ثم تحقق وإعادة الموقف فارغة محرك خطوة. وتي: يتكون شعاع سا الخائن من ذات الترتيب المنخفض λ / 2 لوحة والمستقطب، والذي يقسم أشعة الليزر الاستقطاب عموديا على مسارات شعاع عمودي: واحدة موجهة إلى مجهر لإثارة، ويستخدم الآخر لضخ حدودي البصرية مذبذب (OPO). من خلال تناوب تلقائيا لوحة λ / 2، والتكيف المستمر للتي: سا والسلطة OPO، على التوالي، ويتحقق.
  3. ضبط OPO إلى الطول الموجي المطلوب وقياس انتاج الطاقة. إذا كانت قوة منخفضة جدا (مع وجود 4 W تي: سا الليزر على 800 نانومتر، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على الحصول على 0،8-1 W من OPO شعاع عند حوالي 1،050-1،100 نانومتر) تحسين ضخ الطول الموجي والتحقق من إعدادات المرآة الإلكترونية وانتشر من الكريستال. اختيار القيم الموصى بها المثلى، وهي متاحة في كثير من الأحيان كما الخرائط أو الرسوم البيانية، ثم صقل لهم حتى صدى OPO في الإخراج الطول الموجي المطلوب وزيادة الطاقة.
    1. إذا كانت السلطة لا تزال منخفضة، وضبط اثنين من المرايا الوصول إليها من OPO مع المقابض ضبط أربعة مرآة الوصول إليها. القيام بهذه الخطوة ببطء شديد وحركات صغيرة جدا في، بالتناوب بين الجبهة ونهاية المرايا.
  4. تأكد من أن تي: ضرب سا و / أو OPO الحزم المرايا دخول في، مكانة مركزية المناسبة.
    1. استخدام قطعة من الورق الأبيض (غير لامعة جدا أو يعكس!) وعارض الأشعة تحت الحمراء لرصد شعاع OPO والطول الموجي أعلى تي: الحزم سا.
      1. ارتداء نظارات واقية عند العمل مع قوائم الجرد الوطنية تي: الحزم سا (عادة ما يصل الى 720-750 نانومتر مرئيا بالنسبة للشخص العادي).
    2. تعيين قوة الليزر (ق) عند أدنى مستوى ممكن لإجراء المحاذاة وذلك لميnimize الأضرار التي تصيب العين المحتملة.
    3. دائما إبقاء الأضواء المحيطة في الغرفة على، بحيث يتم مقيدة تلميذ العين.
    4. نضع في اعتبارنا أن قوة الليزر هي مخففات تتكون من لوحة والمستقطبات λ / 2، والتي ليست في الواقع حتى الآن عندما تسيطر تي غرامة: سا شعاع يدخل إلى مسح الرأس!
  5. تأكد من أن يتم ضرب الحجاب الحاجز نقطة دخول في منتصف من قبل منظمة الشفافية الدولية: سا و / أو OPO شعاع؛ إن لم يكن، وضبط المرايا الماضيين قبل أن يدخل شعاع الليزر على مسح الرأس.
    1. استخدام الأشعة تحت الحمراء المشاهد وقطعة صغيرة من ورقة بيضاء (ولكن ليس لامعة / عاكسة!)
    2. إغلاق دائما الحجاب الحاجز في دخول المجهر، بحيث موقف شعاع الليزر يمكن الحكم بدقة أكبر. المهم: لا ننسى أن إعادة فتح الحجاب الحاجز قبل الانتقال إلى الخطوة 6!
  6. ضبط الليزر مسار شعاع ضوء ينعكس في المجهر وفقا لذلك. القيام بذلك على قطاعات صغيرة ومتكررة أداء شعاع واlking.
    1. التحقق من مسار الضوء بالكامل إذا خرج الضوء من العدسة الشيئية غير كافية.
    2. دائما التحقق من مسار الضوء عند استخدام النظام للمرة الأولى بعد فترة طويلة الخمول، إصلاح كبرى، أي استبدال العناصر البصرية، أو إذا اشتبه مشاكل في الوجود مع الإخراج.
  7. تأكد من أن جميع الأسطح البصرية النشطة نظيفة، خاصة أنها خالية من الغبار! إذا تتم تغطية الأسطح بطبقة من الغبار، ويتم تشويه جبهة الموجة حتى قبل دخول عدسة الهدف وسوف ينتج شعاع الليزر أبدا تقديم صورة حادة من العينة!
    1. إذا لزم الأمر، وتنظيف المرايا مع قطعة مطوية من الورق عدسة، مبلل مع الايثانول أو الأيزوبروبانول.
  8. تأكد من أن شعاع يصل الى المرآة التي تقع مباشرة فوق المرآة الدخول في نهاية القائمة على منظور نبض ضاغط، بعد أن يتم تعيين مسار الضوء. من هنا، وينعكس شعاع طn لمعدد شعاع (BM).
  9. معرفة ما اذا كان شعاع الليزر يضرب الحجاب الحاجز الذي يقع في مدخل متعدد شعاع، مباشرة أمام لوحة λ / 2، وتغيير الاستقطاب من شعاع الليزر لتناسب متطلبات لواسعة النطاق لنقل 50٪ و 50٪ انعكاسا ضمن BM.
    1. الأولى، إغلاق الحجاب الحاجز بحيث موقف شعاع يمكن الحكم بدقة أكبر وأداء شعاع المشي بين اثنين من أغشية، أي واحد على دخول المجهر والآخر عند مدخل BM. لغيرها من المجاهر واحد العارضة المسح يجب أن يكون موجودا الحجاب الحاجز في دخول س ص الماسح الضوئي.
    2. إذا لا شعاع ضرب وسط الفتحة مغلقة إلى أسفل، وضبط المرآة المذكورة أعلاه، وضعت مباشرة قبل دخول الحجاب الحاجز BM. المهم: لا ننسى أن إعادة فتح الحجاب الحاجز قبل الانتقال إلى الخطوة 10.
  10. مع فتح الحجاب الحاجز، معرفة ما اذا كان شعاع الليزر يضرب المرايا BM فيهذه نقطة الوسط. استخدام شريط ضيق من الورق حتى لا لمنع جزء آخر من التعقيد في ضوء مسارات BM المفضل
  11. معرفة ما اذا كان شعاع يضرب وسط المرايا الخروج: مرآة لأعلى الاستقطاب الموازي "P"، مرآة للأسفل عمودي الاستقطاب "S". إن لم يكن، وضبط المرآة الدخول قبل BM.
  12. معرفة ما اذا كان "S" و "P" شعاع الاستقطاب تسمح بإدخال مجموعات المكعب المستقطب وتتداخل بشكل مناسب في دخول س ص الماسح الضوئي. تخطي هذه الخطوات في حال تم استخدام المجهر الضوئي واحد العارضة.
  13. معرفة ما اذا كان ضوء الليزر يمر مركزي الفحص والعدسات أنبوب ويحصل خلال منتصف العدسة الهدف 'البؤري الخلفي. المهم: هذه الخطوة لابد من القيام به مع شعاع الليزر في موقف وسط، وليس في موقف سيارات!
    1. استبدال عدسة الهدف مع أداة تهدف ("عين الثور") ومعرفة ما اذا كان شعاع الليزر يضرب الهدف في الوسط، وعما إذا كانتإضاءة حتى هو.
    2. إذا كان هذا يبدو أن هذا هو الحال، وإغلاق الفتحة قبل BM ومعرفة ما اذا كان يظهر نمط التداخل دائرية، مع دائرة سوداء في الوسط (الحد الأدنى تدخل).
      1. ضبط المرآة الدخول إذا كان هناك تحول كبير بالنسبة لمركز عين الثور.
  14. الآن استبدال عين الثور مع عدسة الهدف، على سبيل المثال مع عدسة مياه الغمر 20X.
    1. تحقق من الضوء حقل الانتاج مع قطعة من الورق الأبيض. وهذا ينبغي أن يكون مشرقا وموحدة ووضع مركزيا.
    2. قياس انتاج الطاقة: 100٪ OPO مع 100٪ ضخ تي: سا (4 W)، ينبغي للمرء أن يحصل تقريبا. 100-150 ميغاواط بعد عدسة عند 1،100 نانومتر (في المجهر المستخدمة هنا). سوف القوى الليزر أقل لا تكفي لأداء متعددة الحزم SI-TPLSM. لواحد العارضة المسح SI-TPLSM، 5-10 ميغاواط تكفي. يجب أن يظل شعاع الليزر في موقف وسط من دون أن scanneد!
  15. إذا كان أداء MB-SI-TPLSM، محاذاة المرايا في BM على النحو التالي:
    1. وضع عينة الاستشعاع متجانس، مثل شريحة مضان أحمر، على المسرح وتركيز شعاع الليزر داخل العينة ولكن بالقرب من السطح العلوي (أي على مقربة من عدسة 'أمام الهدف).
    2. تعيين المجهر لوضع متعددة الحزم واختيار عدد من الحزم، في البداية، ويفضل شعاع واحد فقط، والاستقطاب، على سبيل المثال "P".
      1. العثور على شعاع الليزر من خلال التصوير الشريحة الفلورسنت: تعيين "P" مصراع فتح وتشغيل الكاميرا CCD بشكل مستمر في حين تركز شعاع.
      2. تأكد من أن الشعاع هو في موقف وسط، وأن الماسح الضوئي هو خارج. تأكد من عدم تفحص شعاع!
      3. العثور على شعاع من خلال البحث عن نقطة مضيئة بالقرب من مركز للرقاقة الكاميرا.
      4. تركيز شعاع حتى بقعة هو ألمع وأكبر، أي الطائرة صورة المجهر يتوافق مع موقف رقاقة الكاميرا؛ تقليل قوة الليزر بحيث لا يتم المشبعة الفور. مع نظام تتماشى جيدا وهذا يعني أن قوة الليزر يجب أن يكون بالقرب من الحد الأدنى عند العمل في وضع شعاع واحد (حوالي 0.6 ميغاواط طاقة الليزر يجب أن تعمل).
      5. إذا كانت البقعة بشكل ملحوظ قبالة مركز، نقله أقرب إلى مركز عن طريق ضبط المرآة في الجبهة BM (أو من الماسح الضوئي لاحد العارضة المسح).
      6. عند محاذاة أيضا الاستقطاب الأخرى، أي "S" شعاع، والتبديل إلى الوضع الآن 2 شعاع، افتح "S" مصراع والتحقق من موقف شعاع (شعاع واحد فقط يمكن أن ينظر إليه إلا إذا كان "S" مصراع مفتوح ).
      7. عندما تنتهي من ذلك، قم بالتبديل إلى وضع 4 الحزم واستخدام "P" واسطة الاستقطاب ("P" فتح مصراع). الآن سوف تظهر اثنين beamlets.
      8. ترتيب beamlets اثنين لتكون موازية تماما إلى الحافة السفلى من وجهة نظر الكاميرا، ومجموعة منهم ليكون 2.8 ميكرومتر إربا.
          >
        1. إذا لم يتم محاذاة بشكل صحيح، وضبط المرآة الأولى من BM.
        2. أبدا محاذاة المسمار في الوسط، بدلا من استخدام المسمارين الطرفية لتحريك المرآة حتى شعاعين هي 2.8 أم، وبصرف النظر تماما رتبت أفقيا.
      9. الآن التبديل إلى وضع 8 شعاع في "P" الاستقطاب، وضبط المرآة BM الثاني (أيضا دون نقطة حمراء) حتى 4 beamlets هي على مسافة واحدة عند 2.8 ميكرون، ويتم ترتيب بالتوازي مع الحافة السفلية من الصورة.
      10. تكرار في 16 - 32 ووضع شعاع، وضبط 3rd و 4th المرايا BS، على التوالي. فمن المهم للbeamlets أن تكون على مسافة واحدة بسبب SI-الخوارزميات، وأبسط كونها خوارزمية دقيقة ماكس (حلو)، وبناء على هذا الافتراض.
  16. استبدال نموذج موحد الفلورسنت بأخرى منظم heterogeneously، مثل جذور زنبق الوادي عبر الملون.
    1. انتقل إلى موقف للسيارات من شعاع الإثارة، ثوعادة ما يتم وضع hich في القيم كبيرة من الإحداثيات الماسح الضوئي، على سبيل المثال (10،000؛ 10،000).
    2. مسح (متعددة الحزم) صورة مع كاميرا CCD. تأكد من أن الصورة تظهر حادة، وموحدة، وعلى التوالي.
    3. ضبط الكاميرا في حالة ظهور الصورة استدارة: تحريف جسم الكاميرا محوريا حول محور عمودي من جهة (أن يكون لطيف!) حتى يتم تقويمها الصورة.
  17. بدء س ص الماسح الضوئي من أجل التحكم في عملية المسح الضوئي لتوليد نمط الإثارة، وصورة أي مخطط.
    1. في حالة متعددة الحزم المسح، حرك المرآة ص الماسح الضوئي، مثال. عمودي على خط beamlet، في مثل هذه الطريقة لتوليد صورة مخطط من الدرجة الثانية.
    2. إذا كان مجال الرؤية ولدت كما هو موضح في الخطوة 17.1. صغير جدا، وتوسيع نطاق الروتين المسح عن طريق تحريك المرآة س الماسح الضوئي إلى موضع ضمان تضاعف خط شعاع دعونا وbeamlets هي على مسافة واحدة على طول الخط كله. كرر الحركة بالضبطالمرآة ص الماسح الضوئي بعد أن يتم نقل المرآة س الماسح الضوئي لتوليد صورة مخطط أكبر.
    3. في حالة واحدة شعاع المسح، بالتناوب حركة المرآة ص الماسح الضوئي مع حركة مرآة X-الماسح الضوئي مرارا وتكرارا في مواقف على مسافة واحدة - التي حددها العلماء - لتوليد صورة مخطط المطلوب.
    4. تأكد من استخدام لحركة المرآة ص الماسح الضوئي لأمر بسرعة ثابتة (خفض التسارع / التباطؤ) وللمرآة واحدة X-الماسح الضوئي في أقصى سرعة (أقصى تسارع / تباطؤ).
  18. يكتسب تلقائيا وحفظ الصورة مقلم مع الكاميرا (حقل كاشف). وبالتالي، مزامنة الكاميرا مع الماسح الضوئي واستخدام الماسح الضوئي كما الزناد الرئيسي.
  19. تكرار الحصول على صور مخطط (بروتوكول المسح هو موضح في البروتوكول 17) عن طريق تحريك المرآة س الماسح الضوئي في مواقع مختلفة على النحو التالي:
    1. اختيار الخطوات التكرار بما فيه الكفاية وطول الخطوة المناسبة بينصورتين مخطط لاحقة لتغطية مسافة بين اثنين من beamlets متتالية (في هذه الحالة 2.8 ميكرون وخطوة واحدة من المرايا الماسح الضوئي يساوي 25 نانومتر)؛ قد يكون من المستحسن السماح القليل من التداخل، أي مبلغ إضافي 0.3-0.4 ميكرومتر.
    2. تعيين التحول x إلى قيمة يطابق قرار الحد الجانبي في الطول الموجي معين. على سبيل المثال، باستخدام 10 خطوات للمرآة X-الماسح الضوئي في التحول و 12 أو 13 التحولات تؤدي إلى أفضل النتائج كل من محوري والقرار الوحشي في هذا النظام. تحقق مع شريحة مهيكلة مثل زنبق الوادي جذور الشريحة، أرقام التي تعمل بشكل أفضل في النظام المستخدمة.
    3. تحسين هذه القيمتين حتى تصبح الصورة أشد زنبق الوادي: استخدام الأداة خط صورة على الصور SI المحسوب ومقارنة عرض ملامح خط (والذي هو إشارة مضان من جدران الخلايا زنبق الوادي).
    4. الحصول على كل صورة مخطط متزامنة مع حركة الماسح الضوئي وحفظها على حدة، على سبيل المثال
  20. فتح مجموعة كاملة من الصور مخطط كما المصفوفات، أي مصفوفة 3D، في روتين التقييم واستخدام إما خوارزمية دقيقة كحد أقصى أو خوارزمية تحويل فورييه، لتوليد مصفوفة 2D من ذات الدقة العالية SI-الصورة. والخوارزميات التي سبق وصفها بالتفصيل 20.

الفئران التحصين والتحضير لتصوير حيوي داخلي

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجان الولائية المناسبة لرعاية الحيوان (LAGeSo، Landesamt FÜR Gesundheit اوند Soziales، برلين) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح (حيوان التجربة G0153/08 الترخيص) الحالي.

  1. تم إجراء تحريض استجابة مركز جرثومي في العقدة الليمفاوية المأبضية وإعداد مجال التصوير كما هو موضح قبل 4. تنقية الخلايا B immunomagnetically من الطحال من B1-8 + / +- / -والخلايا B من B1-8 + / +- / - GFP + الفئران.
  2. حقن عن طريق الوريد 3 × 10 6 خلايا NP-B محددة بدرجة نقاء> 95٪ باستخدام ⅛ B1-8 + / +- / - GFP + و⅞ nonfluorescent B1-8 + / +- / - في C57BL / 6 المتلقين .
  3. يوم واحد بعد نقل الخلايا تحصين المستلمين مع 10 ميكروغرام من NP-CGG (nitrophenyl الدجاج ɣ الجلوبيولين) مستحلب في مساند فرويند الكامل (CFA) في حق الخلفيتين وسادة الغذاء.
  4. شظايا فاب تسمية الأضداد anti-CD21/CD35 مع ATTO590-succinimidyl استر.
    1. لتسليط الضوء على شبكة من الخلايا الجذعية الجريبي (FDC) في مركز جرثومي في الجسم الحي، وضخ 10 ميكروغرام من المسمى تألقي شظايا فاب في قاطع الطريق الخلفيتين الأيمن من ساعة الفئران 12-24 قبل أن يتم إجراء تحليل حيوي داخلي.

وينبغي أن تكون الخطوات التالية consideالأحمر لإعداد العقدة الليمفاوية المأبضية لintravital التصوير (8-10 يوم بعد التحصين):

  1. تخدير الماوس عن طريق الحقن الملكية الفكرية من الكيتامين / زيلازين، وكمية اعتمادا على وزنهم.
  2. اختبار ردود الافعال لرصد عمق التخدير خلال فترة التصوير كلها.
  3. يحلق الساق والظهر والجهة اليمنى من الماوس صارمة واستخدام كريم لإزالة الشعر السماط المتبقية تماما.
  4. إصلاح المدور حق رئيسية: تحديد موقع رقاقة عظمية مع الأصابع، تعيين شق الجلد مع مقص صغير حتى يظهر على شكل المثلث الأبيض لفافة صغيرة.
  5. المشبك رقاقة عظمية تحت هذه اللفافة مع ملاقط وأشار من كابح.
  6. إصلاح العمود الفقري في المنطقة القطنية باستخدام الملقط مسننة.
  7. إصلاح الساق الخلفية اليمنى على كابح وتشديد المسمار.
  8. ذيل الشريط للحفاظ على الساق في المكان المناسب.
  9. في الجانب الذيلية من الفخذ، وخلق شق في الجلد، في المنطقة التي البارز المأبضية الوريد ENTEالتمرير الأنسجة، فصل الجلد عن الأنسجة الكامنة مع ملاقط حادة واتبع الوريد المأبضية من الأقرب إلى القاصي.
  10. فضح العقدة الليمفاوية باستخدام الملقط حادة، في محاولة لتجنب قطع من أجل حماية الأوعية اللمفاوية غرامة (نضع العقدة الليمفاوية في برنامج تلفزيوني خلال تعريض).
  11. إنشاء دائرة الشحوم فراغ حول العقدة الليمفاوية، وملء هذا عجن مع برنامج تلفزيوني.
  12. وضع غطاء زلة في موقفها ووضع مقياس الحرارة مسبار (الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية، وإلا فإن سرعة الخلية سوف تختلف بشكل كبير).
  13. على طول الحافة العلوية من انزلاق الغطاء إضافة دائرة من الشحوم فراغ.
  14. وضع لفائف التدفئة في موقفها من الشحوم فراغ، إنشاء ختم بطريقة مماثلة كما كان من قبل، وإضافة الماء / برنامج تلفزيوني على زلة غطاء زجاجي لتراجع موضوعي في.
  15. بعد التصوير، ويتم الاحتفاظ الماوس في التخدير، مع زيادة جرعة من الكيتامين / زيلازين لجرعة قاتلة، تليها خلع عنق الرحم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

القرار المكانية في الغدد الليمفاوية

أبعاد فعالية وظيفة انتشار نقطة (EPSF) تتوافق مع القرار المكاني للمجهر 12. قمنا بقياس هذه الوظيفة ثلاثية الأبعاد من خلال الحصول على إشارة الجيل الثاني من التوافقيات ألياف الكولاجين في الغدد الليمفاوية لدينا MB-SI-TPLSM بالمقارنة مع تأسيس تقنيات المسح الضوئي ليزر ثنائي الفوتون المجهري، أي TPLSM الكشف الميداني (عن طريق كاميرات CCD) و TPLSM كشف نقطة (عن طريق فرق إدارة المشاريع PMT).

من هذه القياسات يصبح من الواضح أن على سطح العينة، سواء قرارات الوحشي ومحوري تتوافق مع القيم المتوقعة التي تنبأ بها نظرية الحيود 20. ولكن، مع زيادة عمق التصوير، وبالتالي مع زيادة مسار بصري كل من الإثارة والإشعاع الانبعاثات من خلال وسائل الإعلام مع اختلاف درجة عالية من معامل الانكسار، والقرار المكانية تتدهور بشكل كبير، المنخفضة الجهد إشارةpendently من الإعداد العاملين (الشكل 2). بواسطة MB-SI-TPLSM وصلنا، بصرف النظر عن عمق التصوير، وهو تقريبا. قرار الجانبي 20٪ أفضل والقرار المحوري 220٪ أفضل بالمقارنة مع النهج TPLSM القياسية.

ديناميات المركبات المناعية على الخلايا الجذعية الجريبي في مراكز جرثومي

اختيار نسيلي من الخلايا B خلال الاستجابة المناعية، داخل الأجهزة اللمفاوية الثانوية من الفئران الكبار هو الخطوة الأولى في طريقهم إلى التمايز إلى خلايا B الذاكرة أو خلايا البلازما 4. في هذه العملية، ويعتقد أن التفاعل الديناميكي للغاية بين الخلايا الجذعية الجريبي (FDC) والخلايا B على مستوى الهياكل مجمع المناعي (مجموعات من جزيئات قليلة البروتين) داخل مراكز جرثومي للعب دور مركزي. فقط باستخدام حل غاية حيوي داخلي التكنولوجيا المجهري فمن الممكن لتشريح هذه الاتصالات الخلوية وآثارها على الاستجابة المناعية. لدينا نهج Mيوفر B-SI-TPLSM للمرة الأولى إمكانية تصور intravitally وقياس أبعاد مجموعات من الودائع مجمع المناعي كما وصفت من قبل anti-CD21/35-Fab-ATTO590 على الخلايا الجذعية الجريبي، في ما يصل إلى 120 ميكرومتر في عمق مراكز جرثومي من الغدد الليمفاوية المأبضية (أرقام 3A 3B و). بينما مثل هذه الهياكل هي غير مرئية من قبل النهج TPLSM القياسية، فإننا لا يمكن التعرف عليهم بشكل فردي، وحتى تصور ديناميتها باستخدام نهجنا. أرقام 3E 3F ودعم هذه الرؤية، والتي تبين المقارنة المباشرة بين صورة مضان 3D الودائع الخلايا المناعية في مركز جرثومي كما حصل عليها TPLSM التقليدية (القائمة على PMT) وMB-SI-TPLSM. وعلاوة على ذلك، فإن التفاعلات من الودائع مجمع المناعي مع مركز جرثومي الخلايا البائية يمكن حلها غاية (أرقام 3C و 3D؛ أفلام 1 و 2) ويمكن أن يكون أنا الآنnvestigated في تركيبة مع تحقيقات وظيفية حيوي داخلي للانتشار، والتمايز أو موت الخلايا المبرمج. في الخطوة التالية، سوف نستخدم نهجنا أيضا للتحقيق في الاتصالات الحيوية للخلايا B جرثومي مع الخلايا التائية المساعدة، يعتقد أنها تشكل ظاهرة حاسمة أخرى لخلية B نسيلي في اختيار الأجهزة اللمفاوية الثانوية.

الشكل 1
. الرقم 1 المبدأ والإعداد للمخطط متعددة الحزم في الإضاءة اثنين من الفوتون الليزر المسح المجهر شعاع من الانضباطي-نابض خ تي: سا الليزر (النطاق الموجي 690-1،080 نانومتر، 140 FSEC، 80 ميغاهيرتز) والموهن من قبل وحدة نمطية مصنوعة من لوحة λ / 2 والمستقطب الأغشية الرقيقة، وprecompressed البقول في وحدة نمطية GVD التعويض القائم على المنشور وتقسيم أخيرا إلى 2، 4، 8، 16، 32، أو 64 الحزم، وتشكيل خط beamlet. اثنين beamlets متتالية داخل الخط ديك الاستقطابات عمودي (الأحمر والأخضر وصفت في خط beamlet) وتحول في الوقت المناسب من أجل تفادي أي تشويش. والتحول الزمني بين اثنين beamlets متتالية تصل إلى 3 psec. لالتقاط صور، وتركز خط beamlet في عينة من عدسة الهدف (20X غمر المياه عدسة الهدف، NA 0.95، WD 2 مم) وعموديا مسحها، بحيث يتم إنشاء نمط دورية محددة جيدا. يتم تفعيل هذا النمط على طول الخط beamlet. سلسلة من الصور الناتجة يتم الكشف عن هذه الطريقة من خلال مرشحات تدخل شنت على عجلة تصفية بواسطة كاميرا EM-CCD وتقييمها أخيرا بواسطة خوارزمية الحد الأدنى من الحد الأقصى. تم تنفيذ واحد العارضة TPLSM استنادا PMT كشف مع نفس المجهر. في هذه الحالة، كنا واحد فقط شعاع الليزر لمسح العينة، ونحن الطيفي إشارة مضان مع المرايا مزدوج اللون المطابق والمرشحات تدخل قبل الكشففإنه جي مع أنابيب مضخم. بدلا من ذلك، بدلا من تي: سا شعاع الليزر، وشعاع من المذبذب حدودي البصرية يمكن أن يقترن إلى مجهر لأداء الطول الموجي الطويل MB-SI-TPLSM الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. القرار المكانية من متعددة الحزم مخطط في الإضاءة TPLSM مقارنة لمعيار يستند إلى PMT ومتعددة البؤر TPLSM المستندة إلى اتفاقية مكافحة التصحر. (أ) لمحات المحوري الممثل وكذلك س ص والتوقعات XZ من مجموعات المساعدة الذاتية في ألياف الكولاجين في عمق 100 ميكرون داخل الليمفاوية العقدة. lexc = 900 نانومتر، وتتراوح أطوال موجية الكشف 447 ± 30 نانومتر، تدفق الفوتون Φ = 4.75 × 10 2 · ثانية. (ب) حبات الاستشعاع الأصفر والأخضر جزءا لا يتجزأ من الاغاروز كما هو مسجل من قبل MB-SI-TPLSM وTPLSM التقليدية (SB-PMT). λ = 850 نانومتر غير شامل، كشف موجات تتراوح 525 ± 25 نانومتر، تدفق الفوتون Φ = 2.08 × 10 29 الفوتون / سم 2 · ثانية، وحدة شبكة = 3.7 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3 intravital التصوير مراكز جرثومي بواسطة MB-SI-TPLSM (أ) صورة مضان 3D من منطقة الضوء من مركز جرثومي وصفت من قبل CD21/35-Fab-ATTO590 (أحمر) في الماوس تحصين مع ناشبة - γ الدجاج -GLobulin (NP-CGG) بعد نقل بالتبني من B1-8 EGFP + B الخلايا (الخضراء). الودائع مجمع المناعي (وضع العلامات CD21/35) على الخلايا الجذعية الجريبي (FDC) يمكن تصور بشكل فردي، كما لوحظ في التكبير في (ب) من الصورة (أ)، ولها أبعاد (كلا الوحشي ومحوري) في مجموعة من 400-800 نانومتر في عمق يصل إلى 120 ميكرون. تم الكشف عن خلايا B مركز جرثومي في تحصين B1-8 EGFP + الماوس (ج)، في حين أن الاتصالات (د) مسؤولة جزئيا عن نضوج الاستجابة المناعية ويمكن الآن أيضا أن تصور. λ = 850 نانومتر غير شامل، كشف موجات تتراوح 605 ± 20 نانومتر (ATTO590) و 525 ± 25 نانومتر (EGFP)، تدفق الفوتون Φ = 7.05 × 10 28 الفوتون / سم 2 · ثانية. شريط النطاق (أ) 20 ميكرون، (ب) 10 ميكرون، (ج) 30 ميكرون، (د) 10 ميكرون. الصور مضان 3D من نفس المنطقة داخلمنطقة ضوء مركز جرثومي وصفت من قبل CD21/35-Fab-ATTO590 كما هو مسجل من قبل MB-SI-TPLSM (ه) والتقليدية (استنادا PMT) TPLSM (و)، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تعليق الفيلم

فيلم 1 و -2

ديناميات الودائع المناعي المعقدة على الخلايا الجذعية الجريبي الثانوية (FDC) وتفاعلها مع مركز جرثومي خلايا B كما هو مسجل من قبل MB-SI-TPLSM. وصفت الودائع مجمع المناعي عن طريق CD21/35-Fab-ATTO590 (الأحمر) في حين أن مركز جرثومي خلايا B هي B1-8 كيه - / - EGFP + الخلايا (الخضراء).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الهدف من التصوير الضوئي حيوي داخلي هو حيوي وظيفيا تصور الحركة الخلوية والتفاعلات من أجل فهم الأنسجة وظيفة الجهاز في الصحة والمرض 5. التكنولوجيا الأقوى لتحقيق ذلك، متعدد الفوتون الليزر المجهر، لا تزال لديه للتغلب على القيود المتعلقة موجة التشوهات الجبهة، نثر، واقتناء بطيئة، وphotobleaching من photodamage، التي تحد من القرار المكاني لها، وعلى النقيض، فضلا عن قرار وقتها .

وهناك نوعان من الحلول الناجحة لتحقيق الإثارة أفضل (والانبعاثات) إدارة الفوتون في الأنسجة العميقة مما يؤدي إلى قرارات المكاني أفضل، وزيادة المقابل (زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ويرجع ذلك إلى زيادة إشارة)، وبالتالي خفض photobleaching من وphotodamage : النهج البصريات التكيفية واستخدام موجات الإثارة أطول - الانضباطي الإثارة الأشعة تحت الحمراء 6. في العقد الماضي، ومفهوم CORRE موجة الجبهةوقد تم نقل كشن بواسطة البصريات التكيفية من علم الفلك إلى التصوير الحيوية البصرية، وكذلك لمتعدد الفوتون المجهري. حين تقترب من أول البصريات التكيفية لاثنين من الفوتون المجهري تعتمد على الاستشعار عن موجة الأمامي وبحاجة إلى مرجعية subdiffraction، أي "نجمة دليل"، على غرار علم الفلك، والنظم الحالية هي أكثر ملاءمة لتصوير الأنسجة العميقة-12. على سبيل المثال، فإنها تستخدم الاتساق على النابضة من الإشعاع الإثارة لموجة الجبهة الاستشعار 13،15، أو أنها لا تستخدم أي الاستشعار عن موجة الجبهة الخارجية في كل شيء، ولكن تطوير خوارزميات التكيف يستند إما على الصليب الارتباط من الصور بعد تجزئة التلميذ أو 17 البحث على مؤشر ستوكاستيك متكررة من المعلمات المثالي والتدخل لاحقة مع الصورة غير المصححة كما تم الحصول عليها من الخطوة السابقة التكرار - IMPACT 16، أو أنها تستخدم الصور الصوتيات لتوصيف التشوهات موجة الجبهة والآثار نثر 20. لا يزال، ويرجع ذلك إلى حد كبير للتبريد متفاوتةمؤشر نشاطا في الأنسجة، والنهج البصريات التكيفية هي بطيئة نوعا ما، حيث أن خطوة التصحيح لابد المتكررة لمناطق صغيرة نسبيا (حوالي 10 × 10 ميكرون 2) 16. بالإضافة إلى ذلك، إما عن طريق موجة الجبهة أو تصحيح تأثير نثر، أقصى القرار المكانية تحقيقه لا يزال محدودا بسبب الحيود.

نهجنا هو قادرة على التغلب جزئيا أعباء انحراف موجة الجبهة ونثر ولكن أيضا يدفع القرار إلى أبعد من الحد الحيود. استخدام العدسات الهدف مع ارتفاع الفتحة العددية، والقيم المطلقة لصالح القرار المحوري قد يحسن إلى حوالي 400 نانومتر 20. ثمن تحسنت القرار هو تسوس حاد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الأنسجة العميقة بالمقارنة مع TPLSM التقليدية. ويرجع ذلك إلى ضرورة استخدام الكشف الميداني في MB-SI-TPLSM هذا. كما هو مبين قبل 15، ويرتبط استخدام أجهزة الكشف عن الحقل بدلا من كشف نقطة مع هذا الاضمحلال انحدارا من SNR دوه إلى نثر أقوى من الضوء المنبعث والذي هو ذات الصلة فقط للكشف الميداني. وبالتالي، وعمق التصوير القصوى لحقل طرق الكشف TPLSM تقريبا. 25٪ انخفاض بالمقارنة مع التقليدية (أي الكشف عن نقطة أساس) TPLSM. الحل عملي مباشر هو تطبيق موجات الإثارة أطول وللكشف عن انبعاث موجات أطول. بطبيعة الحال، وهذا يحسن SNR تعتمد على العمق في TPLSM التقليدية بالقدر نفسه كما هو الحال في MB-SI-TPLSM.

بقدر ما يتعلق الأمر سرعة الاستحواذ، MB-SI-TPLSM محدود فقط من سرعة الماسح الضوئي galvanometric و / أو من خارج قراءة من الكاميرا والأرباح من تقسيم شعاع إلى 32 شعاع الليزر يتيح. بالمقارنة مع المعيار القائم على كاميرا متعددة الحزم TPLSM، MB-SI-TPLSM أبطأ قليلا نظرا لحاجة ليس فقط لمسح ولكن أيضا للحصول على كل متزامن تقريبا. 10 مخطط مضيئة صور لتوليد عالية الدقة الصورة النهائية. ومع ذلك، يحتفظ أسلوبنا في البنودالأذن سرعة ميزة على TPLSM التقليدية (على أساس واحد العارضة المسح والكشف عن نقطة واحدة). وبالتالي، فإن الوقت الاستحواذ على 150 × 150 ميكرون 2 (512 س 512 بكسل) هو 841 ميللي ثانية باستخدام TPLSM التقليدية (تردد 800 هرتز الماسح الضوئي) و 109 ميللي ثانية باستخدام MB-SI-TPLSM. وبالتالي، قوة الإثارة في شعاع وزمن السكون لكل بكسل هي نفسها لكلا التقليدية وMB-SI TPLSM، حتى أن إشارة مشابه لكلا الاجهزة. كما هو موضح سابقا 20، والآثار photobleaching من photodamage في التجارب MB-SI-TPLSM منخفضة وقابلة للمقارنة لأداء جيدا TPLSM التقليدية.

في المستقبل سيكون من المرغوب فيه أن الجمع بين نهج تكميلية من التكيف البصريات ومخطط الإضاءة، في نطاق الأشعة تحت الحمراء لزيادة تحسين TPLSM حيوي داخلي، على غرار الإنجازات في مجال البصريات التكيفية للهيكلة إضاءة 21. ومع ذلك، من أجل تحقيق هذه الأهداف، والنهج أسرع بكثير البصريات التكيفيةويجب أن توضع.

أثر ارتفاع المتوقع للنهج مخطط في الإضاءة لوالعلوم الحيوية والطب الحيوي يكمن في قدرتها على تحسين القرار وتعزيز التباين في الأنسجة العميقة، مواجهة التشويه جبهة الموجة وتناثر الآثار، ولكن أيضا تتجاوز حدود الحيود في المجاهر الليزر المسح الضوئي، عن طريق ببساطة السيطرة على عملية المسح واختيار كاشف مجال الحساسة بشكل مناسب.

أثر ارتفاع المتوقع للنهج مخطط في الإضاءة لوالعلوم الحيوية والطب الحيوي يكمن في قدرتها على تحسين القرار وتعزيز التباين في الأنسجة العميقة، مواجهة التشويه جبهة الموجة وتناثر الآثار، ولكن أيضا تتجاوز حدود الحيود في المجاهر الليزر المسح الضوئي، عن طريق ببساطة السيطرة على عملية المسح واختيار كاشف مجال الحساسة بشكل مناسب.

ويمكن تطبيق نهج مخطط في الإضاءة لايم حيوي داخلي الأنسجة العميقةالشيخوخة في جميع ثنائي الفوتون المجاهر المسح الضوئي ليزر التي هي قادرة على الكشف عن كاميرا تزامن مع حركة galvoscanner في واحد العارضة المسح. في هذه الحالة، يتم إنشاء المشارب واحدة ضمن نمط الإثارة في وقت لاحق وليس في وقت واحد كما هو الحال في MB-SI-TPLSM. باستخدام المسح شعاع واحد في SI-TPLSM نتوقع بشكل طبيعي معدل اقتناء أبطأ قليلا من الصور مضان بالمقارنة مع TPLSM التقليدية (شعاع واحد المسح الضوئي، وأشر على أساس كاشف TPLSM) ولكن نفس التحسن في القرار المكانية والتباين كما هو موضح لMB- SI-TPLSM. انخفاض سرعة اكتساب جنبا إلى جنب مع قيود في عمق التصوير يقلل كثيرا من نطاق تطبيق واحد العارضة SI-TPLSM بالمقارنة مع MB-SI-TPLSM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

فولكر اندرسون هو مساهم في LaVision بيوتيك محدودة، بيليفيلد، ألمانيا. الكتاب الآخرين لم يكن لديك أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر R. Heintzmann لإجراء مناقشات مثمرة خلال تطوير نهج مخطط في الإضاءة، K. Rajewsky وA. هابرمان لتوفير C57BL / 6 B1-8 GFP الفئران المعدلة وراثيا. نعترف الألمانية للبحوث تحت منحة NI1167/3-1 (لRN)، وHA5354/4-1 SFB633، A15 مشروع (لAEH)، شاريتيه تحت منحة راحيل-هيرش الزمالة (لRN) للحصول على الدعم المالي. ونحن نعترف ولا سيما شبكة JIMI لإجراء مناقشات مثمرة ودعم البنية التحتية

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATTO590 – NSH for coupling ATTO Tec, Germany AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 DRFZ, Berlin The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+ Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment  StemmCell Technologies, Germany 19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm Life Technologies, Germany F8803
Equipment
TriMScope I LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version) APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm Olympus Germany, Hamburg, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
  2. Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, (3), 424-436 (2010).
  3. Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475, (7357), 514-518 (2011).
  4. Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, (5), 655-667 (2007).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  6. Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98, (4), 715-723 (2010).
  7. Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461, (7267), 1069-1070 (2009).
  8. Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63, (4), 429-437 (2009).
  9. Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, (17), 6390-6393 (2012).
  10. Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335, (6068), 551 (2012).
  11. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
  12. Gu, M. Advanced optical imaging. Springer Verlag. Berlin. (2001).
  13. Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15, (4), (2010).
  14. Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
  15. Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93, (7), 2519-2529 (2007).
  16. Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
  17. Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (22), 8434-8439 (2012).
  18. Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
  19. Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9, (11), 3883-3889 (2009).
  20. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7, (12), (2012).
  21. Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16, (13), 9290-9305 (2008).
حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).More

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter