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Immunology and Infection

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

doi: 10.3791/51135 Published: April 9, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Haute résolution intravitale imagerie avec un contraste accru jusqu'à 120 um de profondeur dans les ganglions lymphatiques de la souris adulte est obtenue en modulant spatialement le modèle d'excitation d'un multi-focal microscope à deux photons. En 100 profondeur pm nous avons mesuré des résolutions de 487 nm (latéraux) et 551 nm (axial), contournant ainsi les limites de diffusion et de diffraction.

Abstract

Suivi communication cellulaire par intravitale profond des tissus multi-microscopie biphotonique est la clé pour comprendre le destin des cellules immunitaires dans les échantillons de tissus et d'organes d'épaisseur dans la santé et la maladie. En contrôlant le motif de balayage dans la microscopie multi-photons et en appliquant des algorithmes numériques appropriés, nous avons développé une approche rayé-illumination, ce qui nous a permis d'atteindre trois fois meilleure résolution axiale et une amélioration de rapport signal sur bruit, c'est à dire l'inverse, en plus de profondeur de 100 um de tissu dans le tissu des organes lymphoïdes haute diffusion par rapport à la microscopie multi-photons standard. La vitesse d'acquisition ainsi que photoblanchiment et le photovieillissement effets sont similaires à la technique à base de photo-multiplicateur-standard, tandis que la profondeur d'imagerie a été légèrement inférieure en raison de l'utilisation de détecteurs de champ. En utilisant l'approche-éclairage rayé, nous sommes en mesure d'observer la dynamique des dépôts de complexes immuns sur les cellules dendritiques folliculaires secondaires ̵1; au niveau de quelques molécules de protéines dans les centres germinatifs.

Introduction

Deux photons laser microscopie (TPLSM), avec ses avantages pour l'imagerie des tissus profonds liés à infrarouge ultra-courte excitation pulsée 1, a révolutionné notre point de vue sur les processus vitaux sur un seul niveau cellulaire en révélant la motilité et l'interaction de divers modèles sous-ensembles de cellules dans des animaux vivants 5.2. Cependant, la technologie actuelle est encore insuffisant pour élucider les mécanismes de fonctionnement des organes et le dysfonctionnement comme une condition préalable pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, car il ne rend rares informations sur les bases moléculaires de la réponse cellulaire dans les tissus de la santé et de la maladie. La technologie actuelle permet seulement une fenêtre spatiale de quelques centaines de microns en raison de la dispersion des vagues et des effets de distorsion de front sur ​​la résolution spatiale et rapport signal à bruit de 6, ce qui est particulièrement évident dans le tissu très compact d'animaux adultes. Ces vagues de diffusion et des effets de distorsion avant sont dues à une une très hétérogènesd la distribution anisotrope de l'indice de réfraction dans le tissu, ce qui conduit dans une première étape à une dégradation de la résolution spatiale dépend de la profondeur en 3D, et enfin à la perte totale du signal provenant de photons d'excitation balistiques, à savoir la perte de rapport signal à bruit. En termes de bioscientifiques et les applications biomédicales des tissus profonds, cela signifie que la technologie actuelle n'est pas en mesure de révéler sans équivoque communication cellulaire parce que la mauvaise résolution entraîner des interactions faussement positifs alors que la diminution de rapport signal-sur-bruit causerait le système de négliger certains interactions entre les structures sombres.

Afin de détecter sans équivoque interactions cellulaires de façon dynamique, une résolution spatiale très améliorée est nécessaire profond dans le tissu. Les techniques de nanoscopie puissants actuellement introduites sur la base d'algorithmes numériques spéciaux, par exemple des approches structure éclairage, sur l'épuisement du premier état ​​excité, par exemple par exemple dSTORM, PALM, ont trouvé de nombreuses applications dans les cellules fixes ainsi que dans des cultures de cellules vivantes 7. Toutefois, afin d'étendre ces applications à des coupes de tissus, des tissus vivants et organismes que nous avons encore besoin de surmonter les difficultés techniques graves. Excitation à deux photons STED avec différentes longueurs d'onde, ainsi que d'une seule longueur d'onde (sw2PE-STED) pour l'excitation et l'émission stimulée a été appliquée pour améliorer la résolution latérale dans des tranches de cerveau 8 ou dans des matrices artificielles à cellules incluses 9, respectivement, dans le même résolution axiale comme TPLSM standard. Utilisation d'un photon STED, la dynamique des épines dendritiques peuvent être imagées à la surface du cortex cérébral (jusqu'à 10 à 15 um de profondeur) dans une souris vivante Thy1 EGFP à une résolution de 67 nm 10. Un outil polyvalent pour la biologie du développement est fourni par la microscopie structuré-éclairage multifocale, qui fournit deux fois améliorée 2Drésolution. Cependant, cette technique peut être utilisée que dans les organismes avec une faible propension de diffusion de la lumière tels que des embryons de poisson zèbre 11. Cependant, aucune de ces techniques peut être appliquée dans le tissu très diffusant des animaux adultes à plusieurs centaines de micromètres, qui sont cruciales pour les modèles de la recherche biomédicale et clinique des maladies avec la survenue après la naissance.

Indépendant de l'approximation utilisée pour calculer la forme de l'avant onde limitée par la diffraction, c'est à dire la fonction d'étalement de point (PSF), après focalisation par une lentille, la largeur de la PSF long de l'axe optique (résolution axiale) est au moins trois fois plus grande que la largeur de la PSF perpendiculaire à l'axe optique (résolution latérale) 12. Déformations de l'onde avant d'ordres différents quantifiés par les coefficients de Zernike modifier considérablement la forme du front d'onde de l'onde électromagnétique concentré dans l'imagerie des tissus profonds menant à beaucoup plus PSF, en particulier le long de la fibreal axe 13-15. Par conséquent, à la fois les lois de la diffraction et les effets de distorsion de front d'onde point à la résolution le long de l'axe optique que le facteur limitant dans l'imagerie des tissus profonds. Considérant que des techniques nanoscopie concentrent sur la lutte contre les limites de la diffraction seulement, une technologie qui améliore la résolution axiale et le contraste en compensant à la fois la diffraction et les effets de distorsion de front d'onde est nécessaire pour intravitale imagerie à haute résolution. Idéalement, cette technique devrait également être suffisamment rapide pour permettre un suivi de la dynamique cellulaire.

La correction en temps réel des aberrations PSF et la perte de contraste à l'aide de l'optique adaptative dans TPLSM a été largement étudié et amélioré dans la dernière décennie 13,14,16-18 et il est donc le meilleur choix actuellement disponibles conduisant à une meilleure gestion de l'excitation balistique photons 14. Cependant, en raison du fait que la plupart des vagues avant correction approches utilisées en optique adaptative sont itérative et qu'ils have être répété pour les petites surfaces (quelques 10 x 10 um 2) en raison de la forte hétérogénéité de l'indice de réfraction dans le tissu, la vitesse d'acquisition est significativement plus faible que nécessaire pour la motilité cellulaire et la communication d'image. En outre, la limite physique en optique adaptative améliorée TPLSM est toujours déterminée par diffraction.

Modulation spatiale de l'illumination (SPIN) et modulation temporelle sur le côté de détection (SPADE) ont été théoriquement proposé à appliquer à la microscopie à balayage laser pour améliorer la résolution. Leur application pratique dans l'imagerie intravitale reste encore à être démontrée 19.

Dans l'ensemble, il ya une forte demande pour le développement de technologies qui améliorent la résolution pour l'imagerie des tissus profonds chez les animaux adultes vivant. Dans ce travail, nous obtenons la modulation spatiale du motif d'excitation en commandant le processus de balayage à faisceaux multiples rayé-illumination multi-photons laser-smicroscopie de la conserve (Mo-SI-MPLSM) 20. Contrairement aux approches d'éclairage structuré, dans lequel la section d'excitation transversale du faisceau est modulé spatialement, on utilise seulement le processus de balayage pour réaliser la modulation spatiale de l'excitation. En élargissant l'excitation à une longueur d'onde plus, nous sommes en mesure d'améliorer à la fois la résolution spatiale et le rapport signal-sur-bruit dans les tissus profonds de haute diffusion tissulaire (par exemple des ganglions lymphatiques, chemin libre diffusion 47 um 6), indépendamment de l'optique signal non-linéaire nous détectons, par exemple fluorescence, génération de second harmonique ou autre fréquence mélange phénomène. En utilisant cette approche à des longueurs d'onde d'excitation à 900 nm, nous sommes en mesure de façon dynamique l'image des structures de protéines cellulaires à l'échelle de quelques molécules dans les centres germinaux des ganglions lymphatiques de souris. Ainsi, on peut mieux visualiser l'interaction entre les unités de support d'antigène sur la surface des cellules dendritiques folliculaires et les cellules B dans le processus de palpage contre lagen au cours de la réponse immunitaire dans les organes lymphoïdes secondaires.

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Protocol

Configuration multi-faisceaux pour Striped-éclairage TPLSM

Le montage utilisé ici est un multi-faisceaux à deux photons laser à balayage microscope spécialisé, tel que décrit précédemment 6,20. Le système est illustré sur la figure 1. L'approche peut être appliquée à d'autres microscopes à balayage laser à deux photons, qui sont capables de synchroniser l'acquisition de la caméra avec le mouvement des miroirs de galvoscanner, même si elles ne sont capables d'effectuer un balayage à faisceau unique . Dans ce cas, l'inconvénient sera une vitesse d'acquisition plus faible, cependant proche de la vitesse d'acquisition en TPLSM à base de PMT standard. Afin d'obtenir une qualité optimale pour ce qui concerne la résolution et le contraste, au photoblanchiment le plus bas et le photovieillissement et acquisition plus rapide, il est recommandé d'envisager les mesures d'ajustement suivants de la configuration:

  1. Vérifiez la puissance du laser du laser TiSa: vérifier à 100%, comparer avec les valeurs d'usine originaux et previonous possédons des lectures et l'utilisons comme il est si une longueur d'onde d'excitation dans la gamme 700-1000 nm est nécessaire.
  2. Testez l'indication de la télécommande pour le Ti: Sa diviseur de faisceau, consultez soit 0% et 100% réglages. S'il ya un faisceau TiSa restant à 100%, puis vérifiez et réinitialiser la position du moteur pas à pas nulle. Le Ti: Sa diviseur de faisceau est constitué d'un bas-ordre λ / 2 plaque et un polariseur, qui divise les faisceaux laser polarisés perpendiculairement sur les chemins de faisceaux perpendiculaires: l'un est dirigé dans le microscope pour l'excitation, l'autre est utilisé pour pomper l'paramétrique optique oscillateur (OPO). En faisant tourner automatiquement la plaque λ / 2, un réglage continu de la Ti: Sa et la puissance de l'OPO, respectivement, est atteint.
  3. Ajuster le OPO à la longueur d'onde souhaitée et mesurer la puissance de sortie. Si la puissance est trop faible (avec un 4 W Ti: Sa laser à 800 nm, on devrait être en mesure d'obtenir 0,8-1 W de faisceau OPO à environ 1,050-1,100 nm) d'optimiser la longueur d'onde de pompage et vérifier les paramètres de emiroir e et du cristal éventé. Choisir leurs valeurs recommandées optimales, souvent disponibles sous forme de graphiques ou de diagrammes, puis les ajuster jusqu'à ce que l'OPO résonne à la sortie de longueur d'onde désirée et la puissance augmente.
    1. Si la puissance est encore faible, ajuster les deux miroirs accessibles de l'OPO avec les quatre boutons de miroir réglage accessibles. Effectuez cette opération très lentement et dans de très petits mouvements, en alternant entre les miroirs d'extrémité avant et.
  4. Vérifiez que le Ti: Sa et / ou OPO poutres frappé les miroirs d'entrée à la bonne position, centrale.
    1. Utilisez un morceau de papier blanc (pas très brillant ou réfléchissant!) Et une visionneuse infrarouge pour observer le faisceau de l'OPO et plus de longueur d'onde Ti: Sa poutres.
      1. Porter des lunettes de protection lorsque vous travaillez avec NIR Ti: Sa poutres (généralement jusqu'à 720 à 750 nm est visible pour la personne moyenne).
    2. Régler la puissance (s) de laser le plus bas possible pour la procédure d'alignement de manière à minimize lésions oculaires potentiel.
    3. Toujours garder les lumières ambiantes de la pièce sur, de sorte que la pupille de l'œil est resserré.
    4. Gardez à l'esprit que la puissance du laser est très bien contrôlée par des atténuateurs constitués sur une plaque et des polariseurs λ / 2, qui ne sont pas encore en vigueur lorsque le Ti: Sa faisceau entre le scan-tête!
  5. Vérifiez que le point d'entrée diaphragme est frappé au milieu par le Ti: Sa et / ou OPO faisceau; sinon, ajuster les deux derniers miroirs avant que le faisceau laser pénètre dans la tête de balayage.
    1. Utilisez le spectateur IR et un petit morceau de blanc (mais pas brillant / réfléchissant!) Papier.
    2. Toujours fermer le diaphragme à l'entrée dans le microscope, de sorte que la position du faisceau laser peut être jugée avec plus de précision. Important: N'oubliez pas de rouvrir le diaphragme avant de passer à l'étape 6!
  6. Ajuster la trajectoire de la lumière du faisceau laser réfléchie dans le microscope en conséquence. Pour ce faire, sur de petits segments et effectuer itératif faisceau-walking.
    1. Vérifier l'ensemble du parcours de la lumière si la lumière émise par l'objectif n'est pas suffisant.
    2. Toujours vérifier la trajectoire de la lumière lors de l'utilisation du système pour la première fois après une longue période d'inactivité, une réparation majeure, tout remplacement d'éléments optiques, ou si des problèmes sont soupçonnés d'exister à la sortie.
  7. Assurez-vous que toutes les surfaces optiques actifs sont propres, en particulier qu'ils sont libres de poussière! Si les surfaces sont recouvertes d'une couche de poussière, le front d'onde est déformée avant même d'entrer l'objectif et le faisceau laser résultant ne sera jamais fournir une image nette de l'échantillon!
    1. Si nécessaire, nettoyer les miroirs avec un morceau de papier plié de lentille, humidifié avec de l'éthanol ou de l'isopropanol.
  8. Vérifiez que le faisceau arrive en arrière vers le miroir qui se trouve directement au-dessus du miroir d'entrée à la fin de la compression d'impulsions sur la base de prisme, après le trajet de la lumière est réglée. De là, le faisceau est réfléchi into le multiplexeur de faisceau (BM).
  9. Vérifier si le faisceau laser frappe la membrane qui se trouve à l'entrée du multiplexeur de faisceau, directement avant la plaque λ / 2, en changeant la polarisation du faisceau laser pour s'adapter aux exigences d'une bande large de 50% de transmission et 50% de réflexion à l'intérieur de la BM.
    1. Tout d'abord, fermer le diaphragme de sorte que la position du faisceau peut être jugée plus précisément et exécuter la marche des rayons entre les deux diaphragmes, c'est à dire celle à l'entrée dans le microscope et l'autre à l'entrée BM. Pour d'autres microscopes à balayage à faisceau unique du diaphragme doit être situé à l'entrée dans le xy-scanner.
    2. Si le faisceau ne touche pas le centre de l'ouverture fermée vers le bas, régler le rétroviseur mentionné ci-dessus, placé directement devant l'entrée diaphragme BM. Important: N'oubliez pas de rouvrir le diaphragme avant de passer à l'étape 10.
  10. Avec le diaphragme rouvert, vérifier si le faisceau laser frappe les miroirs BM dansleur point milieu. Utilisez une étroite bande de papier afin de ne pas bloquer une autre partie de la lumière-chemins complexes de la BM!
  11. Vérifiez si le faisceau frappe le milieu des miroirs de sortie: miroir de haut pour une polarisation parallèle "P", miroir de fond de polarisation perpendiculaire "S". Sinon, ajustez le miroir d'entrée avant la BM.
  12. Vérifiez si le "S" et "P" faisceau polarisé permet groupes entrent dans le cube polariseur et se chevauchent de façon appropriée à l'entrée dans le xy-scanner. Passer ces étapes en cas d'un microscope à balayage unique de faisceau est utilisé.
  13. Vérifiez si la lumière laser passe au centre de l'analyse et les lentilles de tube et passe à travers le milieu de l'objectif de «plan focale arrière. Important: cette étape doit être effectuée avec le faisceau laser en position centrale, non pas dans une position de stationnement!
    1. Remplacer l'objectif d'un outil de pointage ("oeil de taureau") et vérifier si le faisceau laser atteint la cible dans le milieu, et si laéclairage est encore.
    2. Si cela semble être le cas, fermer l'ouverture avant la BM et vérifier si un motif d'interférence circulaire apparaît, avec un cercle noir au milieu (un minimum d'interférences).
      1. Ajuster le miroir d'entrée s'il ya un changement important par rapport au centre de l'oeil de boeuf.
  14. Maintenant remplacer l'œil du taureau avec un objectif, par exemple avec un 20x immersion dans l'eau.
    1. Vérifiez le voyant champ de sortie avec un morceau de papier blanc. Cela devrait être clair, uniforme et en position centrale.
    2. Mesurer la puissance de sortie: 100% OPO 100% pompage Ti: Sa (4 W), on devrait obtenir environ. 100-150 mW après la lentille à 1100 nm (dans le microscope utilisé ici). Puissances laser inférieures ne suffiront pas pour réaliser multi-faisceau SI-TPLSM. Pour la numérisation à faisceau unique SI-TPLSM, 5-10 mW suffisent. Le faisceau laser doit rester dans la position centrale, sans être scanned!
  15. Si vous effectuez Mo-SI-TPLSM, aligner les miroirs dans le BM comme suit:
    1. Placez un échantillon homogène fluorescent, par exemple une lame de fluorescence rouge, sur la scène et focaliser le faisceau laser à l'intérieur de l'échantillon, mais près de la surface supérieure (soit près de la lentille devant l'objectif).
    2. Régler le microscope pour le mode multi-faisceaux et choisir le nombre de faisceaux, au départ, de préférence un seul faisceau, et la polarisation, par exemple, "P".
      1. Trouver le faisceau laser par l'imagerie de la diapositive fluorescent: définir le "P" obturateur ouvert et tourner la caméra CCD en continu tandis que la focalisation du faisceau.
      2. Assurez-vous que le faisceau est dans la position centrale, et que le scanner est hors tension. Assurez-vous que le faisceau n'est pas analysé!
      3. Trouver le faisceau par la recherche d'un point lumineux à proximité du centre de la puce de la caméra.
      4. Focaliser le faisceau jusqu'à ce que la tache est la plus brillante et la plus forte, à savoir le plan de l'image dele microscope correspond à la position de la puce de caméra; diminuer la puissance du laser de telle sorte que la tache n'est pas saturé. Avec un système bien aligné, cela signifie que la puissance du laser doit être près du minimum lorsque l'on travaille dans la mode à un faisceau (environ 0,6 puissance du laser mW devrait fonctionner).
      5. Si la tache est nettement décentré, le rapprocher du centre en ajustant le miroir en face de la BM (ou du scanner pour la numérisation à faisceau unique).
      6. Lors de l'alignement aussi l'autre polarisation, c'est à dire "S" faisceau, maintenant passer en mode 2-faisceau, ouvrir le volet "S" et vérifier la position du faisceau (un seul faisceau peut être vu si ce n'est que le volet "S" est ouvert ).
      7. Quand cela est fait, passer en mode 4 de route et utiliser le mode "P" de polarisation ("P" de l'obturateur ouvert). Maintenant deux petits faisceaux apparaissent.
      8. Disposez les deux petits faisceaux à être parfaitement parallèles au bord inférieur de la vue de la caméra, et mettez-les à 2,8 um à part.
          S'ils ne sont pas correctement alignées, réglez le premier miroir de la BM.
        1. Ne jamais aligner la vis au milieu, au lieu d'utiliser les deux vis périphériques pour déplacer le miroir jusqu'à ce que les deux faisceaux sont de 2,8 um à part et parfaitement disposés horizontalement.
      9. Maintenant passer en mode 8-faisceau en "P" polarisation, et régler le deuxième miroir BM (même sans le point rouge) jusqu'à ce que les 4 petits faisceaux sont équidistants à 2,8 um, et sont disposés parallèlement au bord inférieur de l'image.
      10. Répétez à 16 - et le mode 32-faisceau, réglage des rétroviseurs 3e et 4e BS, respectivement. Il est important pour les petits faisceaux à être équidistants parce SI-algorithmes, la plus simple étant l'algorithme min-max (HiLo), sont basés sur cette hypothèse.
  16. Remplacez l'échantillon uniformément fluorescent avec un un hétérogène structuré, par exemple racines Convallaria contre-colorées.
    1. Aller à la position de stationnement du faisceau d'excitation, which est généralement placé à grandes valeurs des coordonnées du scanner, par exemple (10 000; 10000).
    2. Numériser une image (multi-faisceaux) avec la caméra CCD. Assurez-vous que l'image est nette, uniforme et linéaire.
    3. Réglez l'appareil photo si l'image semble tourner: tordre le corps de l'appareil axialement autour de l'axe vertical à la main (être doux!) Jusqu'à ce que l'image est redressée.
  17. Démarrez le xy-scanner pour contrôler le processus de numérisation pour générer le modèle d'excitation, l'image c'est à dire rayé.
    1. Dans le cas de balayage à faisceaux multiples, déplacez le miroir y-scanner, c'est à dire. perpendiculaire à la ligne de mini-faisceau, de telle manière à générer une image à rayures quadratique.
    2. Si le champ de vue généré comme décrit dans l'étape 17.1. est trop petit, s'étend de la routine de balayage en déplaçant le miroir de balayage x-vers une position assurant que la ligne de faisceau-let est doublée et les faisceaux élémentaires sont équidistants le long de toute la ligne. Répétez le mouvement exactdu miroir de balayage après y-x du miroir-scanner est déplacé pour générer l'image à rayures plus grande.
    3. Dans le cas du balayage à faisceau unique, alterner le mouvement du miroir de balayage par y-x-scanner mouvement de miroir à plusieurs reprises dans des positions équidistantes - définis par le scientifique - pour générer l'image à rayures souhaitée.
    4. Assurez-vous d'utiliser pour le mouvement du miroir y scanner une commande de vitesse constante (réduction d'accélération / décélération) et pour la x-scanner miroir l'un à la vitesse maximale (accélération maximale / décélération).
  18. Acquérir et enregistrer automatiquement l'image à rayures avec l'appareil photo (champ-détecteur). Par conséquent, synchroniser l'appareil avec le scanner et utiliser le scanner en tant que maître de déclenchement.
  19. Répéter l'acquisition d'images à rayures (protocole de balayage décrit dans le protocole 17) en déplaçant le miroir de balayage x-dans des positions différentes de la façon suivante:
    1. Choisissez suffisamment de mesures de répétition et la longueur de l'étape appropriée entredeux images rayées ultérieures pour couvrir la distance entre deux petits faisceaux consécutifs (dans ce cas 2,8 um et une étape de miroirs de balayage est égal à 25 nm); il peut être préférable de laisser un peu de chevauchement, soit un montant supplémentaire de 0,3-0,4 um.
    2. Régler le décalage x à une valeur qui correspond à la résolution limite latérale à la longueur d'onde donnée. A titre d'exemple, en utilisant des 10 étapes du miroir de balayage x-par quart ou 13 et 12 conduisent à des changements à la fois axial et meilleur résultat latérales de résolution de ce système. Vérifiez avec un toboggan structurée, par exemple Convallaria racines diapositive, les numéros qui fonctionnent le mieux dans le système utilisé.
    3. Optimiser ces deux valeurs jusqu'à ce que l'image Convallaria devient la plus forte: utiliser l'outil de ligne de profil sur les images calculées SI et comparer la largeur des profils de ligne (qui est le signal de fluorescence des parois cellulaires Convallaria).
    4. Acquérir chaque image rayé synchronisé avec le mouvement de scanner et enregistrer séparément, par exemple,
  20. Ouvrez un ensemble complet d'images rayées comme matrices, soit la matrice 3D, dans la routine d'évaluation et utiliser l'algorithme min-max ou un algorithme à transformée de Fourier pour produire une matrice 2D de la haute résolution SI image. Les algorithmes ont déjà été décrites en détail 20.

Souris vaccination et préparation pour Imagerie intravitale

Les expérimentations animales ont été approuvés par les commissions compétentes de l'État pour la protection des animaux (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) et ont été effectuées conformément aux directives et règlements (expérimentation animale licence de G0153/08) actuels.

  1. L'induction d'une réponse de centre germinatif dans le ganglion lymphatique poplité et la préparation du champ de formation d'image a été réalisée comme décrit ci-dessus 4. Purifier les cellules B immunomagnétiquement de rates de B1-8 + / + Jk - / -et les cellules B de B1-8 + / + Jk - / - + GFP souris.
  2. Injecter par voie intraveineuse de 3 x 10 6 cellules spécifiques NP-B ayant une pureté de> 95% en utilisant ⅛ B1-8 + / + Jk - / - + GFP et ⅞ non fluorescent B1-8 + / + Jk - / - chez des souris C57BL / 6 destinataires .
  3. Un jour après le transfert de cellules immuniser les bénéficiaires avec 10 ug de NP-CGG (nitrophényl-poulet ɣ globuline) émulsionnée dans l'adjuvant complet de Freund (CFA) dans le pad droit alimentaire arrière.
  4. Des fragments Fab d'anticorps étiquette anti-CD21/CD35 avec ATTO590-succinimidyl ester.
    1. Pour mettre en évidence le réseau des cellules dendritiques folliculaires (FDC) dans le centre germinatif in vivo, injecter 10 mg de fragments Fab fluorochrome marqué dans le coussinet plantaire arrière droit de la souris 12-24 h avant l'analyse intravitale est effectuée.

Les étapes suivantes devraient être considérouge pour la préparation d'un ganglion lymphatique poplité pour l'imagerie intravitale (de 8 à 10 jours après l'immunisation):

  1. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine, la quantité en fonction de leur poids.
  2. Tester les réflexes à surveiller la profondeur d'anesthésie pendant toute la période de formation d'image.
  3. Raser la jambe, le dos et le flanc droit de la souris rigoureuse et utiliser de la crème dépilatoire pour enlever les poils résiduelle complètement.
  4. Fixer trochanter droit majeur: trouver puce osseuse avec les doigts, mettre une petite incision de la peau avec des ciseaux jusqu'à ce qu'un petit blanc fascia en forme de triangle apparaît.
  5. Fixer puce osseuse sous cette façade avec des pincettes pointues de la contention.
  6. Fixer la colonne vertébrale dans la région lombaire en utilisant des pinces dentées.
  7. Fixer la patte arrière droite sur dispositif de retenue et serrer la vis.
  8. Bande queue pour garder la jambe dans la bonne position.
  9. Sur le côté caudal de la cuisse, de créer une incision dans la peau, dans la région où la veine poplitée ente de proéminentrs le tissu, séparer la peau du tissu sous-jacent avec des pincettes émoussées et suivre la veine poplitée proximale de la distale.
  10. Exposer le ganglion lymphatique en utilisant des pinces émoussés, essayez d'éviter de couper afin de protéger les vaisseaux lymphatiques fines (garder le ganglion lymphatique dans du PBS pendant l'exposition).
  11. Créer un cercle de graisse à vide autour du nœud lymphatique, combler cette flaque d'eau avec du PBS.
  12. Mettez lamelle dans sa position et placer le thermomètre-sonde (maintenir la température à 37 ° C, sinon la vitesse de cellule va considérablement varier).
  13. Le long du bord supérieur de la lamelle ajouter un cercle de graisse à vide.
  14. Mettez la bobine de chauffage dans sa position sur la graisse à vide, créer un joint de la même façon que précédemment et ajouter de l'eau / PBS sur la lamelle de verre à tremper dans l'objectif.
  15. Après l'imagerie, la souris est conservée dans l'anesthésie, tout en augmentant les doses de kétamine / xylazine à une dose létale, suivie d'une dislocation cervicale.

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Representative Results

La résolution spatiale dans les ganglions lymphatiques

Les dimensions de la fonction d'étalement de point efficace (EPSF) correspondent à la résolution spatiale d'un microscope 12. Nous avons mesuré la fonction tridimensionnelle en acquérant le signal de deuxième génération d'harmoniques de fibres de collagène dans les ganglions lymphatiques par notre MB-SI-TPLSM par rapport à l'établis des techniques de microscopie à balayage laser à deux photons, c'est à dire TPLSM de détection de champ (au moyen de caméras CCD), et TPLSM de détection de point (par le biais de PMT).

De ces mesures, il devient évident que, à la surface de l'échantillon, à la fois les résolutions axiales et latérales correspondent aux valeurs attendues prédites par la théorie de la diffraction 20. Cependant, avec l'augmentation de la profondeur d'imagerie et donc avec l'augmentation de trajet optique à la fois l'excitation et le rayonnement d'émission à travers les médias avec très variable indice de réfraction, la résolution spatiale se détériore considérablement, indedante de la configuration utilisée (Figure 2). Par MB-SI-TPLSM nous sommes arrivés, indépendamment de la profondeur d'imagerie, un env. 20% meilleure résolution latérale et un 220% meilleure résolution axiale par rapport à l'approche de la TPLSM standard.

Dynamique de complexes immuns sur les cellules dendritiques folliculaires dans les centres germinaux

La sélection clonale de cellules B au cours de la réponse immunitaire, dans les organes lymphoïdes secondaires de la souris adulte est le premier pas sur le chemin de se différencier en cellules B mémoires ou des cellules de plasma 4. Dans ce processus, l'interaction très dynamique entre les cellules dendritiques folliculaires (FDC) et les cellules B au niveau des structures de complexes immuns (clusters de quelques molécules de protéines) dans les centres germinaux est censée jouer un rôle central. Seulement en utilisant une technologie de microscopie intravitale très résoudre, il est possible de disséquer cette communication cellulaire et ses implications pour la réponse immunitaire. Notre approche de MB-SI-TPLSM fournit pour la première fois la possibilité de visualiser et de quantifier intravitally les dimensions des grappes de dépôts de complexes immuns comme marqué par anti-CD21/35-Fab-ATTO590 sur les cellules dendritiques folliculaires, en allant jusqu'à 120 um en profondeur d' les centres germinaux des ganglions lymphatiques poplités (figures 3a et 3b). Bien que ces structures ne sont pas visibles par les approches de TPLSM standard, nous pourrions les identifier individuellement et même de visualiser leurs dynamiques en utilisant notre approche. Figures 3e et 3f soutenons cette idée, montrant la comparaison directe entre l'image de fluorescence 3D des dépôts de cellules immunitaires dans un centre germinatif comme acquis par TPLSM classique (PMT-base) et Mo-SI-TPLSM. En outre, les interactions des dépôts de complexes immuns avec des cellules du centre germinatif B pourraient être très résolus (figures 3c et 3d; films 1 et 2) et peuvent désormais être investigated en combinaison avec des sondes fonctionnelles intravitale pour la prolifération, la différenciation ou l'apoptose. Dans une prochaine étape, nous allons utiliser notre approche pour étudier également la communication dynamique des cellules germinales B avec des cellules T auxiliaires, censées constituer l'autre phénomène décisif pour la cellule B sélection clonale dans les organes lymphoïdes secondaires.

Figure 1
.. Figure 1 Principe et la configuration de la multi-faisceau-éclairage rayé à deux photons laser microscope à balayage Le faisceau d'un accordable Ti fs-pulsé: Sa laser (longueur d'onde 690-1,080 nm, 140 fs, 80 MHz) est atténuée par un module constitué d'une plaque λ / 2 et un polariseur à couche mince, les impulsions sont précomprimés dans un module de compensation sur la base GVD prisme et finalement divisés en 2, 4, 8, 16, 32, ou 64 des poutres,la formation d'une ligne de mini-faisceau. Deux petits faisceaux consécutifs au sein de la ligne ont des polarisations perpendiculaires (marquées en rouge et vert dans la ligne de mini-faisceau) et sont décalés dans le temps afin d'éviter les interférences. Le décalage dans le temps entre deux petits faisceaux consécutifs est de 3 ps. Pour l'acquisition de l'image, la ligne de mini-faisceau est focalisé dans l'échantillon par une lentille d'objectif (20X immersion dans l'eau de la lentille d'objectif, NA 0,95, WD 2 mm) et perpendiculairement numérisé, de sorte qu'un motif périodique bien définie est produite. Ce motif est translaté le long de la ligne de mini-faisceau. La série d'images générées de cette manière sont détectées grâce à des filtres d'interférence monté sur une roue de filtre par une caméra CCD et EM-enfin évaluées par un algorithme minimum-maximum. TPLSM faisceau unique sur la base PMT-détection a été effectuée avec le même microscope. Dans ce cas, nous avons utilisé un seul faisceau laser de balayer l'échantillon, et on résolution spectrale du signal de fluorescence avec des miroirs dichroïques correspondants et des filtres d'interférence avant de détectertion avec des tubes photomultiplicateurs. Sinon, au lieu de le Ti:. Faisceau laser Sa, le faisceau d'un oscillateur paramétrique optique peut être couplé à un microscope à effectuer longueur d'onde Mo-SI-TPLSM S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Résolution figure 2. Spatiale des multi-faisceau-éclairage rayé TPLSM rapport à TPLSM à base de CCD standard PMT-base et multifocale. (A) profils axiaux représentatifs ainsi que xy et projections xz de SHG dans les fibres de collagène dans 100 profondeur de um dans la lymphe noeud. lexc = 900 nm, longueur d'onde de détection vont de 447 ± 30 nm, le flux de photons Φ = 4,75 x 10 2 · s. (B) des perles fluorescentes jaunes-verts intégrés dans agarose enregistrée par Mo-SI-TPLSM et TPLSM classique (SB-PMT). λ exc = 850 nm, longueur d'onde de détection vont de 525 ± 25 nm, le flux de photons Φ = 2,08 x 10 29 photons / cm 2 · s, unité de maille = 3,7 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 d'imagerie intravitale de centres germinaux par Mo-SI-TPLSM (a) image de fluorescence 3D de la zone de lumière d'un centre germinatif marqué par CD21/35-Fab-ATTO590 (rouge) dans une souris immunisée avec haptène -.. Γ de poulet -globulin (NP-CGG) après transfert adoptif de B1-8 EGFP + cellules B (vert). Les dépôts complexes immuns (d'étiquetage CD21/35) sur les cellules dendritiques folliculaires (FDC) peuvent être visualisées individuellement, comme observé dans la loupe (b) de l'image (a), et ont des dimensions (à la fois axiales et latérales) dans la gamme de 400-800 nm en profondeur jusqu'à 120 um. Les cellules B du centre germinatif dans la immunisé B1-EGFP + 8 souris sont détectés (c), tandis que les contacts (d) partiellement responsables de la maturation de la réponse immunitaire peut également être visualisés maintenant. λ exc = 850 nm, longueur d'onde de détection vont de 605 ± 20 nm (ATTO590) et 525 ± 25 nm (EGFP), le flux de photons Φ = 7,05 x 10 28 photons / cm 2 · s. La barre d'échelle (a) de 20 um, (b) 10 um, (c) 30 um, (d) de 10 um. Des images de fluorescence en 3D de la même zone à l'intérieur de l'zone de lumière d'un centre germinatif marqué par CD21/35-Fab-ATTO590 enregistrée par Mo-SI-TPLSM (e) et classique (à base de PMT) TPLSM (f), respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

légendes de cinéma

Movie-1 et -2

Dynamique des dépôts immuns complexes sur les cellules dendritiques folliculaires secondaires (FDC) et leur interaction avec les cellules B du centre germinatif enregistrée par Mo-SI-TPLSM. Les dépôts de complexes immuns sont marqués par CD21/35-Fab-ATTO590 (rouge), tandis que les cellules du centre germinatif B sont B1-8 Jk - / - EGFP cellules + (vert).

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Discussion

Le but de l'imagerie optique intravitale est de visualiser dynamiquement et fonctionnellement la motilité cellulaire et interactions pour comprendre le tissu et la fonction des organes en santé et la maladie 5. La technologie la plus puissante pour ce faire, multi-photons laser microscopie, doit encore surmonter les limitations liées à la vague distorsions avant, la diffusion, l'acquisition lente, photoblanchiment et le photovieillissement, qui limitent la résolution spatiale, le contraste ainsi que sa résolution temporelle .

Il existe deux solutions efficaces pour parvenir à une meilleure excitation (et émission) gestion de photons dans les tissus profonds conduisant à de meilleures résolutions spatiales, augmenter le contraste (augmentation du rapport signal-sur-bruit, en raison de l'augmentation de signal) et, donc, photoblanchiment réduite et le photovieillissement : les approches optique adaptative et l'utilisation de longueurs d'onde d'excitation - excitation infrarouge accordable 6. Dans la dernière décennie, la notion de front d'onde corresponction par l'optique adaptative a été transféré à partir de l'astronomie pour l'imagerie par bio-optique et aussi à la microscopie multi-photons. Alors que la première optique adaptative approches pour la microscopie à deux photons compté sur front d'onde de détection et avait besoin d'une référence de subdiffraction, c'est à dire une «étoile de guidage", similaire à l'astronomie, les systèmes actuels sont mieux adaptés à l'imagerie des tissus profonds 12. Par exemple, ils utilisent la cohérence-déclenchement du rayonnement d'excitation pour front d'onde de détection 13,15, ou qu'ils n'utilisent pas de front d'onde de détection externe du tout, mais développent des algorithmes d'adaptation à base soit de cross-corrélation d'images après élève segmentation 17 ou sur la recherche stochastique itératif des paramètres idéaux et les interférences ultérieure avec l'image non corrigée comme obtenues à partir de l'étape d'itération précédente - IMPACT 16, ou ils utilisent photo-acoustique pour caractériser les distorsions de front d'onde et des effets de diffusion 20. Cependant, en raison d'une variation de refr hautementindex actif dans les tissus, les approches d'optique adaptative sont plutôt lent, depuis l'étape de correction doit être répétée pour des zones relativement petites (env. 10 x 10 um 2) 16. De plus, que ce soit par front d'onde ou la correction de l'effet de diffusion, la résolution spatiale maximale pouvant être atteinte est encore limitée par la diffraction.

Notre approche est capable de surmonter en partie les charges de front d'onde aberration et de diffusion mais aussi pousse la résolution au-delà de la limite de diffraction. Utilisation de lentilles d'objectif à ouverture numérique élevée, les valeurs absolues de la résolution axiale peut améliorer à environ 20 400 nm. Le prix pour l'amélioration de la résolution est une décroissance plus forte de rapport signal-sur-bruit dans les tissus profonds par rapport à TPLSM classique. Cela est dû à la nécessité d'utiliser la détection de champ en Mo-SI-TPLSM. Comme le montre avant le 15, l'utilisation de détecteurs de champ à la place de détecteurs de point est associée à cette décadence raide de SNR due à la diffusion forte de la lumière émise qui n'est pertinente que pour la détection de champ. Ainsi, la profondeur maximale d'imagerie pour la détection de terrain méthodes TPLSM est d'env. 25% réduit par rapport à (à savoir la détection de points en fonction) TPLSM classique. Une solution pratique simple consiste à appliquer des longueurs d'onde d'excitation et de détecter des longueurs d'onde d'émission. Naturellement, cela permet d'améliorer le rapport signal sur bruit en fonction de la profondeur TPLSM conventionnelle dans la même mesure que dans MB-SI-TPLSM.

En ce qui concerne la vitesse d'acquisition est concerné, Mo-SI-TPLSM n'est limitée que par la vitesse du scanner galvanométrique et / ou par la température lue de la caméra et les bénéfices de la division de faisceau de 32 faisceau laser permet. Par rapport à TPLSM par caméra multi-faisceau standard, Mo-SI-TPLSM est légèrement plus lent en raison de la nécessité non seulement de numériser, mais aussi d'acquérir de manière synchrone chacun environ. 10 rayé éclairés images pour générer l'image finale à haute résolution. Cependant, notre technique conserve une cloreille avantage de vitesse sur le TPLSM classique (basé sur le balayage à faisceau unique et détection de point). Par conséquent, le temps d'acquisition d'un (512 x 512 pixels) 150 x 150 um est de 2 841 ms en utilisant TPLSM classique (fréquence de balayage de 800 Hz) et 109 ms en utilisant MB-SI-TPLSM. De ce fait, la puissance d'excitation par faisceau et le temps de séjour par pixel sont les mêmes pour les deux conventionnel et MB-SI TPLSM, de sorte que le signal est comparable pour les deux configurations. Comme démontré précédemment 20, photoblanchiment et les effets de photovieillissement dans les expériences Mo-SI-TPLSM sont faibles et comparables à TPLSM classique bien exécuté.

Dans l'avenir, il serait souhaitable de combiner les approches complémentaires de optique adaptative et-éclairage rayé dans le domaine de l'infrarouge pour améliorer encore TPLSM intravitale, similaire aux résultats obtenus dans l'optique adaptative pour structuré-éclairage 21. Toutefois, afin d'atteindre ces objectifs, des approches beaucoup plus rapidement optique adaptativedoivent être développées.

Le fort impact attendu de l'approche-éclairage rayé pour les biosciences et la biomédecine réside dans sa capacité à améliorer la résolution et améliorer le contraste dans le tissu profond, de lutter contre la vague avant distorsion et des effets de diffusion, mais aussi aller au-delà des limites de diffraction dans les microscopes à balayage laser, par contrôle simplement le processus de numérisation et de choisir un détecteur de champ de sensibilité appropriée.

Le fort impact attendu de l'approche-éclairage rayé pour les biosciences et la biomédecine réside dans sa capacité à améliorer la résolution et améliorer le contraste dans le tissu profond, de lutter contre la vague avant distorsion et des effets de diffusion, mais aussi aller au-delà des limites de diffraction dans les microscopes à balayage laser, par contrôle simplement le processus de numérisation et de choisir un détecteur de champ de sensibilité appropriée.

L'approche-éclairage rayé peut être appliqué pour intravitale im tissus profondsvieillissement dans tous deux photons microscopes à balayage laser qui sont capables de synchroniser la détection de la caméra avec le mouvement de galvoscanner à balayage à un seul faisceau. Dans ce cas, les rayures simples dans le modèle d'excitation sont générés suite et non simultanément comme dans Mo-SI-TPLSM. Utilisation de balayage à faisceau unique à SI-TPLSM nous nous attendons naturellement un taux d'acquisition légèrement plus lent des images de fluorescence par rapport à TPLSM conventionnel (de balayage à faisceau unique, point TPLSM basé détecteur), mais la même amélioration de la résolution spatiale et de contraste tel que démontré pour MB- SI-TPLSM. La vitesse d'acquisition inférieures et de la limitation de la profondeur d'imagerie permet de réduire considérablement la gamme de mono-faisceau SI-TPLSM demande par rapport à Mo-SI-TPLSM.

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Disclosures

Volker Andresen est un actionnaire de LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Allemagne. Les autres auteurs n'ont pas de conflits d'intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions R. Heintzmann pour des discussions fructueuses lors de l'élaboration de l'approche-éclairage rayé, K. et A. Rajewsky Haberman pour fournir des souris transgéniques C57BL / 6 B1-8 GFP. Nous reconnaissons la Deutsche Forschungsgemeinschaft sous subvention NI1167/3-1 (RN), HA5354/4-1 et SFB633, A15 du projet (à AEH), la Charité sous-subvention Rahel Hirsch bourse (RN) pour le soutien financier. Nous reconnaissons en particulier le réseau JIMI pour des discussions fructueuses et soutien aux infrastructures

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATTO590 – NSH for coupling ATTO Tec, Germany AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 DRFZ, Berlin The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+ Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment  StemmCell Technologies, Germany 19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm Life Technologies, Germany F8803
Equipment
TriMScope I LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version) APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm Olympus Germany, Hamburg, Germany

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References

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Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux
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Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).More

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).

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