Mycket Lösta Intravital Randig-belysning Mikroskopi germinalcenter

Summary

Högupplösande intravital avbildning med förstärkt kontrast upp till 120 ^ m djup i lymfkörtlar från vuxna möss åstadkoms genom att rumsligt modulering av exciteringsmönster av en multi-fokal två-foton-mikroskop. I 100 um djup mätte vi resolutioner av 487 nm (lateral) och 551 nm (axial), på så sätt kringgå spridnings och diffraktion gränser.

Abstract

Övervakning cellulär kommunikation genom intravital djupvävnads flera foton mikroskopi är nyckeln för att förstå vad som händer med immunceller inom tjocka vävnadsprover och organ i hälsa och sjukdom. Genom att styra scanning mönster i flera foton mikroskopi och tillämpa lämpliga numeriska algoritmer, utvecklade vi en randig-belysning metod, som gjorde det möjligt för oss att uppnå 3-faldigt bättre axiell upplösning och förbättrad signal-till-brus-förhållande, dvs kontrast, i mer än 100 nm vävnadsdjup inom mycket spridande vävnad av lymfoida organ jämfört med standard multi-foton mikroskopi. Förvärvs hastighet samt fotobleknings och fotoskador effekter liknade standard fotomultiplikatorn-baserad teknik, medan bilddjupet var något lägre på grund av användningen av fältdetektorer. Genom att använda den randiga-belysning strategi, har vi möjlighet att observera dynamiken i immunkomplex avlagringar på sekundära follikulära dendritiska celler ̵1; om nivån på några proteinmolekyler i germinalcentra.

Introduction

Två-foton laserskanning mikroskopi (TPLSM), med dess fördelar för djupvävnads avbildning samband med infraröd ultrakorta pulsad excitation ^1, har revolutionerat vår syn på viktiga processer på ett enda cellnivå genom att avslöja motilitet och interaktionsmönster av olika cellgrupper i levande djur ^2-5. Dock är dagens teknik fortfarande otillräcklig för att klarlägga mekanismerna för organfunktion och dysfunktion som en förutsättning för utveckling av nya terapeutiska strategier, eftersom det gör bara glesa information om den molekylära grunden för cellulära svar inom vävnader i hälsa och sjukdom. Dagens teknik gör det möjligt för bara en rumslig fönster av några hundra mikrometer på grund av spridning och vågfrontskorrektion förvrängningseffekter på rumslig upplösning och signal-till-brus-förhållande ^6, vilket är särskilt tydligt i den mycket kompakt vävnad av vuxna djur. Dessa spridnings och vågfrontskorrektion distorsionseffekter beror på en mycket heterogen end anisotrop fördelning av brytningsindex i vävnad, vilket i ett första steg till ett djup beroende försämring av 3D spatial upplösning och slutligen till total förlust av signal som kommer från ballistiska excitation fotoner, det vill säga förlust av signal-till-brus-förhållande. När det gäller biovetenskaplig och biomedicinska djupvävnads applikationer, innebär detta att den nuvarande tekniken är inte entydigt avslöja cellulär kommunikation eftersom dålig upplösning skulle leda till falskt positiva interaktioner medan minskningen av signal-till-brus-förhållande skulle få systemet att förbise vissa interaktioner mellan dim strukturer.

För att otvetydigt identifiera cellulära interaktioner på ett dynamiskt sätt, behövs en mycket förbättrad rumslig upplösning djupt inom vävnaden. De för närvarande infört kraftfulla nanoskopi tekniker som bygger på speciella numeriska algoritmer, t.ex. struktur-belysning metoder, om utarmningen av den första exciterade tillståndet, t.ex. </em> Sted, RESOLFT, eller på molekyl lokalisering, t.ex. dSTORM, PALM, har funnit många tillämpningar i fasta celler och i levande cellkulturer ^7. Men för att förlänga dessa program för att vävnadssnitt, levande vävnad och organismer som vi fortfarande måste övervinna allvarliga tekniska svårigheter. Tvåfotonexcitering sted med olika våglängder samt med en enda våglängd (sw2PE-STED) för excitation och stimulerad emission har tillämpats för att förbättra laterala upplösningen i hjärnskivor ⁸ eller i artificiella matriser med inbäddade celler ^9, respektive, vid samma axial upplösning som standard TPLSM. Användning av en-foton-STED kan dynamiken i Dendritutskotten skall avbildas på ytan av hjärnbarken (upp till 10 till 15 ^ m djup) i en levande Thy1 EGFP mus med en upplösning på 67 nm ^10. Ett mångsidigt instrument för utvecklingsbiologi ges av multifokal strukturerade-belysning mikroskopi, som ger två gånger förbättrad 2Dupplösning. Emellertid kan denna teknik endast användas i organismer med en låg benägenhet för ljusspridning såsom zebrafiskembryon ^11. Ändå kan ingen av dessa metoder tillämpas i den mycket spridande vävnad av vuxna djur i flera hundra mikrometer, som är viktiga modeller för biomedicinsk och klinisk forskning av sjukdomar med debut efter födseln.

Oberoende av approximation används för att beräkna diffraktionsbegränsad vågfront form, dvs punktspridningsfunktion (PSF) efter fokusering med en lins, är åtminstone tre gånger större än bredden på PSF längs den optiska axeln (axiell upplösning) PSF-bredd som är vinkelrät mot den optiska axeln (lateral upplösning) ^12. Vågfrontskorrektion snedvridning av olika ordning kvantifierade av Zernikes koefficienter avsevärt modifiera vågfronten form av fokuserad elektromagnetisk våg i djup-vävnad avbildning som leder till mycket större vävda, särskilt längs den optiskaal axel ^13-15. Därför både de diffraction lagar och vågfronten distorsionseffekter pekar på upplösning längs den optiska axeln som den begränsande faktorn i djupt vävnad avbildning. Endast behövs av följande skäl nanoskopi tekniker inriktade på att motverka gränserna för diffraktion en teknik, som förbättrar axiell upplösning och kontrast genom att motverka både diffraktion och vågfronten distorsionseffekter för högupplösta intravital avbildning. Helst bör denna teknik också vara tillräckligt snabb för att möjliggöra övervakning av cellulära dynamik.

Realtids korrigering av PSF aberrationer och kontrastförlust med hjälp av adaptiv optik i TPLSM har studerats och förbättrats under det senaste decenniet ^13,14,16-18 och det är därför det bästa tillgängliga valet leder till en bättre hantering av ballistiska excitation Fotoner ^14. Ändå, på grund av det faktum att de flesta vågfront korrigering tillvägagångssätt som används i adaptiv optik är iterativ, och att de HAve upprepas för små ytor (några få 10 x 10 ^ m ²⁾ på grund av den höga heterogeniteten av brytningsindex i vävnaden, är förvärvet hastighet betydligt lägre än vad som krävs för avbildning cellmotilitet och kommunikation. Dessutom förbättras den fysiska begränsningen i adaptiva optik TPLSM fortfarande bestämmas genom diffraktion.

Spatial modulering av belysnings (SPIN) och tidsmässiga modulering på detektion sidan (SPADE) har teoretiskt förslag som skall tillämpas på laser-scanning mikroskopi för att förbättra upplösningen. Deras praktiska tillämpningen i intravital avbildning är ännu inte påvisas ^19.

Sammantaget finns det en stor efterfrågan på att utveckla teknik som förbättrar upplösningen för djupvävnads avbildning i levande vuxna djur. I detta arbete får vi rumsliga modulering av exciteringsmönstret genom att styra skanningsprocessen i flerstråle randig-belysning med flera foton laser skonservering mikroskopi (MB-SI-MPLSM) ^20. I motsats till strukturerade belysning tillvägagångssätt, i vilket exciteringsstrålen tvärsnitt spatialt module använder vi enbart skanningsprocessen för att uppnå den rymdmodulering av exciteringen. Genom att expandera den excitation till en längre våglängd, har vi möjlighet att förbättra både rumslig upplösning och signal-till-brusförhållandet i djupvävnaden hos mycket spridande vävnad (t.ex. lymfkörtel fritt spridningsvägen 47 um ^6), oberoende av den optiska icke-linjär signal som vi upptäcker, t.ex. fluorescens, andra harmoniska generationen eller annan frekvens blandningsfenomen. Med hjälp av denna strategi på excitationsvåglängder upp till 900 nm kan vi dynamiskt bild cellulär proteinstrukturer på skalan av några molekyler i germinalcenter av mus lymfkörtlar. Därmed kan vi bättre visualisera samspelet mellan antigen bär heter på ytan av follikulära dendritiska celler och B-celler i processen att sondera antigen under immunsvaret i sekundära lymfoida organ.

Protocol

Multi-beam Setup för Randig-belysning TPLSM Installationen som används här är ett specialiserat flerstrålande två-foton-laserscanningsmikroskop, såsom beskrivits tidigare 6,20. Systemet som visas i fig 1. Kan appliceras Ansatsen till andra två-foton-laserscannande mikroskop, som är i stånd att synkronisera kamera förvärv med rörelsen av de galvoscanner speglar, även om de endast är i stånd att utföra en-stråle skanning . I detta fall kommer den nac…

Representative Results

Rumslig upplösning i lymfkörtlar Måtten på den effektiva punktspridningsfunktion (EPSF) motsvarar den rumsliga upplösningen i ett mikroskop 12. Vi mätte denna tre dimensionell funktion genom att förvärva den andra harmoniska generationen signal av kollagenfibrer i lymfkörtlar genom vår MB-SI-TPLSM jämfört med etablerade två-foton-laserskanning mikroskopi tekniker, dvs detekteringsfält TPLSM (med hjälp av CCD-kameror), och punkt upptäckt TPLSM (med hjälp av P…

Discussion

Syftet med intravital optisk avbildning är att dynamiskt och funktionellt visualisera cellulära motilitet och interaktion för att förstå vävnader och organ fungerar vid hälsa och sjukdom ^5. Den mest kraftfulla teknik för att uppnå detta, flera foton laserskanning mikroskopi, fortfarande har att övervinna begränsningar i samband med våg fram snedvridningar, spridning, långsam förvärv, fotoblekning och fotoskador, som begränsar dess rumslig upplösning, kontrast samt dess tidsupplösning .

<…

Materials

ATTO590 – NSH for coupling	ATTO Tec, Germany	AD-590-35	–
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590	DRFZ, Berlin	–	The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+	Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US	–	Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment	StemmCell Technologies, Germany	19854	–
Polystyren beads (605), 0.2 µm	Life Technologies, Germany	F8803	–
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
TriMScope I	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany	–	–
OPO (manual version)	APE, Berlin, Germany	–	–
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	Coherent, Duisburg, Germany	–	–
water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm	Olympus Germany, Hamburg, Germany	–	–