Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE

Published: April 15, 2014 doi: 10.3791/51154
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

Summary

De transplantatie van neurale stamcellen / progenitorcellen (NPC) houdt grote beloften in de regeneratieve neurologie. De systemische toediening van NPCs is in efficiënte, lage invasief en therapeutisch zeer effectief protocol om stamcellen te leveren in de hersenen en ruggenmerg van knaagdieren en niet-menselijke primaten die door experimentele chronische inflammatoire schade aan het centrale zenuwstelsel.

Abstract

Neurale stamcellen / voorlopercellen (NPC) zijn een veelbelovende stamcelbron voor transplantatie benaderingen die gericht zijn op de hersenen reparatie of restauratie in regeneratieve neurologie. Deze richtlijn is ontstaan ​​uit de vele bewijzen dat de hersenen reparatie wordt bereikt na focale of systemische NPC transplantatie in verschillende preklinische modellen van neurologische aandoeningen.

Deze experimentele gegevens hebben de cel levering route geïdentificeerd als een van de belangrijkste obstakels van het herstelrecht stamcel therapieën voor hersenziekten die dringende evaluatie vereist. Intraparenchymateuze stamcel transplantatie is een logische benadering voor de pathologieën gekenmerkt door geïsoleerde en toegankelijke hersenletsels zoals ruggemergverwondingen en Parkinson. Helaas, dit principe is slecht van toepassing op aandoeningen die worden gekenmerkt door een multifocale, inflammatoire en verspreid (zowel in tijd en ruimte) de natuur, met inbegrip van multiple sclerose (MS). Als zodanig, hersenen targeting door systemische NPC productietijd is een lage invasieve en therapeutisch effectief protocol cellen leveren aan de hersenen en ruggenmerg van knaagdieren en niet-menselijke primaten die door experimentele chronische inflammatoire beschadiging van het centrale zenuwstelsel (CZS).

Deze alternatieve methode cel levering berust op de NPC pathotropism specifiek hun aangeboren vermogen om (i) het detecteren omgeving via functionele celadhesie moleculen en inflammatoire cytokine en chemokine receptoren; (Ii) steekt de lekkende anatomische barrières na intraveneuze (iv.) Of intracerebroventriculaire (ICV) injectie; (Iii) accumuleren op het aantal meervoudige perivasculaire plaats (en) van inflammatoire hersenen en ruggenmerg schade; en (iv) uitoefenen opmerkelijke weefsel trofische en immuunregulatoire effecten op andere host doelcellen in vivo.

Hier beschrijven we de methoden die we hebben ontwikkeld voor de iv. en <em> icv levering van syngenetische NPCs in muizen met experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE), als model van chronische CNS inflammatoire demyelinisatie, en overwegen de systemische stamcel levering als een waardevolle techniek voor het selectief richten van de ontstoken hersenen in de regeneratieve neurologie.

Introduction

Sterke aanwijzingen ontstaan ​​van in vivo studies waaruit de therapeutische werking van de transplantatie van somatische neurale stam / voorlopercellen (NPC) in diermodellen van CNS stoornissen 1-8. Niettemin is een aantal kwesties met betrekking tot de levering van stamcellen in de gastheer dient een zorgvuldige afweging voordat deze experimentele resultaten kunnen worden vertaald in klinische toepassingen. Een bijzonder belangrijke hindernis voor de ontwikkeling van (nonhematopoietic) herstellende stamcel therapieën voor multifocale, chronische inflammatoire hersenziekten is de identificatie van de ideale route van NPC injectie. Een goed begrip van de pathofysiologie van de ziekte gerichte (focale of multifocale; primaire inflammatoire of primaire degeneratieve), en een voorzichtige analyse van de haalbaarheid en de risico's die samenhangen met de levering technieken zijn in de optimale protocol voor stamceltransplantatie levering identificeren.

Terwijl het brandpunt ( (bv. Parkinson en ziekte van Huntington, de hersenen en het ruggenmerg traumatische verwondingen en beroerte), kan eenzelfde benadering bewijzen praktisch niet haalbaar zijn bij aandoeningen zoals MS, wanneer een multifocale, chronische en ruimtelijk verspreid CNS-letsel accumuleert tijd. In dit laatste geval richt focale cel injecties individuele laesies wordt ook belemmerd door de beperkte capaciteit van getransplanteerde NPC migreren over lange afstanden in het CZS parenchym, dus kwam de identificatie van alternatieve, meer geschikte werkwijzen CZS gericht op minder invasieve NPC transplantaties .

Grote belofte kwam uit de waarnemingen die NPC's richten een intracraniële tumor (bijv.. Glioom) bij muizen wanneer intravasculair geïnjecteerd buiten de CNS9. Na deze rudimentairein vivo bewijs van de stamcel pathotrophism 10, zijn uitgebreide gegevens zijn verzameld met betrekking tot de haalbaarheid en de therapeutische werkzaamheid van de systemische transplantatie van NPC's in proefdieren met experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE), als een model van inflammatoire CNS schade, via ofwel intraveneuze (iv) of intracerebroventriculaire (ICV). NPC injectie 1,2,5,6,8 .. We hebben eerst aangetoond dat dit afhankelijk is van het vermogen van getransplanteerde NPC te richten en voer de ontstoken CZS, en vervolgens gaan meerdere intercellulaire communicatieprogramma's binnen bepaalde micro-omgevingen in vivo 11. Om specifiek op het CZS, zijn NPCs rechtstreeks in de cerebrospinale vloeistof (CSF) verkeer door ICV injectie of in de bloedstroom via iv injectie afgeleverd. Zodra het invoeren ofwel de bloedbaan of het CSF, getransplanteerde NPC actief communiceren metde bloed-hersenbarrière (BBB) ​​of bloed hersenvocht (BCSFB) barrières en voer de CNS parenchym. Deze interactie tussen de NPC transplantaat en de BBB (of BCSFB) wordt geregeld door specifieke set van NPC oppervlak celadhesiemoleculen (CAM) en gefaciliteerd door de expressie van hoge niveaus van CAM contra-liganden op geactiveerde endotheliale / ependymale cellen 12-14. Voorbeelden van deze CAM's zijn de receptor voor hyaluronate, CD44, en de intercellulaire adhesie molecuul (ICAM) -1 ligand zeer laat antigeen (VLA) -4 5,15,16 (dat in leukocyten, zijn verantwoordelijk voor de interactie met geactiveerde ependymal en endotheliale cellen), en in veel mindere mate lymfocyt functie-geassocieerde antigen (LFA) -1 en P-selectine glycoproteïne ligand (PSGL) -1. NPCs ook express diverse chemokine receptoren, zoals CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 en CXCR4 (maar niet tot expressie CCR3 en CCR7), die functioneel actief zijn, zowel in vitro als in vivo 5,16. Aldus systemically geïnjecteerd NPCs gebruiken deze CAMs, samen met G-proteïne gekoppelde receptor (GPCR), te accumuleren op het niveau van de ontstoken CZS. Omgekeerd NPCs geïnjecteerd systemisch in gezonde muizen niet betreden het CZS via vasculaire of hersenvocht ruimte routes 2. CZS-ontsteking, of endotheliale / ependymale cel activatie na systemische cytokine of lypopolisaccharide (LPS) injectie als een model van chemisch geïnduceerde encefalitis, is daarom noodzakelijk voor de accumulatie van systemisch geïnjecteerd NPCs in de hersenen en het ruggenmerg 2. Aldus succesvolle targeting van het CZS systemische therapieën NPC is afhankelijk van de identificatie van ziektespecifieke tijdsspanne (Woo) waarbij de hersenen en het ruggenmerg omgeving bevorderlijk zijn voor de accumulatie en transendotheliale migratie van NPC. Een dergelijke regel komen de voorwaarden in het kader van acute en subacute ontsteking 17. Eenmaal binnengekomen de CNS, getransplanteerde ongedifferentieerde NPCsis aangetoond dat de klinisch-pathologische kenmerken van muizen als grotere, niet-humane primaten met EAE verbeteren. Dit staat beschreven afhankelijk van minimaal celvervanging 2 en opmerkelijke secretie van immuunregulatoire en neuroprotectieve paracriene factoren binnen perivasculaire CNS 2,5,6,18 versus niet-CNS ontstoken gebieden 19,20 (bijv. lymfeklieren) in antwoord op de te inflammatoire cell signaling uitgelokt door infiltrerende immuuncellen 5.

Hierin beschrijven we de belangrijkste methodologische aspecten van de systemische injectie van somatische NPCs in een muismodel van chronische EAE. Meer specifiek, definiëren we de protocollen die we hebben opgericht om (i) af te leiden, uit te breiden en voor te bereiden voor transplantatie somatische NPCs uit de subventriculaire zone (SVZ) van volwassen C57BL / 6 muizen; (Ii) induceren chronische EAE in deze muizen en (iii) uitvoeren therapeutisch werkzame systemisch (iv of icv) NPC transplantatie into EAE muizen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren worden uitgevoerd volgens de principes van proefdier zorg door de UK Home Office goedgekeurd in het kader van de dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986 (PPL nr. 80/2457 naar SP).

1. Afleiding van Somatische neurale stamcellen / progenitorcellen (NPC's) uit de subventriculaire zone (SVZ) van de hersenen van volwassen muizen

  1. Bereiding van dissectie-instrumenten en media
    NB: Deze twee oplossingen moeten worden voorbereid 1-2 uur voor dissecties instrumenten zijn klaar en voorverwarmd bij 37 º C ten minste 20-30 minuten voor gebruik (het helpt om papaïne verdunnen en optimaliseert enzymactiviteit).
    1. Autoclaaf een rechte scherpe schaar, een kleine chirurgische schaar en twee kleine gebogen gekartelde tang.
    2. 'Spijsvertering' oplossing: Bereid twee afzonderlijke buizen van 50 ml met:
      Oplossing 1: 25 ml Balanced Salt Solution (EBSS) + 10 mg ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) + 10 mg L-cysteïne Earle's;en
      Oplossing 2: 25 ml EBSS + 50 mg papaïne.
    3. Bereid "Speel groeimedium (CGM): volledige muis basaal medium met muis proliferatie supplementen, heparine 0.002%, basische fibroblastgroeifactor (bFGF, 10 ng / ml), epidermale groeifactor (EGF, 20 ng / ml) en antibiotica (Pen / Strep).
  2. Brain dissectie
    NB: Het verwijderen van de temporele botten kan gemakkelijk schade aan het weefsel vanwege hun scherpte. Om dit te voorkomen, stevig de botten vast met de pincet en trek totdat de hele bot is verwijderd.
    1. Voor elke bereiding van NPCs, ruiming door cervicale dislocatie n = 5-7, 4-8 weken oude C57BL / 6 muizen.
    2. Reinigen met 70% ethanol (in water) het haar van de gedode muizen en doorgesneden achter de oren met de rechte scherpe schaar naar het hoofd te verwijderen;
    3. Maak een middellijn incisie met behulp van een kleine chirurgische schaar om de huid over de schedel te snijden. Behulp van de tang, vouwen de twee plekken op de huid te expose de schedel.
    4. Met de kleine chirurgische schaar voeren twee kleine sneden aan de basis van de schedel en de beenderen te verwijderen onder de pons / merg (ventrale schedel). Ga verder door te trekken uit de temporele botten. Met dezelfde schaar een knip langs de schedel, vanaf de basis naar de bollen, zonder beschadiging van het oppervlak van de hersenen. Ook een knip tussen voorhoofdsbeenderen en de ogen, de verwijdering van de pariëtale botten vergemakkelijken. Met twee tang lostrekken de schedel door aan elk van de pariëtale botten naar buiten. Terwijl trekken, aandacht besteden aan de hersenvliezen, die de hersenen kunnen beschadigen wanneer de botten worden verwijderd.
    5. Zodra de schedel is verwijderd, schuift u de tang tussen de hersenen en de schedel volledig los van de hersenvliezen vertrokken. Til de hersenen uit de schedel. Snijd de optische zenuwen naar de hersenen los en uiteindelijk verzamelen van de hersenen in een buis met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    6. Houd de buis op ijs eend dezelfde procedure herhaald voor alle muizen.
  3. Dissectie van de SVZ, neurosphere vorming en instandhouding assays
    Gemiddeld aantal cellen x verdunningsfactor x 10 4

    Wanneer 10 4 geeft de omzetting van het totale volume van de hematocytometer kamer (totaal volume = 0,1 mm 3 -> 10-4 cm3 -> 10-4 ml). Bij het overwegen van de verdunningsfactor, zowel degene gedaan met CGM en met de vitale vlek moeten in overweging worden genomen. Als voorbeeld, als 160 cellen werden geteld in 4 hoekvelden, zal de uiteindelijke dichtheid (cellen / ml) van de celsuspensie worden:

    160/4 x 5 (verdunning met CGM) x 2 (verdunning met vitale vlek) x 10 4
    1. Zet een dissectie kap uitgerust met een dissectie microscoop.
    2. Reinig alle oppervlakken met 70% ethanol (in water) en spuiten met een anti Mycoplasma oplossing besmettingsgevaar verlagen.
    3. Dekkingde bodem van een bekerglas met een steriel gaasje (om geslepen instrumenten behouden) en vul deze met 70% ethanol (in water). Geniet van de beker twee paar pincetten, een paar micro-schaar en een chirurgisch mes.
    4. Plaats het hele brein op de hersenen-snijmachine matrix.
    5. Met twee scheermesjes uitvoeren van een coronale coupes 2 mm van de oogbol van de hersenen, behalve de optische geschriften, en 3 mm achter de vorige snede; en plaats het weefsel op een schone petrischaal.
    6. Onder de microscoop ontleden isoleren van de SVZ weefsel en snijd ze in 1 mm 3 stuks behulp iridectomiescharen. Herhaal dit voor alle hersenen.
      1. Meng goed de twee oplossingen (paragraaf 1.1.2) hierboven en filteren door een 0,22 urn filter onmiddellijk na de hersenen ontleed en de SVZ's zijn klaar om te worden verteerd.
    7. Breng de afdelingen in 30 ml 'Spijsvertering' oplossing, voorzichtig resuspendeer met a10 pipet ml en incubeer 30 minuten bij 37 ° C in 5% CO2. Elke 15 min schud de buis 2-3x.
    8. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten.
    9. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 ui CGM door eerst met een P1000 en vervolgens pipetteren met een pipet P200 (10-20x elk), tot het verkrijgen van een enkele celsuspensie.
    10. Neem de schorsing tot 5 ml met CGM en over te dragen aan een T25 cm 2 kolf.
    11. Na 5-7 dagen in vitro (DIV) neurosferen zal vormen. Verzamel de suspensie in een 15 ml buis en centrifugeer 10 minuten bij 150 x g.
    12. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 ui CGM.
      Distantiëren de neurospheres mechanisch door passage van de cellen 100-150x met een P200 pipet, tot het verkrijgen van een enkele celsuspensie en neem het tot CGM 1 ml.
    13. Verdun de celsuspensie, bijvoorbeeld 10 pi celsuspensie in 40 ul van CGM een 1:05 verdunning te verkrijgen en meng. Meng 10 ul van de verwaterdee celsuspensie met 10 ul van een vitale vlek en meng goed.
    14. Vul een hemocytometer telkamer met 10 ui van een 1:01 celsuspensie: vitale kleuroplossing. Afzonderlijk tellen het aantal levende (wit) en dode (blauwe) cellen in de 4 hoeken vierkantjes. Om het aantal cellen / ml te bepalen, gelden de volgende berekening:
    15. Hersuspenderen 2 x 10 5 cellen in 5 ml CGM en transfer naar een T25 cm 2 kolf;
    16. Herhaal secties 1.3.11-1.3.12 om de 4-5 DIV. Vanaf de tweede passage van expansie verder beoordeelt de cellulaire levensvatbaarheid van vitale kleuring uitsluiting en beginnen met het opbouwen van een continue groeicurve door bekleden NPCs bij klonale dichtheid (8.000 cellen/cm2), zoals beschreven 21. Houd het aantal cellen en herhaal de procedure om de 4-5 DIV. Om een ​​continue groei curve te genereren, gaat u als volgt te werk:
      NB: Om een ​​goede celpreparaat hebben, na 4-5 DIV bolletjes met een diameter van 150-200 um moeten hebben bereikt. Om een ​​goede schatting van t hebbenHij celdichtheid, is het belangrijk om een ​​optimale verdunningsfactor vinden om goed verdeeld, overlappende cellen hele hematocytometer. Idealiter zou er tussen 50-200 totale cellen. Bij het tellen alleen de cellen omvat in het vierkant zonder het aanraken van de grenzen moeten worden beschouwd. Ook de levensvatbaarheid van de cellen is van cruciaal belang voor een gezonde preparaat hebben. Belangrijk is, moet het hoogste van 90%. Een lineaire groeicurve is een indicator van een gezonde cel preparaat.
      1. Tel het aantal levende en dode cellen (bijvoorbeeld 1,3 x 10 6).
      2. Definieer de groei delen van het aantal levende cellen door het aantal cellen uitgeplaat (bijv. 1,3 x 10 6/2 x 10 5 = 6,5).
      3. Bereken het totale aantal cellen door de groei van het totale aantal cellen aanwezig in het vorige tijdstip (begin = 2 x 10 5) te vermenigvuldigen.
      4. Vermeld de gemiddelden7; standaarddeviatie van een lineaire trendlijn te bouwen.
    17. Vanaf passage 6, wordt de mechanische dissociatie vervangen door enzymatische dissociatie. Na centrifugatie bij 150 xg gedurende 10 minuten, verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 200 ui cel dissociatie oplossing aggregaat, resuspendeer 7-8x met P200 en incubeer 10 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
    18. Resuspendeer 7-8x met een P200 om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen en voeg 800 ul van CGM. Tel de cellen (zowel levende en dode) en hun levensvatbaarheid te bereiken. Resuspendeer 2 x 10 5 cellen in 5 ml CGM overdracht aan een T25 cm2 kolf.
  4. Virale transductie van NPC's voor in vivo cell tracking
    NB: Om de efficiëntie van virale transductie controleren, bouw een parallelle groeicurve met getransduceerde en nontransduced NPCs. Bovendien, de klonale efficiëntie, dat het absolute aantal neurosfeer vormende cellen aanwezig in een cel preparatentie of celcyclus analyse van DNA gehalte (met propidiumjodide, PI), kan worden gebruikt als verdere aanwijzingen van de status cel. Indien het percentage van geïnfecteerde cellen niet goed zou moeten zijn, kan het protocol van virale transductie een tweede keer worden herhaald met dezelfde populatie van cellen. Zodra het niveau van infectie is bevredigend en de groeicurve is vergelijkbaar met die verkregen met wild-type cellen kunnen getransduceerde NPC worden uitgebreid en / of getransplanteerd.
    1. Oogst de neurospheres en het verkrijgen van een enkele cel suspensie. Plaat de cellen bij hoge dichtheid (1,5 x 10 6 cellen in een T75 cm2 kolf) in 10 ml CGM.
    2. Na 12 uur voeg 3 x 10 6 TU / ml van een derde generatie lentivirale vector pRRLsin. PPT-hCMV ontworpen met de E. coli-afgeleide β-galactosidase (lacZ) of groen fluorescerend eiwit (GFP).
    3. 48 uur later, de oogst van de cellen, centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min en replate de cellen bij een 1:1 verhouding.
    4. Na3 passages in vitro controleren van de efficiëntie van de infectie. Flowcytometrie wordt vaak gebruikt om infectie werkzaamheid testen en bevredigend infectie wordt algemeen aanvaard in het traject van 75-95% positieve cellen. Controleer opnieuw de efficiëntie van de infectie na 3 passages verdere expansie van de handhaving van de merker expressie controleren.
  5. Neurosfeer bevriezing
    1. Oogst de neurospheres van een T25 cm 2 kolf, centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min, en gooi het supernatant.
    2. Resuspendeer de pellet met 1 ml ijskoud medium (CGM met 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
    3. Plaats de cryoflesjes bij -80 ° C in een ijskoude container.
    4. Na ten minste 24 uur zet de cellen om een cryobox en bewaar bij -80 ° C gedurende maanden of brengen vloeibare stikstof (N2) voor langere opslag.
  6. Neurosfeer ontdooien
    NB: Om de toxische effecten van langdurig contact o vermijdenf NPCs met DMSO, moet het ontdooiproces zo snel mogelijk.
    1. Verwijder de cryovial uit de -80 ° C / N 2 en houd het op droog ijs.
    2. Snel ontdooien de flacon op een waterbad, totdat bijna alle celsuspensie wordt ontdooid en slechts een klein stukje van iced schorsing blijft.
    3. Resuspendeer de celsuspensie met 5 ml voorverwarmde verse CGM.
    4. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten.
    5. Verwijder de bovenstaande vloeistof, resuspendeer zachtjes met 5 ml vers CGM en de plaat de celsuspensie in een schoon, onbehandeld T25 cm 2 kolf.
  7. 1.7) NPC karakterisering
    NB: De laatste wasbeurt PBS worden vervangen door 0,05% natriumazide-PBS schimmelgroei of verontreinigingen voorkomen en Dekglaasjes worden bewaard bij 4 ° C gedurende 2-3 weken.

    NB: Om vlekken voor intracellulaire markers voeg een permeabilizing agent om PBS in de blokkerende oplossing. Als de bron van het primaire antilichaam geit, runderserum Albumin (BSA) of serum andere dan geiten worden gebruikt.

    NB: Om vlekken voor intracellulaire markers gebruiken een permeabilizing agent in het primaire antilichaam oplossing.
    1. Plaats een 13 mm glazen coverslide op de bodem van een 24 wells plaat. Voeg 150 ul van bekledingsoplossing bovenop elke coverslide een kleine druppel maken. Incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
    2. Oogst de neurospheres en dissociëren om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen.
    3. Count levende cellen en verdun tot 80.000 cellen/35 ui verkrijgen. Verwijder het overtollige van de coating oplossing uit de coverslide door behoedzame aspiratie, en de plaat de 35 ul van celsuspensie.
    4. Incubeer 25 min bij 37 ° C, 5% CO2. Kijk snel op de contrast fase microscoop als de cellen zijn begonnen om zich te houden.
    5. Bereid het differentiatiemedium door mengen muis basaal medium met de geschikte supplementen (zie tabel 1) en antibiotica (Pen / Strep).
    6. Voeg 400 ul van differentiatie en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2.
    7. Na 3 DIV, verandering helft van het medium met verse differentiatiemedium.
    8. Na 6 DIV, verwijder het medium en een keer wassen met PBS. Onder een chemische kap verwijder de PBS en voeg 300 ul van voorverwarmde 4% paraformaldehyde (PFA) 4% sucrose. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder de PFA en was 3x met PBS.
    9. Om verder te gaan met immunocytochemie, verwijder de PBS en blok met PBS 10% normaal geit serum (NGS) (blokkerende oplossing), en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur.
    10. Verwijder de blokkering oplossing en voeg de gewenste primaire antilichaam verdund met PBS 1% NGS. Incubeer bij 4 ° CO / N of anders 120 minuten bij kamertemperatuur.
    11. Na de incubatie was 2x met PBS. Incubeer met de juiste secundaire antilichaam verdund met PBS 1% NGS. Incubeer 60 minuten bij kamertemperatuur.
    12. Wassen 2x met PBS en contra-vlek de kernen met 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:20.000 verdund met PBS permeabilisatie middel voor 3 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was tweemaal met PBS en eenmaal met gedestilleerd water.
    13. Doe een druppel montage medium op een glasvlies glijbaan en met een pincet monteer de coverslide met de cellen naar de montage medium. Voorzichtig op de coverslide te persen uit de overmaat montage medium. Laat de coverslide in het donker bij kamertemperatuur totdat het fixeermiddel is gedroogd en bewaard bij 4 ° C.

2. Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG)-geïnduceerde Experimentele Autoimmuniteit in C57Bl / 6 muizen

  1. Bereiding van emulsie
    1. Op een bekerglas bereidt een emulsie bestaande uit Incompleet Freund's adjuvans bevattende 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis [anders gedefinieerd als compleet Freund's adjuvans (CFA)] en 200 ug MOG (peptide 35-55), aangezien de totale emulsie per muis zal 300 pl.
      NB: kredietente controles van MOG-geïmmuniseerde muizen in CFA zijn muizen geïmmuniseerd met CFA alleen. De verwachte variantie van begin van de ziekte in MOG-geïmmuniseerde muizen is 11,3 (± 1,8) dpi.

      NB: het berekenen van de totale emulsie nodig, overweeg tweemaal zoveel volume als het aantal muizen te immuniseren. Glaswerk de voorkeur boven Plasticware om het afval van een deel van de emulsie te minimaliseren.
      1. Met een glazen injectiespuit met een 19 G naald mix voor ongeveer 30 min, altijd houden van de emulsie op ijs.
      2. Om te controleren of de emulsie klaar is, laat een kleine hoeveelheid emulsie op het water. De emulsie direct worden geïnjecteerd indien de druppel blijft zoals het is en niet verspreiden.
      3. Immuniseren de controlegroep van muizen met CFA alleen. Behandel experimentele muizen (MOG geïmmuniseerd) met MOG in CFA. De verwachte variantie van begin van de ziekte in MOG geïmmuniseerde muizen is 11,3 (± 1,8) dpi.
    2. Breng de 19 G-naald een 1 ml plastic spuit eennd aspireren de emulsie. Vermijd bellen, verandert de naald met een 25 G en laat de spuit op het ijs. Spuiten gevuld met de emulsie zijn klaar om te worden gebruikt en moeten worden bewaard op ijs voor een paar uur.
  2. Immunisatie
    1. Plaats de muizen (6-8 weken oud, vrouw) in een warming doos en wacht ongeveer 10 minuten, zodat de staart ader te verwijden.
    2. Transfer een muis uit de doos van de aarde om een ​​muis restrainer. Sluit de weerhouder elke beweging van de muis te voorkomen.
    3. Vul een 1 ml insulinespuit met 100 ul van pertussis toxine (5 ug / ml) vermeden te bellen. Injecteer langzaam de oplossing in de staart ader. Verwijder de naald en druk op voor een paar seconden met een stuk papier om het bloeden te dichten.
    4. Plaats de muis terug in de kooi en de procedure herhalen voor alle muizen.
    5. Verdoven een muis met constante inhalatie isofluraan (1-2%, 2 L / min) en injecteer 100 ul van de emulsie subcutaan op het niveauvan beide flanken en de basis van de staart (300 ul emulsie / muis). Verwijder langzaam de spuit, het vermijden van de lekkage van de emulsie.
    6. Markeer de muis met een oor puncher, plaats de muizen in de kooi en inchecken tot volledig herstel. Herhaal dit voor alle muizen.
    7. Na 48 uur (2 dagen na immunisatie, dpi) herhalen sectie 2.2.3.
  3. Gedragsanalyse van EAE muizen
    1. Vanaf 5 dpi, wegen de muizen dagelijks en monitoring van de motorische prestaties met de omvang scoresysteem beschreven in Tabel 1.

3. Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in de staartader (iv)

  1. Celpreparaat
    1. Oogst neurospheres door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 minuten.
    2. Verwijder het supernatant en voeg 200 ul cel aggregaat dissociatie oplossing. Incubeer 10 min bij 37 ° C, 5% CO2.
    3. Voorzichtig resuspendeer 10-12x (avoiding bellen) met een P200 tot het verkrijgen van een enkele celsuspensie en naar 800 pl met basismedium zonder Ca2 + en Mg2 +.
    4. Tel de cellen met behulp van een vitale vlek levensvatbaarheid van de cellen assay en verdun de ophanging met basaal medium zonder Ca 2 + en Mg 2 + tot een uiteindelijke dichtheid van 10 6 cells/150 pi verkrijgen. Houd de celsuspensie op ijs tot gebruik.
  2. NPC iv injectie
    NB: De ideale dissociatie in enkele celsuspensie en de afwezigheid van luchtbellen zijn twee belangrijke aspecten te overwegen om het risico van een van beide bosjes / aggregaten verminderen vs embolie vorming die kan leiden tot veneuze occlusie en de daaruit voortvloeiende dood.
    1. Bij de piek van de ziekte (16-18 dpi), wegen en scoor de muizen. Verdeel de muizen op basis van hun score om homogene groepen.
    2. Leg de muizen in een warming doos en wacht ongeveer 10 minuten, zodat de staart ader te verwijden. Transfer een muis uit de doos van de aarde om een ​​muis restrainer. Sluit de weerhouder elke beweging van de muis te voorkomen.
    3. Vul een 1 ml insulinespuit met 150 ul van celsuspensie en zorg ervoor dat alle luchtbellen te verwijderen. Injecteer langzaam de oplossing in de staart ader. Verwijder de naald en druk op voor een paar seconden met een stuk papier om de stekker van de bloeding (figuren 6A en 6B).
    4. Plaats de muis in de kooi en inchecken tot herstel. Herhaal deze procedure voor alle muizen.

4. Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in de Cisterna Magna (ICV)

  1. Celpreparaat
    1. Oogst NPCs door centrifugeren bij 300 g gedurende 10 minuten.
    2. Verwijder het supernatant en voeg 200 ul cel aggregaat dissociatie oplossing. Incubeer 10 min bij 37 ° C, 5% CO2.
    3. Voorzichtig resuspendeer 10-12x met een P200 tot het verkrijgen van een cell schorsing en duren tot 800 ul met basaal medium zonder Ca 2 + en Mg 2 +.
    4. Tel de cellen en verdun de ophanging met basaal medium zonder Ca 2 + en Mg 2 + om de gewenste cel dichtheid te verkrijgen. Houd de celsuspensie op ijs tot gebruik.
  2. 4.2) NPC ICV injectie
    1. Bij de piek van de ziekte (16-18 dpi), wegen en scoor de muizen. Verdeel de muizen op basis van hun score om homogene groepen.
    2. Plaats de muis op een stereotaxische inrichting onder voortdurende inhalatie isofluraan (1-2%, 2 L / min). Zet de kop van de muis met het oor bars. Stel vervolgens zowel de mond en neus stukken. Zorg ervoor dat de kop van de muis is vlak en vast.
    3. Veeg de kop van de muis met Povidon-jood (PVP-I) en een insnijding aan de huid in het achterste gedeelte van de kop gesneden om de schedel bloot te leggen.
    4. Met behulp van een micromanipulator, steek de punt van een microliter spuit in de spleet tussen het achterhoofd en de atlas wervel door de intacte spieren en ligamenten in de middellijn aan de achterkant van de nek. Het gebogen gedeelte van de naald wordt bewaard in nauw contact met het inwendige oppervlak van het achterhoofd over de gehele lengte, zoals beschreven 22.
    5. Duw de naald langzaam en wacht een paar seconden. De aandrijving is leren om het gevoel van de naald zijn "vastgehaakt" naar de muis schedel, voor aanvang injecteren van de cellen bereiding herkennen. Injecteer langzaam het volume van cellen (binnen 3-5 min). Laat de naald op zijn plaats voor een extra paar seconden na de injectie en verwijder langzaam de spuit.
    6. Hechten van de huid en zet de muis in een herstel kooi tot volledig herstel.

5. Weefsel bewerken

  1. Diep verdoven de muizen met een mengsel van 0,5 ml ketamine (100 mg / ml), 0,25 ml xylazine (23.32 mg / ml) en 4,25 ml steriel water en transcardically perfuseren, wverassen met een zoutoplossing-EDTA en bevestiging met 4% PFA. Verwijder zowel de wervelkolom en hersenen en postfix in 4% PFA gedurende 12 uur bij 4 ° C. Was het weefsel in PBS, verwijder het ruggenmerg uit de botten en laat het weefsel ten minste 48 uur in 30% sucrose (in PBS) bij 4 ° C. De weefsels insluiten in optimale snijtemperatuur (oktober) verbinding en snap bevriezen met vloeibare stikstof, zoals beschreven 2.
  2. Gebruik een microtoom om het weefsel te snijden 10-12 micrometer dikke plakken.
  3. Als alternatief insluiten vers weefsel in agarose en snijd weefsel met behulp van een vibratome 50-80 micrometer dikke plakken.
  4. In beide gevallen, incubeer O / N bij 37 ° C in 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β D-galactopyranoside (X-gal) oplossing nucleaire β-galactosidase te detecteren.
  5. Recut gedeelten met β-gal + cellen in 5 urn plakjes en dubbele kleuring met antiglial fibrillair zuur eiwit (GFAP) voor astrocyten (50 ug / ml), antineuronal nucleair antigen (NeuN) voor neuronen (1 &# 956, g / ml) en antiNestin ongedifferentieerde neurale cellen (10 ug / ml).
  6. Ga te werk zoals beschreven in de paragrafen 1.7.11 en 1.7.12. Voor meerdere kleuringen zorg ervoor om secundaire antilichamen geconjugeerd met verschillende fluoroforen gebruiken.
  7. Voor weefsels die GFP-gelabelde cellen doorgaan zoals beschreven in de stappen 5,1-5,3 en ga verder met de meervoudige kleuringen.
  8. Voeg enkele druppels montage medium om de dia's en dek af met een tissue dekglaasje.
  9. Voor secties gekleurd met biotine geconjugeerde antilichamen een oplossing van avidine biotine complex (ABC oplossing, zie tabel 2) en laat in agitatie gedurende 45 minuten.
  10. Incubeer de schijfjes 5 minuten met 1% H 2 O 2 de activiteit van endogeen peroxidase te blokkeren.
  11. Twee keer wassen met PBS.
  12. Incubeer met ABC oplossing gedurende 1 uur bij KT.
  13. Twee keer wassen met PBS.
  14. Incubeer met 3,3 '-diaminobenzidine-oplossing en 0,3% H2O 2. Monitor de reactie under een microscoop en wassen met PBS zodra het segment begint steeds bruin (gewoonlijk ongeveer 5-10 min).
  15. Twee keer wassen met PBS en ga verder zoals beschreven in stap 5.7.

Uitgebreide lijst van materialen en reagentia wordt getoond in Tabel 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NPC afleiding en karakterisering
SVZ dissecties uitgevoerd op pools (n = 5-7 muizen / pool) van 6-8 weken oude C57BL / 6 muizen door middel van mechanische en enzymatische dissociatie (Figuur 1A). Na een paar dagen kweken in CGM, vrij zwevende neurosferen beginnen vormen (Figuren 1A en 1B). Primaire werelden worden verzameld en mechanisch gepasseerd om de 4-5 DIV. Bij passage, zijn aantallen levende en dode cellen vastgesteld en cumulatief aantal cellen uitgezet om een groeicurve (figuur 1C) te genereren. Dit geeft een indicatie van de voortplantingssnelheid, waardoor een indirecte parameter om de stabiliteit in de wereld van de NPC voorbereiding evalueren. Wanneer prolifererende als neurosferen, NPC express markers van mitotische activiteit (fosfo-histon H3, PHH3, 5 ug / ml) en ongedifferentieerde neurale cellen (bijv. Nestin) (Figuur 2A). Ongedifferentieerde NPC's die moeten therapeutisch e zijnfficacious in EAE na transplantatie celoppervlak adhesie moleculen die CD44 (5 ug / ml), de α4 subeenheid van VLA-4 (10 ug / ml) (fig. 2F) bevatten moeten drukken. Wanneer plated onder geschikte omstandigheden differentiatie, NPC expressie merkers typisch drie neurale lineages, (figuur 2B), zoals astroglial marker GFAP (figuur 2C), de neuronale merker microtubule geassocieerd proteïne-2 (MAP-2, 5 ug / ml ) (Figuur 2D) en oligodendrogliale markers O4 (5 ug / ml) en myeline basisch eiwit (MBP, 10 ug / ml) (fig. 2E), hetgeen bevestigt dat NPC zijn multipotent naar de drie neurale lijnen. Om de identificatie van getransplanteerde cellen in vivo te bevorderen, worden NPCs getransduceerd met lentivirussen ontworpen om stabiel tot expressie reportergenen zoals GFP. Getransduceerde NPCs uitdrukken GFP zowel delende neurosferen (Figuren 3A en 3C) en bij differentiatie in vitro upon groeifactor intrekking (Figuur 3B). Om de efficiëntie van transductie controleren, wordt de expressie van GFP geanalyseerd door flowcytometrie, begint al na 3 passages cel transductie (dat is waardoor voldoende robuuste expressie van het ingebracht transgen zijn op eiwitniveau). Bij de toepassing van de derde generatie lentiviruses om NPC's in vitro, we consequent waarnemen> 90% van de cellen die een hoge mate van GFP over meerdere onafhankelijke experimenten (figuur 3C), met noch openlijke toxiciteit noch veranderingen in proliferatie, bij vergelijking van de groeicurves van wild-type en Lenti-GFP getransduceerde NPCs (Figuur 3D).

Chronische EAE inductie
EAE is een van de best gekarakteriseerde modellen MS, aangezien recapituleert meeste pathologische en klinische gebeurtenissen MS. Immunisatie van C57Bl / 6 muizen met MOG35-55 leidt tot de ontwikkelingsdoelent van een chronische vorm van EAE. Bij het ​​naderen van het begin van de ziekte (11,3 ± 1,8 dpi) tijdens de inductiefase (preklinische), MOG geïmmuniseerde muizen beginnen met afvallen (Figuur 4A). Aan het begin van de effector / invasie fase (piek klinische, 16,8 ± 3,2 dpi) EAE muizen bereiken de top van de ziekte (score 3,5 ± 0,7), en kort daarna piek tonen zij geleidelijk en gedeeltelijk herstel die uiteindelijk stabiliseert tijdens chronische fase (stabiele klinische) van rond 30 en volgende dpi (2,8 ± 0,9) (Figuur 4B). Talrijke studies, waaronder enkele onderzoeken EAE door een intravitale microscopie 23 of magnetische kernspinresonantie 24, gecombineerd met in vivo weefsel pathologie, geïdentificeerd in de piek van de effector / invasie fase (16-22 dpi) het ideale tijdsspanne (WoO) waarin systemische experimentele therapieën te voeren met stamcellen bedoeld om de chronisch ontstoken EAE CNS voeren en te beschermen tegen secundaire dAmage.

NPC injectie
Syngene NPCs systemisch geïnjecteerd in EAE muizen (Figuur 6) zijn vrijwel uitsluitend in perivasculaire gebieden van CNS-letsel, zowel in de hersenen (Figuur 5A) en het ruggenmerg (figuren 5B-D), tot 45 dagen na transplantatie (dpt) beschreven 5. iv. geïnjecteerd NPCs voorkeur behouden een onvolwassen, Nestin + (figuur 5C) fenotype, terwijl enkele NPC's verhuizen van de perivasculaire gebied uiten NeuN (Figuur 5D). Van de nota, NPCs iv geïnjecteerd in gezonde controles niet aan de CNS in te voeren via de vasculaire route (Figuur 5E). Na NPC iv injectie zijn grote aantallen geïnjecteerd NPCs zich op het niveau van niet-CNS organen zoals de lever, darmen, milt, longen en nieren, maar niet het hart, al 10 dpt (Figuur 5F). Non-CNS accumulerende NPC's zijn volledig uit Thes gewist e perifere organen met 30 dpt (figuur 5G).

Figuur 1
Figuur 1. Isolatie van NPCs uit de SVZ van volwassen muizen en genereren van stabiel expandeerbare NPC lijnen. Een schematische weergave van de belangrijkste kritische stappen van het genereren van stabiel uitzetbare en bereiding van injecteerbare muis NPCs. B, Neurosferen in vitro. C , NPC gekweekt als neurosferen worden gepasseerd om de 4-5 dagen. Aantallen levende en dode cellen worden verzameld en cumulatief aantal cellen uitgezet om een ​​groeicurve te genereren. De schaal bar in B is 200 micrometer. Gegevens in C zijn gemiddelde cumulatieve aantal cellen ± SD (n = 3).

guur 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2.jpg "/>
Figuur 2. NPCs karakterisering. A, delende muis neurosferen drukken de PHH3 kern histon-eiwit (groen), en het type VI intermediaire filament eiwit Nestin (rood). BE, Na 6 DIV in differentiatie omstandigheden, NPC's zijn multipotent richting astroglial (GFAP, rood in C), neuronale (MAP-2, groen in D) en oligodendrogliale (O4, groen in E, en MBP, rood in E) geslachten. Kwantificering van GFAP-, MAP-2-, en O4-expressie cellen op 6 DIV na NPC differentiatie in vitro worden getoond in B. Gegevens in B zijn als gemiddelde ± SD% (n = 3). De schaal bars in CE zijn 50 urn. F, Flow cytometrie analyse van de expressie van de belangrijkste celoppervlak adhesiemoleculen reguleren leukocyte extravasatie in muis neurosferen. figuur 2F is overgenomen uit Pluchino et al.. 2

Figuur 3
Figuur 3. Transductie van NPCs met lentiviruses uiten reporter genen (bijv. GFP. A en B, fase contrast beelden van neurosferen (A) en differentiëren NPCs (B) die zijn getransduceerd met een 3 e generatie Lenti-GFP vector. Flowcytometrieanalyse van de NPCs in A. C, wilde soort (niet getransduceerd) en Lenti-GFP getransduceerde NPCs gekweekt als neurospheres worden gepasseerd om de 4-5 dagen. Nummers van levende en dode cellen worden verzameld en cumulatief aantal cellen uitgezet om een groeicurve te genereren. De schaal bar inA en B is 200 urn. Gegevens in C zijn gemiddelde cumulatieve aantal cellen ± SD (n = 3).

Figuur 4
Figuur 4. Functionele karakterisatie van chronische EAE. Een, Daily massabewakingstoestellen in MOG-en CFA-geïmmuniseerde C57Bl / 6 muizen over een totale follow-up van 40 dpi. B, Daily EAE score monitoring MOG-en CFA-geïmmuniseerde C57Bl / 6 muizen over een totale follow-up van 40 dpi . Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD getallen (n = 10 muizen / groep).

Figuur 5
Figuur 5. Systemisch geïnjecteerd NPCs migraten in het parenchym van EAE muizen. AE, X-gal kleuring van vibratome-snede (70 urn) hersenen (A) en het ruggenmerg (B) weefselcoupes van EAE muizen iv geïnjecteerd met syngene NPC, geeft getransplanteerde β-gal + cellen ( blauwe cellen) aanhoudende binnen perivasculair CNS gebieden tot aan het einde van de klinische follow-up (106 dpi). C, β-gal + iv. geïnjecteerd NPCs (blauw) aanhoudende binnen perivasculair CNS gebieden behouden een Nestin + (bruin) fenotype. D , Paar migreren NPCs uiten NeuN + (bruin), zolang zij uit de perivasculaire verplaatsen. E, X-gal kleuring in een representatieve ruggenmerg gedeelte van een-sham behandeld EAE muis. . Schaalbalken, 20 urn FG, analyse van andere dan de CNS weefsels blijkt dat ic -. Of iv. Geïnjecteerd NPCs (blauwe cellen) bereikt bijna alle organen (. Bijv. longen, lever, milt, hart, darm, nier) verstandhin 10 dpt (F), maar van dezelfde organen worden gewist door 30 dpt (G). Figuren 5A-E is overgenomen uit referentie 5, terwijl de figuren 5F-G is overgenomen uit Pluchino et al.. 2

Figuur 6
. Figuur 6 Schematische weergave van het protocol voor systemische injectie van NPCs in muizen met EAE Hoofd kritische stappen van de systemische injectie van NPCs in muizen met EAE:. Uit de bereiding van injecteerbare CAM uiten enkele cel los NPCs de celkweek kamer (A) , de injectie in de staartader van muizen EAE bij de piek van de effector / invasie ziekte fase (B), naar de in vivo detectie van de geïnjecteerde NPCs die gerichthet CNS (C), om de in vivo weefsel pathologische studies waarbij de studie van de mechanismen van plasticiteit therapeutische ingespoten NPCs (D). In D, groene cellen in zijn oligodendrocyten, donkerblauw cellen axonen, worden lichtblauw getransplanteerd NPCs, oranje cellen zijn astrocyten, en rode bloedcellen zijn endotheelcellen.

<td> 2.5
Partituur Locomotorische Responses
0 Normale muis. Geen duidelijke tekenen van de ziekte van
1 Limp staart: volledige slapheid van de staart, en de afwezigheid van curling op het puntje van de staart als een muis wordt opgepikt
1.5 Zwakte van de achterpoten: de muis toont incidentele en kortdurende uitschakelingen bij het lopen op een waggelende gang
2 Limp staart en zwakte van de achterpoten: bij plaatsing op zijn rug, kan de muis niet wenden tot zijn normale positie
Gedeeltelijke verlamming: de muis kan niet meer achterpoten gebruiken om romp houding te handhaven of te lopen, maar kan nog steeds verplaatsen van een of beide achterpoten tot op zekere hoogte, voorpoten blijven onaangetast
3 Volledige verlamming van de achterpoten: totaal verlies van beweging in de achterpoten. De muis sleept zich alleen op zijn voorpoten, die onverlet blijven. Muizen in deze fase worden bepaald voedingsmiddel op de kooi vloer, lange sipper buizen en dagelijkse subcutane injectie van hydraterende oplossingen om uitdroging te voorkomen. Als muizen ontwikkelen zweren of huidletsels die niet herstellen met de behandeling, zullen zij op humane wijze gedood
3.5 Voorpoot zwakte: wanneer plaats op een verticaal raster, de muis is niet in staat om te klimmen en valt langzaam
4 Stervende toestand
5 Muis dood aangetroffen of geruimd volgens humane eindpunten

Table 1. Vijf stadium omvang van de klinische symptomen en opstijgende verlamming in EAE muizen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Somatische stamceltherapieën zijn in opkomst als een van de meest belovende strategieën voor de behandeling van chronische inflammatoire aandoeningen van het CZS zoals MS2 11. Hoewel de mechanismen die de ondersteuning van hun therapeutische effecten moeten nog volledig worden opgehelderd, is de aanzienlijke impact van NPC transplantatie in verschillende experimentele modellen van neurodegeneratieve ziekten aanleiding tot de ietwat provocerende overtuiging dat stamcellen kan binnenkort worden toegepast in menselijke studies gegeven. Echter, voordat wordt overwogen om potentiële menselijke toepassingen van dergelijke innovatieve therapieën moeten we een aantal belangrijke problemen geconfronteerd en pakken een aantal onbeantwoorde vragen, zoals de identificatie van de ideale stamcel bron voor transplantatie (autoloog versus allogene, pluripotent vs multipotente) en de beste route van toediening.

Neurodegeneratieve ziekten verschillen in hun pathophysiologies, met een aantal ruimtelijk beperkt (bijv.. Ruggenmerg injury, beroerte), terwijl de andere wordt gekenmerkt door een ruimtelijke temporele verspreiding (bv. MS). Het ontleent de focale injectie van (stam) cellen een geschikte behandeling voor de eerste kunnen, terwijl zij inadequaat of eenvoudig haalbaar voor de laatste, waarbij de aanwezigheid van meerdere gebieden van hersenbeschadiging vormt een extra uitdaging te overwinnen zijn.

Consistente onderzoek heeft aangetoond dat intraveneuze levering geldig (lage invasief) protocol voor mobiele toediening, ondersteund door de intrinsieke vermogen van stamcellen om het milieu betekenis gebruikt en huis naar de plaats (en) van schade vertegenwoordigen. Echter vertaling van systemische therapieën NPC in klinieken nog gehinderd door enkele beperkingen, zoals de mogelijke accumulatie van getransplanteerde cellen in perifere niet-CNS organen (bijv. longen, milt, lymfeknopen en nieren) die al dan niet gebieden lokale ontstekingsreacties in vivo. Hoewel deze niet-specifieke accumulatie ingespoten NPCs uit de doelgroep CNS wordt snel opgelost bij muizen met chronische EAE2, er sprake is van langdurige NPC persistentie (of in sommige gevallen exclusieve gerichtheid) op het niveau van de secundaire lymfoïde organen (bijv.. lymfeklieren en de milt) na systemische injectie in muizen met relapsing EAE5 19,20. Het feit dat grote aantallen van getransplanteerde NPC's circuleren in de richting van niet-CNS organen creëert een verwateringseffect, onvermijdelijk het absolute aantal NPC's verminderen in het CZS. Interessant, systemisch geïnjecteerd NPCs zijn therapeutisch effectief (bijv. via immuun regulerende acties), zelfs wanneer uitsluitend accumuleren uit de CNS 19,20. En de algehele therapeutische effect van geïnjecteerde NPC gericht het CZS slechts 5 of lymfeklieren slechts 19 vergelijkbaar. Dit kan gedeeltelijk te wijten aan een intrinsieke plasticiteit van de cellen, die verschillend reageren op de moleculaire componenten van de surrounding micromilieu. Met name, indien enerzijds getransplanteerd NPC kan de aanwezigheid van inflammatoire cytokines voelen en oefenen hun therapeutisch effect door immuun modulerende mechanismen 16, anderzijds kunnen zij in contact komen met vijandige microenvironments uiteindelijk leidt tot de vorming van tumoren 25,26. Om deze redenen, de voorkeur gaat thans geïnjecteerde NPCs concentratie in het CZS. Als zodanig is de intrathecale toediening (via een lumbale of cisternal route) is nog steeds de meest geaccepteerde prospectieve wijze van toediening in klinische studies. Echter, de multifocaliteit en pathologische heterogeniteit van MS laesies de doeltreffendheid van deze benadering beperken.

Hier een efficiënt protocol te isoleren, te onderhouden en te karakteriseren muis neurale voorlopercellen uit volwassen SVZ en achtereenvolgens, hoe systemisch (iv zowel en i.c.v.) te injecteren NPCs in muizen met chronische EAE, een van de meest stu beschrijven westierf modellen van MS. Hoewel relatief eenvoudig en duidelijk, deze protocollen presenteren een aantal kritische stappen die moeten in aanmerking worden genomen. Op het eerste, is het verplicht om een ​​stabiel uitbreidbaar en gezonde celpreparaat verkrijgen. Zoals beschreven in het hele protocol, kan de stabiliteit van de cellen indirect worden afgeleid door te kijken naar hun groeisnelheid. Idealiter zou neurosferen een diameter van 150-200 urn bereikt om de 4-5 DIV en het percentage celdood bij passages moet zeer laag (minder dan 10%) zijn. Ook moet neurosferen een compacte en regelmatige ronde vorm presenteren op de microscoop. De besmetting met lentivirussen kunnen het voortbestaan ​​en de stabiliteit van de cellen. Om een optimale infectie krijgen, is het verplicht om een titratie van het virus voldoende belang te verkrijgen 3 x 10 6 TU / ml. Inderdaad, terwijl enerzijds een lage hoeveelheid virus leidt tot een klein percentage van geïnfecteerde cellen, anderzijds het gebruik van een grote hoeveelheid would waarschijnlijk leiden tot een toxisch effect (sterk afhankelijk van het gen besmet). NPCs geïnfecteerd kunnen worden meerdere malen met integratie virussen, indien de resultaten van de eerste transductie leiden tot lage percentage transgene positieve levensvatbare cellen. Het is altijd een goede gewoonte om intra experimentele vergelijking van de stabiliteit en leefbaarheid parameters met wild-type, nontransduced hebben, controleert NPCs. Voor de inductie van chronische EAE, het meest problematische deel voorgesteld door de bereiding van de emulsie. Zoals beschreven moet glaswerk en ijs gebruik te allen tijde. De bereiding van de emulsie duurt 30-45 min, en kan bereid worden geacht te injecteren wanneer deze niet verspreiden bij een val op het water. Als de emulsie verdwijnt in het water, dit betekent dat het nog niet klaar is en moet verder mengen.

Goede nauwkeurigheid tijdens iv injectieprocedure bij de cel toediening kritisch. Ten eerste, is het uiterst belangrijk om te hebben alsIngle celsuspensie, de injectie van geaggregeerde cellen de aderen van de geïnjecteerde muizen blokkeren en leiden tot de onmiddellijke dood. Om de juiste positionering van de naald in de ader te verzekeren, is het een goede gewoonte om te zuigen met de spuit enkele microliter bloed. In het geval van geen bloed komt in de spuit, moet de exploitant langzaam de naald naar achteren of naar voren totdat de juiste locatie wordt gevonden. Alleen op dit punt kan de celsuspensie langzaam worden geïnjecteerd. Belangrijk is dat de exploitant moet over het algemeen niet worden verplicht om druk uit te oefenen op de spuit, omdat de vloeistof gemakkelijk moet vloeien in de ader. Een onjuiste injectie zou onvermijdelijk leiden tot een subcutane zwelling overeenkomt met de injectieplaats.

Het is vermeldenswaard dat in de zeer nabije toekomst systemisch geïnjecteerd NPCs2, 27, genetisch gemodificeerd of niet, kan zichzelf vertegenwoordigen een therapeutische optie, evenals het verstrekken van een belangrijk instrument voor het leveren van immuun modulatory en / of neuroprotectieve drugs en ​​pro remyelinisatie agenten direct in de CNS 28. Daarom, terwijl een aantal beperkingen met betrekking tot de systemische toediening van NPC's bestaan, beide iv. en ICV. routes kan uiteindelijk vertegenwoordigen geldige alternatieve therapeutische benadering in die ziekten waarbij het brandpunt injectie van de cellen van de gouden standaard protocol van de behandeling niet kan vormen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs danken Jayden Smith voor kritisch beoordelen en bewijs het bewerken van het manuscript. Dit werk heeft steun van de National Multiple Sclerosis Society (NMSS, gedeeltelijke subsidies RG-4001-A1) ontvangen, de Italiaanse Multiple Sclerose Vereniging (AISM, verlenen 2010/R/31), het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), de European Research Council (ERC) in het kader van de ERC-2010-StG subsidieovereenkomst geen 260.511-SEM_SEM en de Europese Gemeenschap (EG) 7e Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst n * deg; 280772 - Ione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
EBSS Sigma E2888
L-Cystein Sigma Aldrich C7352
Papain Worthington 30H11965
EDTA Fisher Scientific D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult proliferation supplements Stem Cell Technologies 05701
Heparin Sigma H3393
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B-1000
Epidermal growth factor Peprotech AF-100-15-1000
Pen/Strep Invitrogen 1514012
Matrigel (coating solution) BD Biosciences 354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) Stem Cell Technologies 05704
Accumax eBioscience 00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg PAA Laboratories H15-011
Myco trace PAA Laboratories Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum PAA Laboratories B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether Sigma Aldrich T8787
Mouse anti Nestin Abcam ab11306
Rabbit anti GFAP DAKO 203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)  Abcam ab14955
Rabbit anti MAP-2 Abcam ab32454
Rat anti MBP AbD SEROTEC MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 Millipore MAB345
DAPI Invitrogen D1306
Mounting solution DAKO S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete Sigma Aldrich F5506
Mycobacterium tuberculosis DIFCO H37Ra
MOG(35–55)  Espikem
Pertussis toxin List Biological Laboratories 181
Tissue processing
Iris scissor straight Fine Sciences Tools 14060-09
Blunt/bended forceps Fine Sciences Tools 11080-02
Brain slicer Zivic Instruments BSMAS005-1
Surgical blades Swann-Morton 324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar) Boehringer Ingelheim 01LC0030
Xylazine (Rompun) Bayer 32371
Stereotaxic frame KOPF Model 900
Hamilton syringe Hamilton 7762-04
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
  3. Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
  4. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
  5. Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
  6. Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
  7. Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
  8. Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
  9. Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
  10. Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
  11. Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
  12. Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
  13. Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
  14. Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
  15. Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
  16. Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
  17. Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
  18. Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
  19. Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
  20. Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
  21. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  22. Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
  23. Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
  24. Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
  25. Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
  26. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
  27. Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
  28. Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).

Tags

Immunologie Somatische neurale stamcellen / voorlopercellen neurodegeneratieve aandoeningen regeneratieve geneeskunde multiple sclerose experimentele auto-immune encefalomyelitis systemische toediening intraveneuze intracerebroventriculaire
Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donegà, M., Giusto, E.,… More

Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter