Summary
ההשתלה של תאי גזע עצביים / אב (NPCs) מחזיקה בהבטחות גדולות בתחום הנוירולוגיה רגנרטיבית. המשלוח המערכתי של NPCs הפך לפרוטוקול יעיל, נמוך פולשנית וטיפולית יעיל מאוד כדי לספק תאי גזע במוח ובחוט השדרה של מכרסמים וקופים לא אנושיים מושפעים מניזק דלקתי כרוני ניסיוני של מערכת העצבים המרכזית.
Abstract
תאי גזע עצביים / מבשר (NPCs) הם מקור תאי גזע מבטיח לגישות השתלה המכוונות לתיקון מוח או שיקום בנוירולוגיה רגנרטיבית. הוראה זו עלתה מחומר הראיות רבות שתיקון המוח מושגת לאחר השתלת NPC מוקד או מערכתית בכמה מודלים פרה של מחלות נוירולוגיות.
נתוני ניסוי אלה זיהו את מסלול משלוח תא כאחד המכשולים העיקריים של טיפולים בתאי גזע לטיפול במחלות המוח משקמים שדורשת הערכה דחופה. השתלת תאי גזע intraparenchymal מייצגת גישה הגיונית לאלו פתולוגיות מאופיינות בנגעים במוח מבודדים ונגישים, כגון פגיעות בעמוד השדרה ומחלת פרקינסון. למרבה הצער, עיקרון זה הוא גרוע החלים על תנאים מאופיינים בטבע multifocal, דלקתי והפיץ (שניהם בזמן ובמרחב), כוללים טרשת נפוצה (MS). ככזה, מוח מיקוד על ידי systמשלוח NPC Emic הפך פרוטוקול פולשנית וטיפולי יעיל נמוך כדי לספק לתאי המוח וחוט השדרה של מכרסמים וקופים לא אנושיים מושפעים מניזק דלקתי כרוני ניסיוני של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
זו שיטה החלופית של משלוח התא מסתמכת על pathotropism NPC, במיוחד היכולת המולדת שלהם (i) לחוש את הסביבה באמצעות מולקולות הידבקות תא פונקציונליות וקולטניים ציטוקינים וchemokine דלקתית; (Ii) לחצות את המחסומים דולפים אנטומיים לאחר תוך ורידי (iv). או intracerebroventricular הזרקה (ICV); (Iii) מצטבר ברמה של אתר מרובה perivascular (ים) של נזק מוח וחוט השדרה דלקתי; וכן (iv) להפעיל תזונתי רקמה מדהימה ואפקטי רגולציה חיסוניים על תאי יעד מארח שונים in vivo.
כאן אנו מתארים את השיטות שפיתחנו לiv. ו<em> משלוח ICV של NPCs syngeneic בעכברים עם Encephalomyelitis הניסיוני אוטואימוניות (EAE), כמודל של פגיעה במיאלין הדלקתית של מערכת העצבים המרכזית הכרונית, ולדמיין את אספקת תאי גזע המערכתית כטכניקה חשובה למיקוד סלקטיבי של המוח המודלק בנוירולוגיה רגנרטיבית.
Introduction
ראיות חזקות שקמה במחקרי vivo המעידים על היעילות הטיפולית של השתלת תאים סומטיים גזע עצביים / מבשר (NPCs) במודלים של בעלי חיים של הפרעות במערכת העצבים המרכזית 1-8. עם זאת, מספר הסוגיות הנוגעות לאספקה של תאי גזע למארח דורש שיקול דעת לפני שניתן לתרגם את תוצאות ניסויים אלו ליישומים קליניים. המשוכה במיוחד משמעותית לקראת הפיתוח של טיפולים (nonhematopoietic) משקמים בתאי גזע לטיפול במחלות multifocal, דלקתיות כרוניות במוח היא זיהוי של המסלול האידיאלי של הזרקת NPC. הבנה מוצקה של הפתופיזיולוגיה של המחלה ממוקדת (מוקד או multifocal; ניווניות דלקתיות או עיקריות ראשוניות), וניתוח זהיר של נושאי היתכנות וסיכונים הקשורים בטכניקות המסירה הן בזיהוי הפרוטוקול האופטימלי למסירה בתאי גזע.
בעוד המוקד (
הבטחה גדולה יצאה מהתצפיות שNPCs למקד את הגידול תוך גולגולתי (למשל. גליומה) בעכברים כאשר הוא מוזרק intravascularly מחוץ CNS9. בעקבות זאת זרעבראיות vivo של pathotrophism תאי גזע 10, נתונים נרחבים שנצברו בנוגע להיתכנות והיעילות טיפולית של ההשתלה המערכתית של NPCs בחיות מעבדה עם Encephalomyelitis הניסיוני אוטואימוניות (EAE), כמודל לניזק במערכת העצבים המרכזית דלקתי, באמצעות או דרך הווריד (Iv) או intracerebroventricular הזרקת NPC 1,2,5,6,8 (ICV.) .. הראנו ראשון שזה תלוי ביכולת של NPCs המושתל למקד ולהזין את מערכת העצבים המרכזית המודלקות, ולעסוק בין תאית מרובה לאחר מכן תוכניות תקשורת בתוך microenvironments ספציפי in vivo 11. על מנת למקד במיוחד במערכת העצבים המרכזית, NPCs מועברים ישירות לתוך נוזל השדרה מחזור (CSF) על ידי הזרקת ICV, או למחזור הדם באמצעות הזרקת iv. ברגע שנכנס גם למחזור הדם או CSF, NPCs מושתל באופן פעיל באינטראקציה עםדם המוח (BBB) או נוזל השדרתי דם מחסומים (BCSFB) והזן את parenchyma מערכת העצבים המרכזית. אינטראקציה זו בין שתל NPC וBBB (או BCSFB) מוסדרת על ידי קבוצה מסוימת של מולקולות פני השטח NPC הידבקות תא (מצלמות) והנחייתם של הביטוי של רמות גבוהות של Counter-ligands CAM על תאי אנדותל / מופעלים ependymal 12-14. דוגמאות למצלמות אלה כוללות את הקולטן לhyaluronate, CD44, ומולקולת ההידבקות בין תאית (ICAM) -1 אנטיגן יגנד מאוחר מאוד (VLA) -4 5,15,16 (כי, בלויקוציטים, אחראים של האינטראקציה עם ependymal הופעל ותאי האנדותל), ולאנטיגן הרבה יותר נמוך במידת ימפוציטים הקשורים פונקציה (LFA) -1 ויגנד P-גליקופרוטאין selectin (PSGL) -1. NPCs גם להביע מגוון רחב של קולטני chemokine, כולל CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, וCXCR4 (אבל לא מבטא CCR3 וCCR7), שהם בחינה תפקודית פעילים, הן במבחנה in vivo 5,16. לפיכך, systemicaNPCs הזריק lly להשתמש מצלמות אלה, יחד עם קולטן מצמידים G-חלבון (GPCRs), לצבור ברמה של מערכת העצבים המרכזית המודלקות. לעומת זאת, NPCs הזריק מערכתי לעכברים בריאים לא נכנסים למערכת העצבים המרכזית דרך כלי דם או מסלולי שטח נוזל השדרתי 2. דלקת במערכת העצבים המרכזית, או אנדותל / הפעלת תא ependymal הבאה ציטוקינים מערכתיים או lypopolisaccharide הזרקה (LPS) כמודל של דלקת קרום המוח כימי שגרם, הוא הכרחית ולכן להצטברות של NPCs הזריק מערכתית למוח וחוט השדרה 2. לכן, מיקוד מוצלח של מערכת העצבים המרכזית עם טיפולי NPC מערכתיים תלוי בזיהוי של חלון ספציפי מחלה של הזדמנות (WOO) שבה המוח וסביבת חוט השדרה הם תורמים להצטברות וההגירה transendothelial של NPCs. בתנאים כאלה, בדרך כלל מתעוררים בהקשר של דלקת חריפה וsubacute 17. ברגע שיש נכנס למערכת העצבים המרכזית, מושתל NPCs מובחןהוכחו לשפר את תכונות clinico-פתולוגית של עכברים, כמו גם פרימאטים גדולים יותר, לא אנושיים עם EAE. זו תוארה להיות תלויה מהחלפה המינימלית תא 2 והפרשה יוצאת דופן של גורמי חיסון רגולציה והגנה עצביים אוטוקריני בתוך מערכת העצבים המרכזית perivascular 2,5,6,18 לעומת אזורים שאינה במערכת העצבים המרכזית מודלקים 19,20 (למשל בלוטות לימפה) בתגובה ל איתות תא דלקתית שהושרו על ידי חדירת תאי מערכת החיסון 5.
במסמך זה אנו מתארים את ההיבטים המתודולוגיים העיקריים של ההזרקה המערכתית של NPCs הגופני למודל של עכברים של EAE הכרוני. באופן ספציפי יותר, אנו מגדירים את הפרוטוקולים שהקמנו (i) נובע, להרחיב ולהתכונן לNPCs סומטיים השתלה מאזור subventricular (SVZ) של מבוגרים עכברי C57BL / 6; (Ii) לגרום EAE הכרוני בעכברים כאלה וכן (iii) לבצע טיפולי יעיל מערכתי (iv או ICV) השתלת NPC iעכברי n כדי EAE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים מבוצעים על פי העקרונות של טיפול בבעלי חיים במעבדה שאושרו על ידי משרד הפנים בבריטניה תחת בעלי החיים (הליכים מדעיים) לפעול 1986 (PPL מס 80/2457 לSP).
1. גזירת תאים סומטיים גזע עצבי / אב (NPCs) מאזור subventricular (SVZ) של המוח של עכברים בוגרים
- הכנת מכשירים לנתיחה ותקשורת
נ.ב.: שני פתרונות אלה חייבים להיות מוכנים 1-2 שעות לפני שהמכשירים והניתוחים מוכנים וprewarmed על 37 º C לפחות 20-30 דקות לפני השימוש (זה עוזר לדלל פפאין ומייעל את פעילות אנזים).- החיטוי מספריים אחד ישר חדים, מספריים כירורגיות קטנים אחד ושני מלקחיים משוננים מעוגלים קטנים.
- פתרון 'עיכול': הכן שני 50 מיליליטר צינורות נפרדים עם:
פתרון # 1: 25 מיליליטר תמיסת מלח חומצת ethylenediaminetetraacetic (EBSS) + 10 מ"ג (EDTA) + 10 L-ציסטאין מ"ג מאוזן של ארל;ו -
פתרון # 2: 25 מיליליטר EBSS + 50 פפאין מ"ג. - הכן את 'בינוני מלא צמיחה "(CGM): בינוני הבזליים עכבר להשלים עם תוספי התפשטות עכבר, הפרין 0.002%, גורם בסיסי גדילה פיברובלסטים (bFGF; 10 ng / ml), גורם אפידרמיס צמיחה (EGF; 20 ng / ml), ואנטיביוטיקה (פן / סטרפטוקוקוס).
- נתיחת המוח
נ.ב.: הסרת העצמות זמניות יכולה בקלות לפגוע ברקמה בגלל החדות שלהם. כדי למנוע זאת, בנחישות להבטיח את העצמות עם המלקחיים ולשלוף עד שכל העצם הוסר.- לכל הכנת NPCs, לברור על ידי נקע בצוואר הרחם n = 5-7, עכברים C57BL / 6 4-8 בשבוע ישנים.
- לנקות עם 70% אתנול (במים) השיער של עכברים והנבחרים ולחתוך מאחורי האוזניים עם המספריים חדים ישר כדי להסיר את הראש;
- ביצוע חתך קו האמצע באמצעות מספריים כירורגיות קטנים כדי לחתוך את העור מעל הגולגולת. באמצעות המלקחיים, לקפל את שני כתמי עור לירידיםדואר הגולגולת.
- עם המספריים כירורגיות הקטנים לבצע שני חתכים קטנים בבסיס הגולגולת ולהסיר את העצמות מתחת לפונס / הלשד (גולגולת הגחון). המשך על ידי תלישת העצמות זמניות. עם אותו המספריים לבצע חתך לאורך כל הגולגולת, החל מהבסיס לנורות, מבלי לפגוע בשטח של המוח. כמו כן, מבצע חתך בין העצמות הקדמיות והעיניים, כדי להקל על ההסרה של העצמות הקודקודית. עם שני מלקחיים להתחיל להסיר את הגולגולת על ידי משיכת כל אחת מהעצמות הקודקודית כלפי חוץ. תוך משיכת, שימו לב לקרומי המוח, אשר יכול לגרום נזק למוח כאשר העצמות נמצאים הוסרו.
- ברגע שהגולגולת הוסרה, חלק המלקחיים בין המוח והגולגולת לנתק לחלוטין את קרומי המוח שמאל. רם בעדינות את המוח מהגולגולת. חותכים את עצבי ראייה כדי לשחרר את המוח ולבסוף לאסוף את המוח בצינור עם נאגר מלוח פוספט הקר (PBS).
- שמור את הצינור על קרחd לחזור על אותו התהליך עבור כל העכברים.
- מבחני Dissection של SVZ, neurosphere היווצרות ותחזוקה
מספר ממוצע של x תאים גורם לדילול x 10 4
איפה 10 4 מייצג את ההמרה של הנפח הכולל של חדר hematocytometer (נפח כולל = 0.1 מ"מ 3 -> 10-4 סנטימטר 3 -> 10-4 מיליליטר). כאשר בוחנים את הגורם לדילול, הן אחד לעשות עם CGM ועם הכתם החיוני צריכים להילקח בחשבון. כדוגמא, אם 160 תאים נספרו בריבועי פינת 4, הצפיפות הסופית (תאים / מיליליטר) של ההשעיה התא תהיה:
160/4 x 5 (דילול עם CGM) x 2 (דילול עם כתם חיוני) x 10 4- הפעל מכסה המנוע לנתיחה מצויד במיקרוסקופ לנתח.
- יש לנקות את כל המשטחים עם 70% אתנול (במים), ולרסס עם פתרון Mycoplasma אנטי כדי להקטין את הסיכון לזיהום.
- עטיפההחלק התחתון של כוס עם גזה סטרילית (כדי לשמר מכשירים מחודדים) ולמלא אותו ב70% אתנול (במים). משרים בכוס שני זוגות מלקחיים, זוג אחד של מספריים מיקרו ולהב כירורגים.
- מניחים את המוח כולו במטריצת מוח מבצעה.
- באמצעות שני סכיני גילוח לבצע 2 מ"מ חתך העטרה מהקוטב הקדמי של המוח, לא כולל שטחים האופטיים, ו3 מ"מ אחורי לקיצוץ הקודם; ולמקם את הרקמה על צלחת פטרי נקייה.
- תחת מיקרוסקופ לנתח לבודד את רקמת SVZ וחותך ל1 מ"מ 3 חתיכות באמצעות iridectomy מספריים. חזור על פעולה עבור כל המוחות.
- מערבבים היטב את שני פתרונות (סעיף 1.1.2) לעיל ולסנן דרך פילטר 0.22 מיקרומטר מייד לאחר המוחות הם גזורים וSVZs מוכן להתעכל.
- להעביר את החלקים ל30 מיליליטר של תמיסה 'עיכול', בעדינות resuspend עם a10 פיפטה מיליליטר דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. כל 15 דקות בעדינות לנער את הצינור 2-3x.
- צנטריפוגה XG 300 10 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 200 μl של CGM ידי pipetting ראשון עם P1000 ולאחר מכן עם טפטפת P200 (10-20x כל אחד), עד לקבלת השעיה תא בודדת.
- קח את ההשעיה עד 5 מיליליטר עם CGM ולהעביר לבקבוק סנטימטר T25 2.
- אחרי 5-7 ימים במבחנה neurospheres (DIV) תהווה. אסוף את ההשעיה ל15 צינור מיליליטר ו צנטריפוגות דקות 10 ב150 x גרם.
- הסר את supernatant ו resuspend את הכדור לתוך 200 μl של CGM.
לנתק את neurospheres מכאנית על ידי passaging התאים 100-150x עם טפטפת P200, עד לקבלת השעיה תא בודדת ולקחת אותו עד 1 מיליליטר עם CGM. - לדלל את ההשעיה התא, למשל 10 μl של השעיה תא ב40 μl של CGM להשיג דילול 1:5, ומערבבים היטב. מערבבים 10 μl של dilutהשעיה תא דואר עם 10 μl של כתם חיוני ומערבבים היטב.
- מלא חדר ספירת hemocytometer עם 10 μl של השעיה 1:01 תא: פתרון כתם חיוני. בנפרד לספור את מספר תאי חיים (לבנים) ומתים (כחול) בכיכרות הפינה 4. כדי לקבוע את מספר תאים / מיליליטר, להחיל את החישוב הבא:
- Resuspend 2 x 10 5 תאים ב 5 מיליליטר של CGM והעברה לבקבוק 2 סנטימטר T25;
- חזור על סעיפים 1.3.11-1.3.12 כל DIV 4-5. מחלוף השני של הרחבה ואילך, להעריך את הכדאיות הסלולרית על ידי הרחקת כתם חיונית ולהתחיל לבנות את עקומת צמיחה מתמשכת על ידי ציפוי NPCs בצפיפות משובט (8,000 cells/cm2), כפי שתואר 21. שמור את המספרים הסלולריים ולחזור על התהליך בכל DIV 4-5. כדי ליצור עקומת צמיחה מתמשכת, פעל באופן הבא:
הערה: כדי לקבל הכנת תא טובה, אחרי 4-5 תחומים DIV צריכים להגיע בקוטר של 150-200 מיקרומטר. כדי לקבל הערכה טובה של tהוא תא צפיפות, חשוב למצוא גורם לדילול אופטימלי כדי שיהיו תאים מחולקים היטב, וnonoverlapping ברחבי hematocytometer. באופן אידיאלי, צריכה להיות בין 50-200 תאים בסך הכל. בספירה, רק התאים מורכבים בכיכר בלי לגעת בגבולות צריכים להילקח בחשבון. כמו כן, את הכדאיות של התאים היא גורם מכריע שיש הכנה בריאה. חשוב מכך, זה צריך להיות גדול יותר של 90%. עקומת צמיחה ליניארי היא אינדיקטור נוסף להכנת תא בריאה.- לספור את מספר תאי חיים ומתים (למשל 1.3 x 10 6).
- הגדר את קצב צמיחת חלוקת מספר תאי חיים במספר התאים מצופים (למשל 1.3 x x 10 6/2 10 5 = 6.5).
- לחשב את המספר הכולל של תאים על ידי הכפלת שיעור הצמיחה למספר הכולל של תאים הנוכחים בנקודה הקודמת בזמן (בתחילת = 2 x 10 5).
- דווח על הממוצע7; סטיית תקן לבניית קו מגמה ליניארי.
- החל מהחלוף 6, ניתוק מכאני הוא הוחלף על ידי ניתוק האנזימטית. לאחר צנטריפוגה ב XG 150 עבור 10 דקות, להסיר את supernatant, resuspend את הכדור ב200 μl של פתרון דיסוציאציה המצרפי תא, resuspend 7-8x עם P200 ודגירה 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- Resuspend 7-8x עם P200 לקבל השעיה תא בודדת ולהוסיף 800 μl של CGM. ספירת התאים (שניהם החיים ומתים) ולבסס את הכדאיות שלהם. Resuspend 2 x 10 5 תאים ב 5 מיליליטר של CGM והעברה לבקבוק סנטימטר T25 2.
- התמרה ויראלית של NPCs למעקב תא in vivo
הערה: כדי לוודא את היעילות של התמרה ויראלית, לבנות עקומת צמיחה במקביל עם NPCs transduced וnontransduced. בנוסף, היעילות המשובט, שהוא המספר המוחלט של תאי neurosphere יוצרים נוכחי בתוך תא preparation או ניתוח מחזור תא על ידי תוכן ה-DNA (עם יודיד propidium, PI), עשוי לשמש כאינדיקציות נוספות של מצב התא. אם אחוז התאים הנגועים לא צריך להיות טוב, הפרוטוקול של התמרה ויראלית ניתן לחזור בפעם שנייה עם אותה האוכלוסייה של תאים. ברגע שרמת הזיהום היא משביעת רצון ועקומת הצמיחה דומה לזה שהושג עם תאים מסוג בר, ניתן להרחיב NPCs transduced ו / או מושתל.- קציר neurospheres ולקבל השעיה תא בודדת. פלייט התאים בצפיפות גבוהה (1.5 x 10 6 תאים בבקבוק סנטימטר T75 2) ב10 מיליליטר CGM.
- לאחר שעות 12 להוסיף 3 x 10 6 TU / מיליליטר של pRRLsin וקטור lentiviral דור שלישי. PPT-HCMV מהונדס עם E. coli הנגזר β-galactosidase (lacZ) או עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP).
- 48 שעות מאוחר יותר, לקצור את התאים, צנטריפוגה XG 300 10 דקות וreplate התאים ביחס של 1:1.
- לאחר3 קטעים במבחנה לאמת את היעילות של הזיהום. Cytometry זרימה משמשת בדרך כלל לבדיקת יעילות זיהום, והרמה מספקת של זיהום מקובל להיות בטווח של 75-95% מתאים חיוביים. בדוק שוב את היעילות של הזיהום לאחר 3 קטעים נוספים של התרחבות לאמת התחזוקה של ביטוי הסמן.
- הקפאת neurosphere
- קציר neurospheres מבקבוק סנטימטר T25 2, צנטריפוגה XG 300 10 דק ', וזורקים supernatant.
- Resuspend את הכדור עם 1 מיליליטר של הקפאה בינונית (CGM עם 10% sulfoxide דימתיל (DMSO).
- הנח את cryovials ב -80 ° C בתוך מיכל הקפאה.
- אחרי לפחות 24 שעות להעביר את התאים לcryobox ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך חודשים, או להביא לחנקן נוזלי (N 2) לאחסון ארוך יותר.
- הפשרת neurosphere
נ.ב.: כדי למנוע את ההשפעות הרעילות של o מגע הממושכתו NPCs עם DMSO, תהליך ההפשרה חייב להיות מהר ככל האפשר.- הסר את cryovial מ-80 ° C / N 2 ולשמור אותו על קרח יבש.
- מהירות להפשיר את הבקבוקון על אמבט מים, עד שכמעט כל ההשעיה התא שהופשרה וחתיכה קטנה של השעיה קר נשארה.
- Resuspend ההשעיה התא עם 5 מיליליטר של CGM הטרי prewarmed.
- צנטריפוגה XG 300 10 דקות.
- הסר את supernatant, resuspend בעדינות עם 5 מיליליטר של CGM הטרי וצלחת ההשעיה התא בבקבוק סנטימטר T25 נקי, שלא טופל 2.
- 1.7) אפיון NPC
הערה: ניתן להחליף לשטוף האחרון PBS עם 0.05% אזיד-PBS נתרן כדי למנוע צמיחה או זיהומים פטרייתיים, וcoverslides מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שבועות.
נ.ב.: כדי להכתים לסמנים תאיים להוסיף סוכן permeabilizing לPBS בפתרון החסימה. אם המקור של הנוגדן הראשוני הוא עז, albumi סרום שוריש להשתמש n (BSA) או בסרום של אחרים מאשר עז.
נ.ב.: כדי להכתים לסמנים תאיים להשתמש סוכן permeabilizing בפתרון הנוגדן הראשוני.- הנח coverslide זכוכית 13 מ"מ בחלק התחתון של צלחת גם 24. הוסף 150 μl של פתרון ציפוי על החלק העליון של כל coverslide ליצור טיפה קטנה. דגירה של לפחות 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- קציר neurospheres ולנתק לקבל השעיה תא בודדת.
- ספירת תאים חיים ולדלל להשיג 80,000 cells/35 μl. להסיר את העודפים של פתרון ציפוי מcoverslide על ידי שאיפה עדינה, וצלחת 35 μl של השעיה תא.
- דגירה 25 דקות ב 37 ° C CO, 2 5%. מהירות לבדוק במיקרוסקופ השלב לעומת זאת, אם התאים החלו לדבוק.
- הכן את מדיום הבידול על ידי ערבוב בינוני עכבר בסיסי עם התוספים המתאימים (ראה טבלה 1) ואנטיביוטיקה (Pen / סטרפטוקוקוס).
- להוסיף 400 μl של מדיום בידול ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר 3 DIV, שינוי מחצית הבינונית עם בינוני בידול טרי.
- לאחר 6 DIV, להסיר את המדיום ולשטוף פעם עם PBS. מתחת למכסת מנוע כימי להסיר את PBS ולהוסיף 300 μl של paraformaldehyde prewarmed 4% (PFA) סוכרוז 4%. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר (RT). הסר את PFA ולשטוף 3x עם PBS.
- כדי להמשיך בimmunocytochemistry, להסיר את PBS ולחסום עם 10% נסיוב עזים נורמלים PBS (NGS) (פתרון חסימה), דגירה 1 שעות ב RT.
- הסר את פתרון החסימה ומוסיף את הנוגדן הראשוני הרצוי מדולל עם NGS 1% PBS. דגירה על 4 מעלות CO / N או, לחלופין, 120 דקות ב RT.
- לאחר הדגירה, לשטוף 2x עם PBS. דגירה עם הנוגדנים משני המתאימים מדוללים עם NGS 1% PBS. דגירה 60 דקות ב RT.
- לשטוף 2x עם PBS ונגדי להכתים את הגרעינים עם 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מדולל 1:20,000 עם PBS permeabilizing סוכן במשך 3 דקות על RT בחושך. לשטוף פעמיים עם PBS ופעם עם מים מזוקקים.
- שים טיפה של מדיום הרכבה בשקופית רקמת זכוכית ועם מלקחיים הר coverslide עם התאים מול ההרכבה בינונית. לחץ בעדינות את coverslide לסחוט את עודף הרכבה בינונית. השאר את coverslide בחושך על RT עד ההרכבה בינונית הוא מיובש ולאחסן ב 4 ° C.
אוטואימוניות הניסויית 2. המיאלין oligodendrocyte גליקופרוטאין (MOG) מושרה בC57Bl / 6 עכברים
- הכנת התחליב
- בכוס זכוכית להכין תחליב המורכב מadjuvant של פרוינד לא שלם המכיל 4 מ"ג / מיליליטר של שחפת Mycobacterium [הגדרה אחרת כAdjuvant של פרוינד המלא (CFA)] ו200 מיקרוגרם של MOG (פפטיד 35-55), בהתחשב בכך שהסכום הכולל של תחליב לכל עכבר יהיה 300 μl.
נ.ב.: appropriaפקדי te של עכברים שחוסנו-MOG בCFA הם עכברים שחוסנו עם CFA בלבד. השונות הצפויות של הופעת מחלה בעכברים שחוסנו-MOG היא 11.3 (± 1.8) dpi.
הערה: בחישוב הנפח הכולל של תחליב צורך, תשקול כפליים נפח כמו מספר העכברים לחסן. יש להעדיף כלי זכוכית לPlasticware כדי למזער את הבזבוז של חלק מהתחליב.- עם מזרק זכוכית מחזיק תערובת 19 מחט G כ 30 דקות, תמיד שמירה על התחליב על קרח.
- כדי לוודא אם התחליב מוכן, שחרר כמות קטנה של תחליב על מים. התחליב מוכן להיות מוזרקים רק אם הטיפה נשארה כפי שהוא ולא להתפזר.
- לחסן את קבוצת הביקורת של עכברים עם CFA בלבד. טיפול בעכברי ניסוי (MOG חוסן) עם MOG בCFA. השונות הצפויות של התפרצות מחלה שב"א חוסנו עכברים הוא 11.3 (± 1.8) dpi.
- העבר את מחט 19 G למזרק פלסטיק 1 מיליליטרnd לשאוב את התחליב. למנוע בועות, לשנות את המחט עם 25 G ולהשאיר את המזרק על קרח. מזרקים מלאים בתחליב מוכנים לשימוש, ויש לשמור על קרח למשך כמה שעות.
- בכוס זכוכית להכין תחליב המורכב מadjuvant של פרוינד לא שלם המכיל 4 מ"ג / מיליליטר של שחפת Mycobacterium [הגדרה אחרת כAdjuvant של פרוינד המלא (CFA)] ו200 מיקרוגרם של MOG (פפטיד 35-55), בהתחשב בכך שהסכום הכולל של תחליב לכל עכבר יהיה 300 μl.
- חיסון
- מניחים את העכברים (6-8 שבועות, נקבה) לתוך תיבת התחממות ולהמתין כ 10 דקות, כדי לאפשר לוריד הזנב להתרחב.
- העבר את העכבר אחד מתיבת ההתחממות לעוצר עכבר. סגור את העוצר כדי למנוע כל תנועה של העכבר.
- ממלאי מזרק אינסולין 1 מיליליטר עם רעלן שעלת (5 מיקרוגרם / מיליליטר) 100 μl הימנעות עושה בועות. לאט לאט להזריק את הפתרון בוריד הזנב. הסר את המחט ולחץ במשך כמה שניות עם פיסת נייר כדי לסתום את הדימום.
- מניחים את העכבר בחזרה בכלוב ולחזור על אותו התהליך עבור כל העכברים.
- הרדימי עכבר עם שאיפה מתמדת isoflurane (1-2%, 2 ליטר / דקה) ולהזריק מתחת לעור של תחליב 100 μl ברמהמשני אגפים ובסיס הזנב (300 תחליב μl / עכבר). לאט לאט להסיר את המזרק, הימנעות הדליפה של התחליב.
- סמן העכבר עם אגרופן אוזן, הנח את העכברים בכלוב ולבדוק עד להחלמה מלאה. חזור על פעולה עבור כל העכברים.
- לאחר 48 שעה (לאחר 2 ימי חיסון, dpi) סעיף 2.2.3 חוזר.
- ניתוח התנהגותי של עכברי EAE
- החל מ 5 dpi, לשקול העכברים יומיים ולעקוב אחר המופעים של תנועה שלהם על ידי שימוש בשיטת הניקוד בקנה מידה שמתוארת בטבלה 1.
3. הזרקה של תאי גזע / אב עצביים לתוך זנב הווריד (IV)
- הכנת תא
- neurospheres קציר על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות.
- הסר את supernatant ולהוסיף 200 μl של פתרון ניתוק כולל סלולרי. דגירה 10 דקות ב 37 ° C CO, 2 5%.
- בעדינות resuspend 10-12x (avoidinבועות ז) עם P200 עד לקבלת השעיה תא בודדת ולקחת ל800 μl עם מדיום בסיסי ללא Ca 2 + ו Mg 2 +.
- ספירת התאים באמצעות כתם חיוני לassay כדאיות תא ולדלל את ההשעיה עם מדיום בסיסי ללא Ca 2 + ו Mg 2 + כדי להשיג צפיפות סופית של 10 6 cells/150 μl. שמור את ההשעיה התא על קרח עד לשימוש.
- הזרקת iv NPC
נ.ב.: הניתוק האידיאלי להשעית תא בודדת והיעדר בועות אוויר הם שני היבטים מרכזיים לשקול כדי להפחית את הסיכון של שני גושים / אגרגטים לעומת היווצרות תסחיפים העלולים לגרום לחסימת וריד ומוות כתוצאה מכך.- בשיאה של המחלה (16-18 dpi), שוקל את התוצאה ל העכברים. הפץ את העכברים לפי ציונם כדי שתהיה קבוצות הומוגניות.
- מניחים את העכברים לתיבת התחממות ולהמתין כ 10 דקות, כדי לאפשר לוריד הזנב להתרחב. העבר את העכבר אחד מתיבת ההתחממות לעוצר עכבר. סגור את העוצר כדי למנוע כל תנועה של העכבר.
- ממלאי מזרק אינסולין 1 מיליליטר עם 150 μl של השעיה תא והקפד להסיר את כל הבועות. לאט לאט להזריק את הפתרון לוריד הזנב. הסר את המחט ולחץ במשך כמה שניות עם פיסת נייר כדי לסתום (6A דמויות ו6B) דימום.
- מניחים את העכבר בכלוב ולבדוק עד להחלמה. חזור על אותו התהליך עבור כל העכברים.
4. הזרקה של תאי גזע / אב עצביים לCisterna Magna (ICV)
- הכנת תא
- NPCs קציר על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות.
- הסר את supernatant ולהוסיף 200 μl של פתרון ניתוק כולל סלולרי. דגירה 10 דקות ב 37 ° C CO, 2 5%.
- בעדינות resuspend 10-12x עם P200 עד לקבלת ג בודדההשעיה ell ולקחת ל800 μl עם מדיום בסיסי ללא Ca 2 + ו Mg 2 +.
- ספירת התאים ולדלל את ההשעיה עם מדיום בסיסי ללא Ca 2 + ו Mg 2 + כדי להשיג צפיפות תאים הרצויה. שמור את ההשעיה התא על קרח עד לשימוש.
- 4.2) הזרקת ICV NPC
- בשיאה של המחלה (16-18 dpi), שוקל את התוצאה ל העכברים. הפץ את העכברים לפי ציונם כדי שתהיה קבוצות הומוגניות.
- הנח את העכבר על מנגנון stereotaxic תחת שאיפה מתמדת isoflurane (1-2%, 2 ליטר / דקה). לאבטח את הראש של העכבר עם הברים האוזן. לאחר מכן להתאים גם את הפה ואף חתיכות. ודא הראש של העכבר הוא שטוח וקבוע.
- ספוגית הראש של העכבר עם Povidone יוד (PVP-I) ועושה חתך כדי לחתוך את העור בחלק האחורי של הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
- באמצעות micromanipulator, הכנס את קצה microlמזרק iter לתוך החריץ שבין העורף וחולית האטלס דרך השרירים ורצועות בשלמותה בקו האמצע בחלק האחורי של הצוואר. החלק המכופף של המחט הוא שמר על קשר הדוק עם המשטח הפנימי של העורף לכל אורכו, כמתואר 22.
- לאט לאט להכניס את המחט ולחכות כמה שניות. המפעיל נועד ללמוד לזהות את התחושה של המחט להיות "מכור" לגולגולת העכבר, לפני להתחיל הזרקת הכנת התא. לאט לאט להזריק את נפח התאים (בתוך 3-5 דק '). השאר את המחט במקום לכמה שניות נוספות לאחר ההזרקה ולהסיר לאט את המזרק.
- לתפור את העור ומניח את העכבר לכלוב התאוששות עד להחלמה מלאה.
5. עיבוד רקמות
- עמוק לטשטש את העכברים בתערובת של 0.5 מיליליטר קטמין (100 מ"ג / מיליליטר), 0.25 מיליליטר xylazine (23.32 מ"ג / מיליליטר) ו4.25 מיליליטר מים סטריליים וtranscardically תנקב, Washing עם מי מלח-EDTA ולתקן עם PFA 4%. הסר את שני העמודות בעמוד השדרה והמוח וpostfix PFA 4% עבור שעות 12 ב 4 ° C. שטוף את הרקמה ב-PBS, להסיר את מיתרי השדרה מהעצמות ולהשאיר את הרקמות לפחות 48 שעות בסוכרוז 30% (PBS) בשעה 4 ° C. להטביע את הרקמות בטמפרטורת חיתוך אופטימלית מתחם (אוקטובר) ולהצמיד הקפאה עם חנקן נוזלי, כפי שתואר 2.
- השתמש microtome לחתוך את הרקמות ב10-12 פרוסות עבות מיקרומטר.
- לחלופין, כדי לשבץ את הרקמה טריות בagarose ולחתוך רקמות באמצעות פרוסות עבות vibratome 50-80 מיקרומטר.
- בשני המקרים, דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס ב 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β פתרון D-galactopyranoside (X-gal) כדי לזהות פעילות β-galactosidase גרעינית.
- חתך מחדש קטעים המכילים β-gal + תאים לתוך 5 מיקרומטר פרוסות וכתם כפול באמצעות חלבון fibrillary antiglial חומצי (GFAP) להאסטרוציטים (50 מיקרוגרם / מיליליטר), אנטיגן הגרעיני antineuronal (NeuN) לנוירונים (1 &# 956; גר '/ מיליליטר) וantiNestin לתאים שלא עברו התמיינות עצביים (10 מיקרוגרם / מיליליטר).
- המשך כפי שתואר בסעיפים 1.7.11 ו1.7.12. לstainings מרובה הקפד להשתמש בנוגדנים משני מצומד עם fluorophores שונה.
- לרקמות המכילות תאי ה-GFP שכותרתו פעל כמוסבר בצעדי 5.1-5.3 ולהמשיך עם stainings המרובים.
- להוסיף כמה טיפות של מדיום הרכבה לשקופיות ולכסות עם coverslip רקמות.
- עבור חלקים מוכתמים עם נוגדנים מצומדות ביוטין להכין תמיסה של קומפלקס ביוטין avidin (פתרון ABC, ראה טבלה 2) ולהשאיר בתסיסה 45 דקות.
- דגירה דקות 5 פרוסות עם 1% H 2 O 2 כדי לחסום את הפעילות של peroxidase אנדוגני.
- לשטוף פעמיים עם PBS.
- דגירה עם פתרון ABC עבור 1 שעות ב RT.
- לשטוף פעמיים עם PBS.
- דגירה עם פתרון 3,3 '-diaminobenzidine ו0.3% H 2 O 2. לפקח בלתי התגובהדער מיקרוסקופ ולשטוף עם PBS בהקדם הפרוסה מתחילה לקבל צבע חום (בדרך כלל סביב 5-10 דק ').
- לשטוף פעמיים עם PBS ולהמשיך כמתואר בשלב 5.7.
רשימה המקיפה של חומרים וחומרים כימיים מוצגת בטבלה 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גזירת NPC ואפיון
ניתוחי SVZ מתבצעים בברכות (n = עכברים / בריכה 5-7) של C57Bl / 6 עכברים 6-8 בשבוע שישנים בדרך של ניתוק המכני והאנזימטית (איור 1 א). אחרי כמה ימים של culturing בCGM, ריחוף ללא neurospheres להתחיל להרכיב (איורים 1 א ו 1 ב '). התחומים עיקריים נאספים ומכאני passaged כל DIV 4-5. על passaging, מספרים של תאי חיים ומתים הובררו ומספרים סלולריים מצטברים זממו ליצור עקומת גדילה (תרשים 1C). זה נותן אינדיקציה לשיעור הריבוי, ובכך לספק פרמטר עקיף כדי להעריך את היציבות הגלובלית של הכנת NPC. כאשר מתרבים כneurospheres, NPCs להביע סמנים של פעילות המיטוטי (phospho-היסטון H3, PHH3; 5 מיקרוגרם / מיליליטר) ושל תאים שלא עברו התמיינות עצביות (למשל Nestin) (איור 2 א). NPCs עבר התמיינות והם להיות דואר טיפוליfficacious בEAE לאחר ההשתלה חייבת לבטא מולקולות הדבקות תא שטח הכוללות CD44 (5 מיקרוגרם / מיליליטר), מקטע α4 של VLA-4 (10 מיקרוגרם / מיליליטר) (איור 2F). כאשר מצופים בתנאי בידול מתאימים, NPCs להביע סמנים אופייניים של שלוש שושלות עצביות, (איור 2), כגון GFAP astroglial הסמן (איור 2 ג), microtubule הסמן העצבי הקשורים בחלבון 2 (MAP-2; 5 מיקרוגרם / מיליליטר ) (איור 2 ד) והסמנים oligodendroglial O4 (5 מיקרוגרם / מיליליטר) וחלבון המיאלין בסיסי (MBP; 10 מיקרוגרם / מיליליטר) (איור 2E), ובכך אישרו כי NPCs הוא multipotent כלפי שלוש השושלות עצביות העיקריות. כדי להקל על זיהוי של תאים מושתלים in vivo, NPCs הם transduced עם lentiviruses המהונדס לגנים כתב ביציבות מפורשים כגון ה-GFP. NPCs transduced להביע GFP הן כמתרבה neurospheres (3A דמויות ו3C), כמו גם, כאשר הבחנה במבחנה עם נסיגת גורם גדילה (איור 3 ב). כדי לוודא את היעילות של התמרה, את הביטוי של ה-GFP הוא נותח על ידי cytometry זרימה, מתחיל מוקדם ככל 3 מעברים לאחר התמרה תא (כי הוא מאפשר מספיק זמן כדי להיות ביטוי חזק של transgene הציג ברמת החלבון). כאשר מיישמים lentiviruses דור השלישי לNPCs במבחנה, אנחנו בעקביות להתבונן> 90% מתאים מראים רמות גבוהות של ה-GFP על ניסויים בלתי תלויים מרובים (איור 3 ג), עם לא רעיל גלויים ולא שינויים בתפוצה, כאשר משווים את עקומות הגדילה של סוג הבר NPCs lenti-GFP transduced (איור 3D).
אינדוקציה EAE כרונית
EAE הוא אחד הדגמים הטובים ביותר, מאופיינים בטרשת הנפוצה, שכן הוא משחזר את רוב האירועים פתולוגיים וקליניים של טרשת נפוצה. חיסון של עכברי C57Bl / 6 עם MOG35-55 מוביל לdevelopmenלא מצורה כרונית של EAE. כאשר מתקרב לתחילת המחלה (11.3 ± 1.8 dpi) במהלך שלב האינדוקציה (פרה), MOG חוסן עכברים להתחיל לרדת במשקל (איור 4 א). בתחילתו של שלב מפעיל / פלישה (קליני שיא; 16.8 ± 3.2 dpi) עכברי EAE להגיע לשיא של המחלה (ציון 3.5 ± 0.7), וזמן קצר לאחר שהגיע לשיא הם מראים התאוששות הדרגתית וחלקית שסופו של דבר תתייצב במהלך כרוני שלב (קליני יציב) מרחבי 30 dpi ואילך (ניקוד 2.8 ± 0.9) (איור 4). מחקרים רבים, כוללים כמה EAE חקירה או על ידי מיקרוסקופיה intravital 23 או תהודה מגנטית 24, יחד עם in vivo הפתולוגיה רקמות, זיהו בשיא של שלב מפעיל / פלישה (16-22 dpi) החלון האידיאלי של הזדמנות (וו) אשר לביצוע טיפולים ניסיוניים מערכתיים עם תאי גזע שנועדו להזין את מערכת העצבים המרכזית EAE כרוני דלקתיות ולהגן עליו מפני ד המשניamage.
הזרקת NPC
NPCs syngeneic הזריק מערכתי בEAE עכברים (איור 6) נמצאים כמעט אך ורק באזורי perivascular של נזק במערכת העצבים המרכזית, הן במוח (איור 5 א) וחוט השדרה (איורים 5 ב-D), עד 45 ימים שלאחר ההשתלה (DPT), כפי שתואר על 5. iv. הוחדר NPCs מעדיף לשמר בשלה פנוטיפ, Nestin + (איור 5 ג), בעוד כמה NPCs נע אל מחוץ לאזור perivascular להביע NeuN (איור 5D). ראוי לציין, NPCs הזריק iv לנבדקים בריאים לא יצליח להזין את מערכת העצבים המרכזית דרך המסלול של כלי הדם (איור 5E). לאחר iv הזרקת NPC, מספר משמעותי של NPCs המוזרק נמצאים ברמה של איברים שאינן במערכת העצבים המרכזית כגון הכבד, מעיים, טחול, ריאות וכליות, אך לא את הלב, מוקדם ככל 10 DPT (איור 5F). NPCs ללא CNS צבירה נמחקים מתוך thes לחלוטין דואר איברים היקפיים על ידי 30 DPT (איור 5G).
איור 1. בידוד של NPCs מSVZ של עכברים בוגרים ובדור של קווי NPC יציבות הניתנים להרחבה., ייצוג סכמטי של השלבים הקריטיים העיקריים של הדור של יציבות הניתנת להרחבה, והכנה של NPCs עכבר בזריקות. B, neurospheres במבחנה. C , NPCs התרבית כneurospheres הן passaged כל 4-5 ימים. מספרים של תאי חיים ומתים נאספים ומספרים סלולריים מצטברים זממו ליצור עקומת גדילה. סרגל קנה המידה בB הוא 200 מיקרומטר. הנתונים בC הם מספר ממוצע המצטבר של תאי ± SD (n = 3).
gure 2 "עבור: תוכן width =" 5in "עבור: src =" "/> /" = src "/ files/ftp_upload/51154/51154fig2.jpg files/ftp_upload/51154/51154fig2highres.jpg
איור 2. אפיון NPCs., Neurospheres העכבר מתרבים מבטאת את חלבון PHH3 ליבת היסטון (ירוק), וחלבון נימה ביניים VI הסוג Nestin (אדום). BE, לאחר 6 DIV בתנאי בידול, NPCs הוא multipotent כלפי astroglial (GFAP, אדום ב-C), עצבי (MAP-2, ירוק בD) וoligodendroglial (O4, ירוקות בE; שושלות וMBP, אדום בE). כימות של GFAP-, MAP-2-, ותאי O4-לבטא ב6 DIV לאחר התמיינות NPC במבחנה הם הראו בB. הנתונים בB הם% ממוצעים כ± SD (n = 3). הברים בקנה מידה בספירה הם 50 מיקרומטר. F, ניתוח תזרים cytometry של הביטוי של מולקולות ההדבקה העיקריות פני תא ויסות leukocyextravasation טה בneurospheres עכבר. איור 2F הוא לשכפל מPluchino et al. 2
איור 3. התמרה של NPCs עם lentiviruses לבטא גנים כתב (לדוגמא ה-GFP. ו-B, בניגוד שלב תמונות של neurospheres (א) ו NPCs הבחנה (ב '), כי כבר transduced עם וקטור lenti-GFP דור 3 rd. תזרים cytometry ניתוח של NPCs בא C, סוג בר (לא transduced) וNPCs transduced lenti-GFP בתרבית כneurospheres הן passaged כל 4-5 ימים. מספרים של תאי חיים ומתים נאספים ומספרים סלולריים מצטברים זממו ליצור עקומת גדילה. סרגל קנה המידה בA ו-B הוא 200 מיקרומטר. הנתונים בC הם מספר ממוצע המצטבר של תאי ± SD (n = 3).
איור 4. אפיון פונקציונלי של EAE הכרוני. משקל יומי, הניטור בMOG-ועכברים שחוסנו-CFA C57Bl / 6 על סך מעקב של 40 dpi. B, ניטור ציון היומי EAE בMOG-וC57Bl / 6 עכברים שחוסנו-CFA על סך מעקב של 40 dpi . הנתונים באים לידי ביטוי מספרים ממוצעים כ± SD (n = 10 עכברים / קבוצה).
איור 5. מערכתי הזריק migr NPCsאכלתי בparenchyma של עכברי EAE. AE, מכתים X-gal של חתך vibratome מוח (70 מיקרומטר) (א) וחוט השדרה (ב ') סעיפי רקמות מעכברי EAE הזריקו iv עם NPCs syngenic, מראים + תאי β-gal מושתל ( NPCs תאים כחולים) מתמידים בתוך אזורי CNS perivascular עד סוף המעקב הקליני (106 dpi). C, β-gal + ד. הזריק-(כחול) מתמיד בתוך אזורי CNS perivascular, לשמור + Nestin פנוטיפ (חום). D , NPCs הנודד מעטים להביע NeuN + (חום) כל זמן שהם עוברים מאזור perivascular. E, מכתים X-gal בסעיף חוט השדרה נציג מEAE עכבר שטופלו בדמה. . סולם ברים, 20 מיקרומטר FG, ניתוח של רקמות אחרות מאשר במערכת העצבים המרכזית מראה כי IC -. או NPCs iv. הזריק-(תאים כחולים) מגיע כמעט בכל האיברים (. למשל ריאות, כבד, טחול, לב, מעיים, כליות) שנינותהין 10 DPT (F), אך הם פינו מאותו האיברים על ידי 30 DPT (G). איורים 5A-E היא לשכפל מהתייחסות 5, ואילו דמויות 5F-G הוא לשכפל מPluchino et al. 2
. איור 6 ייצוג סכמטי של הפרוטוקול להזרקה מערכתית של NPCs בעכברים עם EAE שלבים קריטיים של ראשי ההזרקה המערכתית של NPCs בעכברים עם EAE:. מההכנה של CAM בזריקות להביע תא בודד ניתק NPCs חדר תא התרבות () , להזרקה לוריד הזנב של עכברי EAE בשיאו של שלב המחלה מפעיל / פלישה (ב '), לקראת גילוי vivo של NPCs המוזרק שממוקדותמערכת העצבים המרכזית (C), למחקרים פתולוגיים רקמות in vivo המאפשרים המחקר של המנגנונים של פלסטיות הטיפולית של NPCs המוזרק (ד '). בD, תאים ירוקים בהם oligodendrocytes, תאים כחולים כהים הם אקסונים, תאים תכלת מושתלים NPCs, תאים כתומים הם האסטרוציטים, ותאים אדומים הם תאי האנדותל.
| ציון | תגובות של תנועה |
| 0 | עכבר רגיל. אין סימנים גלויים של מחלה |
| 1 | זנב רפוי: רפיסות של הזנב מלא, והיעדרם של מסתלסל בקצה הזנב, כאשר עכבר הוא הרים |
| 1.5 | חולשת גפיים אחורית: העכבר מציג trippings מזדמן וקצר בעת הליכה בהליכת ברווז |
| 2 | חולשה צליעה זנב ואחורית איבר: כאשר הניח על הגב שלו, העכבר לא יכול להפוך למצב הרגיל שלה |
| שיתוק גפיים האחורי חלקי: העכבר כבר לא יכול להשתמש בגפיים אחוריות כדי לשמור על יציבה עכוז או ללכת, אך עדיין יכול להזיז hindlimbs אחד או שניהם במידה מסוימת, forelimbs נותר בעינן | |
| 3 | שיתוק מלא גפיים אחוריות: אובדן מוחלט של תנועה בhindlimbs. העכבר גורר את עצמו רק בforelimbs שלה, אשר נותר בעינן. עכברים בשלב זה ניתנים אוכל על רצפת הכלוב, צינורות קשית ארוכים, והזרקה תת עורית יומית של פתרונות לחות על מנת למנוע התייבשות. אם עכברים לפתח פצעים או נגעים בעור שאינו להתאושש עם טיפול, הם ייהרגו באנושיות |
| 3.5 | חולשה forelimb: כאשר מניחים על רשת אנכית, העכבר אינו מסוגל לטפס ולאט לאט נופל |
| 4 | מדינה גוססת |
| 5 | העכבר נמצא מת או שלוקט על פי נקודות קצה אנושיות |
Table 1. חמישה היקף שלב של סימנים קליניים ושיתוק עולה בעכברי EAE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיפולים בתאי גזע סומטיים מבוססים הם מתעוררים כאחד מהאסטרטגיות המבטיחות ביותר לטיפול בהפרעות במערכת העצבים המרכזית דלקתיות כרוניות כגון 11 MS2. בעוד שמנגנוני שמירה על ההשפעות הטיפוליות שלהם עדיין צריכה להיות הובהר לגמרי, ההשפעה המשמעותית של השתלת NPC במודלי ניסויים שונים של מחלות ניווניות שהוליד את האמונה הפרובוקטיבית במידה מסוימת שתאי גזע עשויים להיות מיושמים בקרוב למחקרים בבני אדם. עם זאת, לפני envisaging כל יישומי אדם פוטנציאליים של טיפולים חדשניים כגון אנחנו צריכים להתמודד עם כמה נושאים מרכזיים ולטפל בכמה שאלות בלתי פתורות, כגון זיהוי של המקור האידיאלי תאי הגזע להשתלה (עצמי לעומת אלוגנאית, pluripotent לעומת multipotent) ואת המסלול הטוב ביותר של ממשל.
מחלות ניווניות שונות בpathophysiologies שלהם, עם כמה להיות מוגבל במרחב (למשל. חוט השדרה בחבר מושבעים, שבץ מוחי) ואילו אחרים מתאפיינות בהפצה המרחבית זמנית (לדוגמא: MS). זה נובע כי הזרקת המוקד של תאים (גזע) עשויה להיות טיפול מתאים ללשעבר, בעוד שזה עשוי להיות לקוי או פשוט בלתי אפשרי עבור אלה האחרונים, שבו הנוכחות של מספר רב של אתרים של נזק מוחי מייצגת אתגר נוסף שיש להתגבר עליו.
ראיות עקביות הוכיחו כי משלוח תוך ורידי עשוי לייצג פרוטוקול תקף (ונמוך פולשנית) לממשל תא, נתמך על ידי היכולת הפנימית של תאי גזע כדי לחוש את הסביבה ובמיוחד בבית לאתר (ים) של נזק. עם זאת, תרגום של טיפולי NPC מערכתיים למרפאות עדיין הפריע כמה מגבלות, כגון הצטברות האפשרית של תאים מושתלים באיברים שאינן במערכת העצבים המרכזית היקפיים (לדוגמא: ריאות, טחול, בלוטות הלימפה, וכליות) שעשוי או לא עשוי להיות אתרים של תגובות דלקתיות המקומיות in vivo. בעוד accum ספציפי הזהulation של NPCs הזריק מתוך היעד של מערכת העצבים המרכזית אינו מסומן במהירות בעכברים עם EAE2 הכרוני, יש ראיות של התמדה לטווח ארוך NPC (או במקרים מסוימים מיקוד בלעדי) ברמה של איברי הלימפה המשניים (לדוגמא. בלוטות הלימפה וטחול) לאחר הזרקה מערכתית בעכברים עם טרשת EAE5 19,20. העובדה כי מספר משמעותי של NPCs המושתל recirculate לכיוון איברים שאינן במערכת העצבים המרכזית יוצרת אפקט דילול, באופן בלתי נמנע צמצום המספר המוחלט של NPCs במערכת העצבים המרכזית. מעניין לציין, כי באופן מערכתי הזריק NPCs הם טיפולי יעילים (למשל באמצעות פעולות רגולטוריות חיסוניים) גם כאשר מצטברים באופן בלעדי ממערכת העצבים המרכזית 19,20. ואת ההשפעות הטיפוליות הכוללות של NPCs הזריק מיקוד CNS רק 5 או בלוטות לימפה רק 19 דומות. זה עשוי בחלקו בשל פלסטיות פנימית של התאים, המגיבות באופן שונה לרכיבים המולקולריים של surroundinmicroenvironment גרם. יש לציין, אם מצד אחד NPCs המושתל עשוי להרגיש את נוכחותם של ציטוקינים דלקתיים ולהפעיל האפקט הטיפולי שלהם באמצעות מנגנוני ויסות חיסוניים 16, ומצד שני הם יכולים לבוא במגע עם microenvironments עוין סופו של דבר מוביל להיווצרות של גידולי 25,26. מסיבות אלה, האפשרות המועדפת היא כיום להתרכז NPCs הזריק במערכת העצבים המרכזית. ככזה, ממשל intrathecal (דרך המותני או מסלול cisternal) הוא עדיין המסלול הפוטנציאלי המקובל ביותר של ממשל בניסויים קליניים. עם זאת, מהמולטיפוקליות וההטרוגניות פתולוגית של נגעי טרשת נפוצה עלולות להגביל את היעילות של גישה כזו.
כאן אנו מתארים פרוטוקול יעיל לבודד, לתחזק ולאפיין אבות עצביים עכבר מSVZ המבוגר וברציפות, כיצד באופן מערכתי (שניהם iv וICV) להזריק NPCs בעכברים מושפעים EAE הכרוני, אחד ביותר סטומת מודלים של טרשת נפוצה. למרות שיחסית פשוט וברור, פרוטוקולים אלה להציג כמה שלבים קריטיים שצריך להילקח בחשבון. בהתחלה, זה הוא חובה כדי להשיג הכנת תא יציבות הניתנת להרחבה ובריאה. כפי שתואר לאורך כל הפרוטוקול, את היציבות של התאים ניתן להסיק באופן עקיף על ידי מסתכל על שיעור הצמיחה שלהם. באופן אידיאלי, neurospheres צריכה להגיע לקוטר של 150-200 מיקרומטר כל DIV 4-5 ושיעור המוות של תאים על מעברים צריכים להיות נמוכים מאוד (פחות מ -10%). כמו כן, neurospheres חייבת להציג צורה עגולה קומפקטית ורגילה במיקרוסקופ. הזיהום עם lentiviruses עלול להפריע להישרדות ויציבות של התאים. כדי להשיג זיהום אופטימלי, הוא חובה לקבל טיטרציה של הנגיף של עניין מספיק כדי להשיג 3 x 10 6 TU / מיליליטר. ואכן, בעוד שמצד אחד כמות נמוכה של וירוס תוביל לאחוז קטן של תאים נגועים, ומצד שני השימוש בכמות גבוהה woulד צפוי להוביל לאפקט רעיל (תלוי מאוד על הגן להיות נגועים). יכול להיות נגוע NPCs מספר פעמים עם וירוסי שילוב, צריך התוצאה של עופרת התמרה הראשונה אחוז הנמוך של תאי קיימא חיוביים transgene. זה תמיד טוב שיש בפועל השוואה ניסיונית התוך פרמטרי יציבות ויכולת קיום עם סוג בר, nontransduced, שולט NPCs. באשר לאינדוקציה של EAE הכרוני, החלק הבעייתי ביותר מיוצג על ידי ההכנה של התחליב. כפי שתוארו, כלי זכוכית וקרח חייבים להיות שימוש בכל העת. הכנת התחליב לוקחת 30-45 דקות, וזה יכול להיחשב מוכן להיות מוזרק רק כאשר זה לא להתפזר כאשר ירד במים. אם התחליב מתפוגג במים, זה אומר שהוא עדיין לא מוכן ודורש ערבוב נוסף.
דיוק טוב במהלך הליך הזרקת iv בזמן ממשל תא הוא קריטי. ראשית, זה מאוד חשוב להיות כמוהשעיה תא ingle, כמו ההזרקה של תאים מצטברים עלולה לחסום את הוורידים של העכבר המוזרק ולגרום למותו המיידי. כדי להבטיח את המיקום הנכון של המחט לווריד, זה תרגול טוב כדי לשאוב עם כמה מיקרוליטר המזרק של דם. במקרה של אי דם מגיע לתוך המזרק, המפעיל צריך לנוע באיטיות את המחט אחורה או קדימה עד למיקום הנכון הוא נמצא. רק בשלב זה יכול ההשעיה התא להיות מוזרקת באיטיות. חשוב מכך, יש בדרך כלל לא יידרש המפעיל להפעיל לחץ כלשהו על המזרק מאז הנוזל צריך לזרום בקלות בווריד. הזרקה לא נכונה תהיה בהכרח לגרום לנפיחות תת עורית המתאימות לאתר ההזרקה.
ראוי לציין כי בעתיד קרוב מאוד הוזרקו מערכתי NPCs2, 27, מהונדסים גנטי או לא, עשויים עצמם לייצג אופציה טיפולית, כמו גם לספק כלי חשוב להעברת מ 'חיסונייםתרופות odulatory ו / או הגנה עצבית וסוכני remyelinating פרו ישירות לתוך מערכת העצבים המרכזית 28. לכן, בעוד כמה מגבלות הקשורות למשלוח המערכתי של NPCs אכן קיימות, הן iv. וICV. מסלולים עשויים סופו של דבר מייצגים את הגישה טיפולית אלטרנטיבה חוקית באותם מחלות בי הזרקת המוקד של תאים לא מהווה פרוטוקול תקן זהב של טיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים ג'יידן סמית ללאור וההוכחה עורכת את כתב היד. עבודה זו קיבלה תמיכה מהאגודה הלאומית הטרשת הנפוצה (NMSS, מענקים חלקיים RG-4001-A1), הטרשת הנפוצה האגודה האיטלקית (AISM, להעניק 2010/R/31), המשרד האיטלקי לבריאות (GR08-7), כנפיים לחיים, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), המועצה האירופית למחקר (ERC) על פי הסכם ERC-2010-STG גרנט לא 260,511-SEM_SEM ותכנית מסגרת ה -7 של הקהילה האירופית (EC) (FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם n * מעלות; 280,772 - Ione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Papain | Worthington | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (coating solution) | BD Biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem Cell Technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg | PAA Laboratories | H15-011 | |
| Myco trace | PAA Laboratories | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Immunofluorescence | |||
| Normal goat serum | PAA Laboratories | B11-035 | |
| Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
| Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
| Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
| Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting solution | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | Sigma Aldrich | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35–55) | Espikem | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tools | 14060-09 | |
| Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tools | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 pipettes | |||
| Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 |
References
- Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
- Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
- Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
- Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
- Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
- Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
- Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
- Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
- Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
- Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
- Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
- Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
- Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
- Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
- Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
- Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
- Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
- Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
- Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
- Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
- Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
- Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
- Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).
