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Immunology and Infection

Inyección sistémica de Neuronales células madre / progenitoras en ratones con EAE crónica

doi: 10.3791/51154 Published: April 15, 2014

Summary

El trasplante de células madre / progenitoras neuronales (CPN) tiene grandes promesas en neurología regenerativa. La administración sistémica de NPC se ha convertido en el protocolo eficaz, de bajo invasiva, y terapéuticamente muy eficaz para entregar las células madre en el cerebro y la médula espinal de roedores y primates no humanos afectados por daño experimental inflamatoria crónica del sistema nervioso central.

Abstract

Células madre / precursoras neuronales (CPN) son una fuente prometedora de células madre para trasplante enfoques destinados a la reparación del cerebro o la restauración de la neurología regenerativa. Esta directiva ha surgido a partir de la amplia evidencia de que la reparación del cerebro se logra después focal o sistémica trasplante de NPC en varios modelos preclínicos de enfermedades neurológicas.

Estos datos experimentales han identificado la ruta de suministro de células como uno de los principales obstáculos de terapias con células madre de restauración para enfermedades cerebrales que requiere una evaluación urgente. Intraparenquimatosa injerto de células madre representa un enfoque lógico para aquellas patologías que se caracterizan por lesiones cerebrales aisladas y accesibles, tales como lesiones de la médula espinal y la enfermedad de Parkinson. Desafortunadamente, este principio es muy poco aplicable a condiciones caracterizadas por una naturaleza multifocal, inflamatoria y diseminada (tanto en tiempo y espacio), incluyendo la esclerosis múltiple (EM). Como tal, el cerebro dirigido por el sistla entrega de la APN emic se ha convertido en un protocolo invasiva y terapéuticamente eficaz bajo para entregar las células al cerebro y la médula espinal de roedores y primates no humanos afectados por experimental de daño inflamatorio crónico del sistema nervioso central (SNC).

Este método alternativo de suministro de células se basa en la pathotropism APN, específicamente su capacidad innata para (i) detectar el medio ambiente a través de las moléculas de adhesión de células funcionales y los receptores de citoquinas y quimioquinas inflamatorias; (Ii) cruzar las barreras anatómicas fugas después por vía intravenosa (iv). O inyección intracerebroventricular (icv); (Iii) acumular en el nivel de sitio múltiple perivascular (s) del daño cerebral y la médula espinal inflamatoria; y (iv) ejercer trófico tejido notable y efectos reguladores inmunes en diferentes células diana huésped in vivo.

Aquí se describen los métodos que hemos desarrollado para el iv. y <em> entrega icv de NPC singénicos en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), como modelo de desmielinización inflamatoria crónica del SNC, y prever la entrega sistémica de células madre como una técnica valiosa para la dirección selectiva del cerebro inflamado en neurología regenerativa.

Introduction

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Fuerte evidencia ha surgido a partir de los estudios in vivo que prueben la eficacia terapéutica del trasplante de células somáticas neurales madre / precursoras (NPCs) en modelos animales de trastornos del SNC 1-8. Sin embargo, una serie de cuestiones relativas a la entrega de las células madre en el huésped requiere una cuidadosa consideración antes de que estos resultados experimentales se pueden traducir en aplicaciones clínicas. Un obstáculo particularmente importante para el desarrollo de (hematopoyéticas) restaurativos terapias con células madre para enfermedades cerebrales, inflamatorias crónicas multifocales es la identificación de la ruta ideal de la inyección de la APN. Un firme entendimiento de la fisiopatología de la enfermedad específica (focal o multifocal; degenerativa inflamatoria o primaria primaria), y un análisis cauteloso de las cuestiones de viabilidad y de riesgo asociados con las técnicas de entrega son para identificar el protocolo óptimo para la entrega de células madre.

Mientras que el centro de coordinación ( (por ejemplo, el Parkinson y la enfermedad de Huntington, del cerebro y la médula espinal lesiones traumáticas, y accidente cerebrovascular), el mismo enfoque puede resultar a ser prácticamente no es factible en condiciones tales como MS, donde un daño en el SNC multifocal, crónica, y espacialmente diseminada acumula con el tiempo. En este último caso, apuntando a las inyecciones de células de coordinación para las lesiones individuales también se ve obstaculizada por la limitada capacidad de los NPCs trasplantadas a migrar a través de largas distancias dentro del parénquima del SNC, lo cual incitará a la identificación de métodos alternativos y más adecuados de focalización del SNC con los trasplantes de NPC menos invasivos .

Gran promesa surgió de las observaciones que se dirigen a los NPCs un tumor intracraneal (p. ej. Glioma) en ratones cuando se inyecta por vía intravascular fuera del CNS9. Después de esta seminalen evidencia in vivo de la pathotrophism de células madre 10, los datos extensos se han acumulado correspondiente a la viabilidad y la eficacia terapéutica de la trasplante sistémica de NPC en animales de laboratorio con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), como un modelo de daño inflamatorio del SNC, ya sea a través de vía intravenosa (iv) o intracerebroventricular (icv). NPC inyección 1,2,5,6,8 .. Hemos mostrado por primera vez que esto depende de la capacidad de los NPCs trasplantados para apuntar y para entrar en la inflamación del SNC, y participar posteriormente múltiple intercelular programas de comunicación dentro de microambientes específicos in vivo 11. Con el fin de centrarse específicamente en el sistema nervioso central, los personajes se entregan directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de distribución por la inyección icv, o en el torrente sanguíneo a través de la inyección iv. Una vez que entra bien en el torrente sanguíneo o en el LCR, NPCs trasplantados interactúan activamente conel hematoencefálica (BBB) ​​o sangre líquido cefalorraquídeo (BCSFB) barreras y entrar en el parénquima del SNC. Esta interacción entre el injerto APN y la acreditación (o BCSFB) está regulada por conjunto específico de moléculas de adhesión celular de la superficie de la APN (CAMs) y facilitada por la expresión de altos niveles de la leva contra-ligandos en endoteliales / células ependimarias activados 12-14. Ejemplos de estas levas incluyen el receptor de hialuronato, CD44, y la molécula de adhesión intercelular (ICAM) -1 ligando antígeno muy tardío (VLA) -4 5,15,16 (que, en los leucocitos, son responsables de la interacción con ependimal activado y células endoteliales), y en un grado de linfocitos asociado a la función de antígeno mucho más baja (LFA) -1 y el ligando glicoproteína P-selectina (PSGL) -1. NPC también expresan una amplia gama de receptores de quimioquinas, incluyendo CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, CXCR4 y (pero no expresan CCR3 y CCR7), que son funcionalmente activos, tanto in vitro como in vivo 5,16. Por lo tanto, systemicaNPC LLY inyectados utilizan estas levas, junto con la proteína G de receptores acoplados (GPCRs), a acumularse en el nivel de la inflamación del SNC. Por el contrario, los NPCs inyecta por vía sistémica en ratones sanos no entre al SNC a través vascular o cefalorraquídeo rutas espacio fluido 2. Inflamación del SNC, o la activación de células endoteliales / ependimal siguiente sistémica de citoquinas o lypopolisaccharide inyección (LPS) como un modelo de encefalitis inducida químicamente, por lo tanto, es necesario para la acumulación de NPC sistémicamente inyectados en el cerebro y la médula espinal 2. Por lo tanto, la orientación exitosa de la CNS con terapias sistémicas NPC depende de la identificación de una ventana específica de la enfermedad de la Oportunidad (WoO) en el que el cerebro y el medio ambiente de la médula espinal son propicias para la acumulación y la migración transendotelial de NPCs. Tales condiciones generalmente surgen en el contexto de la inflamación aguda y subaguda 17. Una vez que haya entrado en el sistema nervioso central, trasplantado NPCs indiferenciadasse ha demostrado para mejorar las características clínico-patológicas de los ratones, así como de mayor tamaño, primates no humanos con EAE. Esto ha sido descrito a ser dependientes de la sustitución célula mínima 2 y la secreción considerable de factores paracrinos reguladoras y neuroprotectores inmunes dentro perivascular CNS 2,5,6,18 vs no CNS zonas inflamadas 19,20 (por ejemplo, los ganglios linfáticos) en respuesta a la la señalización celular inflamatoria provocada por la infiltración de células inmunes 5.

Aquí se describe los aspectos metodológicos fundamentales de la inyección sistémica de NPCs somáticos en un modelo murino de EAE crónico. Más específicamente, se definen los protocolos que hemos establecido para (i) Obtenga, ampliar y prepararse para el trasplante NPCs somáticos de la zona subventricular (SVZ) de adultos C57BL / 6 ratones; (Ii) inducir la EAE crónica en tales ratones y (iii) realizar terapéuticamente eficaz sistémica (IV o icv) de la APN el trasplante iratones nto EAE.

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Protocol

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Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los principios de cuidado de los animales de laboratorio aprobados por el Ministerio del Interior del Reino Unido en virtud de los animales (procedimientos científicos) Act 1986 (PPL N º 80/2457 de SP).

1. Derivación de somática Neuronales células madre / progenitoras (CPN) de la zona subventricular (SVZ) del cerebro de ratones adultos

  1. Elaboración de instrumentos de disección y medios de comunicación
    NB: Estas dos soluciones se deben preparar 1-2 h antes de disecciones instrumentos están listos y precalentado a 37 º C por lo menos 20-30 minutos antes de su uso (que ayuda a diluir la papaína y optimiza la actividad de la enzima).
    1. Autoclave una tijera afilada recta, una pequeña tijera quirúrgica y dos pequeñas pinzas dentadas curvadas.
    2. Solución 'digestión': Prepare dos tubos de 50 ml separadas con:
      Solución # 1: 25 ml de solución salina equilibrada de ácido etilendiaminotetraacético (EBSS) + 10 mg (EDTA) + 10 mg de L-cisteína de Earle;y
      Solución # 2: 25 ml de EBSS + 50 mg de papaína.
    3. Preparar 'medio completo de crecimiento' (CGM): medio basal de ratón completo con los suplementos de proliferación de ratón, heparina de 0.002%, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF; 10 ng / ml), factor de crecimiento epidérmico (EGF; 20 ng / ml), y antibióticos (Pen / Strep).
  2. La disección del cerebro
    NB: La eliminación de los huesos temporales puede dañar fácilmente el tejido debido a su nitidez. Para evitar esto, para sujetar firmemente los huesos con las pinzas y tire hasta que se ha eliminado todo el hueso.
    1. Para cada preparación de NPCs, sacrificio por dislocación cervical n = 5-7, 4-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones.
    2. Limpie con etanol al 70% (en agua) el pelo de los ratones sacrificados y por detrás de las orejas con la tijera afilada recta para quitar de la cabeza;
    3. Se practica una incisión en la línea media usando un pequeño tijera quirúrgica para cortar la piel sobre el cráneo. Usando las pinzas, doblar los dos trozos de piel para exposicionese el cráneo.
    4. Con la pequeña tijera quirúrgica realizar dos pequeños cortes en la base del cráneo y retirar los huesos debajo de la protuberancia / médula (cráneo ventral). Continúe tirando de los huesos temporales. Con la misma tijera realizar un corte a lo largo de todo el cráneo, a partir de la base de las bombillas, sin dañar la superficie del cerebro. Además, realizar un corte entre los huesos frontales y los ojos, para facilitar la eliminación de los huesos parietales. Con dos pinzas empiezan retirar el cráneo tirando de cada uno de los huesos parietales hacia el exterior. Mientras tira, preste atención a las meninges, que puede dañar el cerebro cuando se deben extirpar los huesos.
    5. Una vez que el cráneo se ha eliminado, deslice la pinza entre el cerebro y el cráneo para separar completamente las meninges fueron. Levante ligeramente el cerebro contra el cráneo. Cortar los nervios ópticos para liberar el cerebro y finalmente recoger el cerebro en un tubo con frío tampón fosfato salino (PBS).
    6. Mantenga el tubo en un baño de hielod Repita el mismo procedimiento para todos los ratones.
  3. Ensayos de disección de la ZVS, neuroesfera de incorporación y mantenimiento
    Promedio del número de células x factor de dilución x 10 4

    Donde 10 4 representa la conversión del volumen total de la cámara de hematocitómetro (volumen total = 0,1 mm 3 -> 10-4 cm 3 -> 10-4 ml). Al considerar el factor de dilución, tanto el realizado con CGM y con la tinción vital tener que ser tomado en consideración. Como un ejemplo, si 160 células han sido contados en los 4 cuadrados de las esquinas, la densidad final (células / ml) de la suspensión celular será:

    160/4 x 5 (dilución con CGM) x 2 (dilución con tinción vital) x 10 4
    1. Encienda una campana de disección equipado con un microscopio de disección.
    2. Limpiar todas las superficies con etanol al 70% (en agua), y rociar con una solución anti Mycoplasma para reducir el riesgo de contaminación.
    3. Cubiertala parte inferior de un vaso de precipitados con una gasa estéril (para preservar instrumentos afilados) y llenarlo con etanol al 70% (en agua). Remojar en el vaso de precipitados de dos pares de pinzas, un par de micro tijeras y una cuchilla quirúrgica.
    4. Coloque todo el cerebro en la matriz de cerebro-máquina de cortar.
    5. El uso de dos hojas de afeitar realizan una coronal seccionar 2 mm desde el polo anterior del cerebro, con exclusión de las vías ópticas y 3 mm posterior al corte anterior; y colocar el tejido en una placa de Petri limpia.
    6. Bajo el microscopio de disección aislar el tejido SVZ y cortar en 1 mm 3 piezas con iridectomía tijeras. Repita el procedimiento para todos los cerebros.
      1. Mezcle bien las dos soluciones (sección 1.1.2) por encima y filtrar a través de un filtro de 0,22 micras inmediatamente después de que los cerebros se diseccionaron y los SVZs están listos para ser digerido.
    7. Transferencia de las secciones en 30 ml de solución 'digestión', resuspender suavemente con A10 pipeta ml e incubar 30 min a 37 ° C en 5% de CO 2. Cada 15 min sacuden suavemente el tubo de 2-3x.
    8. Centrifugar a 300 xg durante 10 min.
    9. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 200 l de CGM pipeteando primero con un P1000 y luego con una pipeta P200 (10-20x cada uno), hasta obtener una suspensión de células individuales.
    10. Tome la suspensión de hasta 5 ml con CGM y transferir a un matraz T25 cm2.
    11. Después de 5-7 días in vitro formarán (DIV) neuroesferas. Recoger la suspensión en un tubo de 15 ml y centrifugar 10 min a 150 x g.
    12. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 l de CGM.
      Disociar las neuroesferas mecánicamente haciendo pasar la células 100-150x con una pipeta P200, hasta obtener una suspensión de células individuales y llevarlo hasta 1 ml con CGM.
    13. Diluir la suspensión de células, por ejemplo, 10 l de suspensión celular en 40 l de CGM para obtener una dilución 1:05, y mezclar bien. Mezclar 10 l de la DILUTe suspensión celular con 10 l de un colorante vital y mezclar bien.
    14. Llene una cámara de recuento del hemocitómetro con 10 l de una suspensión de células 01:01: Solución colorante vital. Por separado contar el número de células (Azules) vivos (blancos) y muertas en las 4 casillas de las esquinas. Para determinar el número de células / ml, aplicar el siguiente cálculo:
    15. Resuspender 2 x 10 5 células en 5 ml de CGM y la transferencia a un matraz T25 cm 2;
    16. Repita secciones 1.3.11-1.3.12 cada 4-5 DIV. Desde el segundo paso de expansión en adelante, evaluar la viabilidad celular por exclusión de colorante vital y empezar a construir una curva de crecimiento continua en placas a una densidad clonal NPC (8.000 células/cm2), tal como se describe 21. Mantenga el número de células y repetir el procedimiento cada 4-5 DIV. Para generar una curva de crecimiento continuo, haga lo siguiente:
      NB: Para tener una buena preparación de células, después de 4-5 esferas DIV deberían haber alcanzado un diámetro de 150 a 200 micras. Para tener una buena estimación de tque la densidad celular, es importante encontrar un factor de dilución óptima con el fin de tener bien distribuidas, células que no se superponen a lo largo del hematocitómetro. Idealmente, no debería ser de entre 50 a 200 células totales. Al contar, sólo las células comprendidas en la plaza sin tocar los bordes tienen que ser considerados. Además, la viabilidad de las células es un factor crucial para tener una preparación saludable. Es importante destacar, que debería ser mayor de 90%. Una curva de crecimiento lineal es otro indicador de una preparación de células sanas.
      1. Contar el número de células vivas y muertas (por ejemplo, 1,3 x 10 6).
      2. Definir la tasa de crecimiento dividiendo el número de células vivas por el número de células cultivadas en placas (por ejemplo, 1,3 x 10 6/2 x 10 5 = 6,5).
      3. Calcular el número total de células multiplicando la tasa de crecimiento para el número total de células presentes en el punto de tiempo anterior (al inicio = 2 x 10 5).
      4. Indicar la media7; desviación estándar para construir una línea de tendencia lineal.
    17. A partir de pasaje 6, disociación mecánica se sustituye por disociación enzimática. Después de centrifugación a 150 xg durante 10 min, eliminar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 200 l de solución de disociación agregado celular, resuspender 7-8x con una P200 e incubar 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
    18. Resuspender 7-8x con una P200 para obtener una suspensión de células individuales y añadir 800 l de CGM. Contar las células (vivas y muertas) y establecer su viabilidad. Resuspender 2 x 10 5 células en 5 ml de CGM y la transferencia a un matraz T25 cm 2.
  4. Transducción viral de NPCs para el rastreo de células in vivo
    NB: Para verificar la eficacia de la transducción viral, construir una curva de crecimiento paralelo con NPCs transducidas y nontransduced. Además, la eficiencia clonal, que es el número absoluto de células formadoras de neuroesferas presente dentro de una preparación de célulasción o un análisis del ciclo celular por el contenido de ADN (con yoduro de propidio, PI), se pueden utilizar como otras indicaciones del estado de las células. Si el porcentaje de células infectadas no debe ser bueno, el protocolo de transducción viral se puede repetir una segunda vez con la misma población de células. Una vez que el nivel de infección es satisfactoria y la curva de crecimiento es similar a la obtenida con las células de tipo salvaje, NPC transducidas se pueden expandir y / o transplantadas.
    1. Recoger las neuroesferas y obtener una suspensión de células individuales. Placa las células en alta densidad (1,5 x 10 6 células en un matraz T75 cm 2) en 10 ml CGM.
    2. Después de 12 horas de añadir 3 x 10 6 TU / ml de un vector lentiviral pRRLsin tercera generación. PPT-ingeniería de hCMV con la E. coli derivada de β-galactosidasa (lacZ) o con la proteína fluorescente verde (GFP).
    3. 48 horas más tarde, cosechar las células, se centrifuga a 300 xg durante 10 min y replate las células a una proporción de 1:1.
    4. Después3 pasajes in vitro verificar la eficiencia de la infección. La citometría de flujo se utiliza comúnmente para probar la eficacia de la infección, y el satisfactorio nivel de infección es comúnmente aceptados para estar en el rango de 75 a 95% de células positivas. Comprobar de nuevo la eficiencia de la infección después de 3, otros pasajes de expansión para verificar el mantenimiento de la expresión del marcador.
  5. Neurosphere congelación
    1. Recoger las neuroesferas a partir de un matraz T25 cm 2, centrifugar a 300 xg durante 10 min, y descartar el sobrenadante.
    2. Resuspender el sedimento con 1 ml de medio de congelación (CGM con 10% dimetil sulfóxido (DMSO).
    3. Coloque los crioviales a -80 ° C dentro de un contenedor de congelación.
    4. Después de al menos 24 hr mover las células a una Caja criogénica y se almacenan a -80 ° C durante meses, o traer a nitrógeno líquido (N2) para un almacenamiento más prolongado.
  6. Neurosphere descongelación
    NB: Para evitar los efectos tóxicos de contacto prolongado of NPCs con DMSO, el proceso de descongelación debe ser lo más rápido posible.
    1. Retire el vial del -80 ° C / N 2 y mantenerla en hielo seco.
    2. Descongelar rápidamente el vial en un baño de agua hasta que casi toda la suspensión celular se descongela y sólo una pequeña pieza de suspensión permanece helado.
    3. Resuspender la suspensión de células con 5 ml de fresco y precalentado CGM.
    4. Centrifugar a 300 xg durante 10 min.
    5. Eliminar el sobrenadante, resuspender suavemente con 5 ml de fresco CGM y la placa de la suspensión de células en un frasco limpio y sin tratamiento T25 cm2.
  7. 1.7) Caracterización de la APN
    NB: El último lavado con PBS se puede sustituir con 0,05% de azida de sodio-PBS para prevenir el crecimiento de hongos o contaminaciones, y cubreobjetos se almacenan a 4 ° C durante 2-3 semanas.

    NB: Para la tinción de marcadores intracelulares agregar un agente de permeabilización a PBS en la solución de bloqueo. Si la fuente del anticuerpo primario es de cabra, Albumi de suero bovinoN (BSA) o suero de cabra que no sea deben ser utilizados.

    NB: Para las manchas de marcadores intracelulares utilizan un agente de permeabilización en la solución de anticuerpo primario.
    1. Coloque una coverslide vidrio de 13 mm en la parte inferior de una placa de 24 pocillos. Añadir 150 l de solución de recubrimiento en la parte superior de cada coverslide para crear una pequeña gota. Incubar durante al menos 30 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
    2. Recoger las neuroesferas y se disocian para obtener una suspensión de células individuales.
    3. Contar las células vivas y se diluye hasta obtener 80.000 cells/35 l. Retire el exceso de solución de revestimiento de la coverslide por aspiración suave, y la placa de los 35 l de suspensión celular.
    4. Incubar 25 min a 37 ° C, 5% de CO 2. Compruebe rápidamente en el microscopio de contraste de fase si las células han comenzado a adherirse.
    5. Preparar el medio de diferenciación mediante la mezcla de medio basal de ratón con los suplementos apropiados (véase el cuadro 1) y antibióticos (Pen / Strep).
    6. Añadir 400 l de medio de diferenciación y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2.
    7. Después de 3 DIV, cambio de la mitad del medio con medio de diferenciación fresco.
    8. Después de 6 DIV, se elimina el medio y lavar una vez con PBS. Bajo una campana química retirar el PBS y añadir 300 l de precalentado 4% de paraformaldehído (PFA) al 4% de sacarosa. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Retire la PFA y lavar 3 veces con PBS.
    9. Para continuar con inmunocitoquímica, retire el PBS y se bloquea con PBS 10% de suero normal de cabra (NGS) (solución de bloqueo), y se incuba 1 hora a temperatura ambiente.
    10. Eliminar la solución de bloqueo y añadir el anticuerpo primario diluido en PBS deseada 1% de NGS. Incubar a 4 ° CO / N o, alternativamente, 120 min a TA.
    11. Después de la incubación, lavar 2x con PBS. Incubar con el anticuerpo secundario apropiado diluida con PBS 1% de NGS. Incubar 60 min a TA.
    12. Lavar 2 veces con PBS y contra-teñir los núcleos con 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) diluido 1:20.000 con PBS agente de permeabilización durante 3 min a TA en la oscuridad. Lavar dos veces con PBS y una vez con agua destilada.
    13. Ponga una gota de medio de montaje en un portaobjetos de tejido de vidrio y con fórceps montar el coverslide con las células hacia el medio de montaje. Presione suavemente el coverslide para exprimir el exceso de medio de montaje. Deje el coverslide en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se seca el medio de montaje y almacenar a 4 ° C.

Autoinmunidad experimental 2. Mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG) inducida en ratones C57BL / 6

  1. Preparación de la emulsión
    1. En un vaso de precipitados de vidrio de preparar una emulsión compuesta de adyuvante incompleto de Freund que contiene 4 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis [defina de otro modo como el adyuvante completo de Freund (CFA)] y 200 g de MOG (péptido 35-55), teniendo en cuenta que la cantidad total de emulsión por ratón será de 300 l.
      NB: Consignación de Créditoscontroles TE de ratones inmunizados con MOG en CFA son ratones inmunizados con CFA solo. La varianza esperada de aparición de la enfermedad en los ratones inmunizados con MOG es de 11,3 (± 1,8) dpi.

      NB: Para el cálculo del volumen total de la emulsión es necesario, tener en cuenta el doble de volumen que el número de ratones por inmunizar. Material de vidrio se debe preferir a recipientes de plástico para minimizar la pérdida de parte de la emulsión.
      1. Con una jeringa de vidrio de la celebración de una mezcla de 19 G de la aguja durante aproximadamente 30 minutos, manteniendo siempre la emulsión en hielo.
      2. Para verificar si la emulsión está lista, deje caer una pequeña cantidad de emulsión en agua. La emulsión está listo para ser inyectado sólo si la gota se mantiene tal como es y no se dispersa.
      3. Inmunizar el grupo de control de ratones con sólo CFA. Tratar ratones experimentales (MOG inmunizado) con MOG en CFA. La varianza esperada de aparición de la enfermedad en ratones inmunizados con MOG es de 11,3 (± 1,8) dpi.
    2. Transfiera la aguja de 19 G a un 1 ml jeringa de plástico de unND aspirar la emulsión. Evite las burbujas, cambiar la aguja con un 25 G y dejar la jeringa en el hielo. Jeringas llenas con la emulsión son listo para ser utilizado y se deben mantener en hielo durante un par de horas.
  2. Inmunización
    1. Coloca los ratones (6-8 semanas de edad, mujeres) en una caja de calentamiento y espere unos 10 minutos para permitir que la vena de la cola se dilate.
    2. Transferir un ratón de la caja de calentamiento a una inmovilización del ratón. Cierre la inmovilización para evitar cualquier movimiento del mouse.
    3. Llene una jeringa de 1 ml de insulina con 100 l de la toxina pertussis (5 mg / ml), evitando hacer burbujas. Inyecte lentamente la solución en la vena de la cola. Retire la aguja y presionar durante unos segundos con un trozo de papel para tapar la hemorragia.
    4. Coloque el ratón en la jaula y repita el mismo procedimiento para todos los ratones.
    5. Anestesiar a un ratón con la inhalación continua de isoflurano (1-2%, 2 L / min) e inyectar 100 l de la emulsión por vía subcutánea a nivelde los dos flancos y la base de la cola (300 l de emulsión / ratón). Retire lentamente la jeringa, evitando la fuga de la emulsión.
    6. Marque el ratón con un golpeador oreja, coloque el ratón en la jaula y se les presentarán hasta la recuperación completa. Repita el procedimiento para todos los ratones.
    7. Después de 48 horas (2 días después de la inmunización, dpi) repetición de sección 2.2.3.
  3. El análisis del comportamiento de los ratones con EAE
    1. A partir de 5 dpi, pesar los ratones diariamente y controlar sus actuaciones locomotor utilizando el sistema de puntuación de la escala descrita en la Tabla 1.

3. La inyección de Neuronales células madre / progenitoras en la vena de la cola (iv)

  1. Preparación de las células
    1. Neuroesferas cosecha por centrifugación a 300 xg durante 10 min.
    2. Eliminar el sobrenadante y añadir 200 l de solución de disociación total de la célula. Incubar 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
    3. Resuspender 10-12x (avoiding burbujas) con un P200 hasta obtener una suspensión de células individuales y toman a 800 l con medio basal sin Ca 2 + y Mg 2 +.
    4. Contar las células mediante el uso de un colorante vital a ensayo de viabilidad celular y diluir la suspensión con medio basal sin Ca 2 + y Mg 2 + para obtener una densidad final de 10 6 cells/150 l. Mantener la suspensión de células en hielo hasta su uso.
  2. Inyección iv NPC
    NB: La disociación ideales en suspensión de células individuales y la ausencia de burbujas de aire son dos aspectos clave a tener en cuenta para reducir el riesgo de cualquiera de grumos / agregados vs formación de émbolos que puedan dar lugar a la oclusión de la vena y la consiguiente muerte.
    1. En el pico de la enfermedad (16-18 dpi), pesar y anotar los ratones. Distribuir los ratones según la puntuación obtenida con el fin de tener grupos homogéneos.
    2. Coloca los ratones en una caja de calentamiento y espere unos 10 minutos para permitir que la vena de la cola se dilate. Transferir un ratón de la caja de calentamiento a una inmovilización del ratón. Cierre la inmovilización para evitar cualquier movimiento del mouse.
    3. Llene una jeringa de insulina de 1 ml con 150 ml de suspensión celular y asegúrese de eliminar todas las burbujas. Inyecte lentamente la solución en la vena de la cola. Retire la aguja y presionar durante unos segundos con un trozo de papel para tapar la hemorragia (Figuras 6A y 6B).
    4. Coloque el ratón en la jaula y se les presentarán hasta la recuperación. Repita el mismo procedimiento para todos los ratones.

4. Inyección de Neuronales células madre / progenitoras en la cisterna magna (icv)

  1. Preparación de las células
    1. NPCs Cosecha por centrifugación a 300 g durante 10 min.
    2. Eliminar el sobrenadante y añadir 200 l de solución de disociación total de la célula. Incubar 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
    3. Resuspender 10-12x con un P200 hasta obtener una sola csuspensión ell y tomar a 800 l con medio basal sin Ca 2 + y Mg 2 +.
    4. Contar las células y se diluye la suspensión con medio basal sin Ca 2 + y Mg 2 + para obtener la densidad celular deseada. Mantener la suspensión de células en hielo hasta su uso.
  2. 4.2) la inyección icv NPC
    1. En el pico de la enfermedad (16-18 dpi), pesar y anotar los ratones. Distribuir los ratones según la puntuación obtenida con el fin de tener grupos homogéneos.
    2. Coloque el ratón en un aparato estereotáxico bajo inhalación continua isoflurano (1-2%, 2 L / min). Fije la cabeza del ratón con las barras de oído. A continuación, ajuste la boca y nariz piezas. Asegúrese de que la cabeza del ratón es plana y fija.
    3. Limpie la cabeza del ratón con povidona yodada (PVP-I) y hacer una incisión para cortar la piel en la parte posterior de la cabeza para exponer el cráneo.
    4. El uso de un micromanipulador, inserte la punta de un microlitrojeringa ITER en la hendidura entre el occipucio y la vértebra Atlas a través de los músculos y ligamentos intactos en la línea media en la parte posterior del cuello. La parte doblada de la aguja se mantiene en estrecho contacto con la superficie interna del occipucio para toda la longitud, tal como se describe 22.
    5. Introduzca lentamente la aguja y espere unos segundos. El operador tiene la intención de aprender a reconocer la sensación de la aguja de ser "enganchado" en el cráneo del ratón, antes de iniciar la inyección de la preparación de células. Lentamente inyectar el volumen de células (dentro de 3-5 min). Deje la aguja en su lugar durante unos segundos adicionales después de la inyección y retire lentamente la jeringa.
    6. Suturar la piel y colocar el ratón en una jaula de recuperación hasta la recuperación completa.

5. Procesamiento de tejido

  1. Profundamente anestesiar a los ratones con una mezcla de 0,5 ml de ketamina (100 mg / ml), 0,25 ml de xilazina (23,32 mg / ml) y 4,25 ml de agua estéril y transcardically perfundir, Wincineración con solución salina-EDTA y la fijación con 4% PFA. Retire las dos columnas vertebrales y cerebros y Postfix en PFA al 4% durante 12 horas a 4 ° C. Lavar el tejido en PBS, eliminar las médulas espinales de los huesos y dejar el tejido al menos 48 h en 30% de sacarosa (en PBS) a 4 ° C. Incrustar los tejidos de la temperatura óptima de corte (OCT) compuesto y encaje congelación con nitrógeno líquido, tal como se describe 2.
  2. Utilice un micrótomo para cortar los tejidos en 10-12 micras rodajas gruesas.
  3. Alternativamente, incrustar tejido fresco en agarosa y cortar el tejido en un vibrátomo 50-80 micras rodajas gruesas.
  4. En los dos casos, incubar O / N a 37 ° C en D-galactopiranósido (X-gal) solución para detectar la actividad β-galactosidasa nuclear indolil-β-3-cloro-5-bromo-4.
  5. Volver a cortar las secciones que contienen las células β-gal + en 5 micras rodajas y doble tinción utilizando proteína fibrilar ácida antiglial (GFA) de astrocitos (50 mg / ml), el antígeno nuclear antineuronal (NeuN) para las neuronas (1 &# 956; g / ml) y antiNestin para las células neuronales no diferenciadas (10 g / ml).
  6. Proceda como se describe en las secciones 1.7.11 y 1.7.12. Para múltiples coloraciones asegúrese de utilizar anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluorocromos.
  7. Para tejidos que contengan células GFP etiquetados proceda según se explica en los pasos 5.1 a 5.3 y proceder con las múltiples coloraciones.
  8. Añadir unas gotas de medio de montaje a los portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos de tejido.
  9. Por secciones teñidas con anticuerpos conjugados con biotina preparar una solución de complejo avidina biotina (ABC solución, véase el cuadro 2) y dejar en agitación durante 45 min.
  10. Incubar la rodajas de 5 min con 1% de H 2 O 2 para bloquear la actividad de peroxidasa endógena.
  11. Lavar dos veces con PBS.
  12. Incubar con solución ABC durante 1 hora a temperatura ambiente.
  13. Lavar dos veces con PBS.
  14. Incubar con una solución de 3,3 '-diaminobenzidina y el 0,3% de H 2 O 2. Supervisar la ONU reacciónder un microscopio y lavar con PBS tan pronto como el segmento comienza a recibir marrón (generalmente alrededor de 5-10 min).
  15. Lavar dos veces con PBS y proceder como se describe en el paso 5.7.

Lista completa de los materiales y reactivos se muestra en la Tabla 2.

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Representative Results

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NPC derivación y caracterización
Disecciones SVZ se realizan en piscinas (n = 5-7 ratones / piscina) de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones por medio de disociación mecánica y enzimática (Figura 1A). Después de unos pocos días de cultivo en CGM, neuroesferas de libre flotación comienzan a formarse (Figuras 1A y 1B). Esferas primarias se recolectaron y mecánicamente a pases cada 4-5 DIV. Al pases, número de células vivas y muertas y se determinan el número de células acumuladas representan gráficamente para generar una curva de crecimiento (Figura 1C). Esto da una indicación de la velocidad de propagación, proporcionando así un parámetro indirecto para evaluar la estabilidad global de la preparación de la APN. Cuando proliferación como neuroesferas, NPC expresan marcadores de la actividad mitótica (fosfato histona H3, phh3; 5 g / ml) y de células neuronales no diferenciadas (por ejemplo, nestina) (Figura 2A). NPCs no diferenciadas que se encuentran para ser terapéuticamente efficacious en la EAE después del trasplante debe expresar moléculas de adhesión de la superficie celular que incluyen CD44 (5 g / ml), la subunidad α4 de VLA-4 (10 g / ml) (Figura 2F). Cuando se siembran en condiciones de diferenciación apropiadas, NPC expresan marcadores típicos de los tres linajes neuronales, (Figura 2B), tales como el marcador GFAP astroglial (Figura 2C), los microtúbulos marcador neuronal asociada proteína-2 (MAP-2; 5 g / ml ) (Figura 2D) y los marcadores oligodendroglial O4 (5 mg / ml) y proteína básica de mielina (MBP; 10 g / ml) (Figura 2E), lo que confirma que NPC son multipotentes hacia los tres principales linajes neuronales. Para facilitar la identificación de las células trasplantadas in vivo, NPCs son transducidas con lentivirus de ingeniería a los genes indicadores expresan de forma estable, como las buenas prácticas agrarias. NPCs transducidas expresan GFP tanto como la proliferación de neuroesferas (Figuras 3A y 3C), así como cuando la diferenciación in vitro sobre la retirada del factor de crecimiento (Figura 3B). Para verificar la eficacia de la transducción, la expresión de GFP se analizó mediante citometría de flujo, comenzando tan pronto como 3 pasos después de la transducción de células (que es permitir el tiempo suficiente para tener una expresión robusta del transgén introducido en el nivel de proteína). Al aplicar los lentivirus de tercera generación a los NPCs in vitro, se observa consistentemente> 90% de células que muestran altos niveles de GFP a través de múltiples experimentos independientes (Figura 3C), ni con toxicidad manifiesta ni cambios en la proliferación, al comparar las curvas de crecimiento de tipo salvaje y lenti-GFP NPCs transducidas (Figura 3D).

Inducción de EAE crónica
EAE es una de las modelos más caracterizados de la EM, ya que recapitula la mayoría de los eventos patológicos y clínicos de la EM. La inmunización de ratones C57BL / 6 con MOG35-55 conduce a el DESARROLLOt de una forma crónica de la EAE. Al acercarse a la aparición de la enfermedad (11,3 ± 1,8 ppp) durante la fase de inducción (preclínicos), los ratones inmunizados con MOG comienzan a perder peso (Figura 4). Al comienzo de la fase efectora / invasión (pico clínica; 16,8 ± 3,2 dpi) ratones EAE alcanzan el pico de la enfermedad (puntuación de 3,5 ± 0,7), y poco después de alcanzar un máximo que muestran una recuperación progresiva y parcial que finalmente se estabiliza durante la crónica fase (clínica estable) de alrededor de 30 dpi en adelante (puntuación de 2,8 ± 0,9) (Figura 4B). Numerosos estudios, entre ellos algunos EAE investigar ya sea por microscopía intravital 23 o la resonancia magnética 24, junto con la patología del tejido in vivo, se han identificado en el pico de la fase efectora / invasión (16-22 ppp), la oportunidad ideal (WoO) en el que realizar las terapias experimentales sistémicos con células madre destinadas a entrar en la inflamación crónica del SNC de EAE y protegerla de d secundariaamage.

Inyección de NPC
NPCs Singénicos inyectados sistémicamente en ratones con EAE (Figura 6) se encuentran casi exclusivamente en áreas perivasculares de daño en el SNC, tanto en el cerebro (Figura 5A) y la médula espinal (figuras 5B-D), hasta 45 días después del trasplante (dpt), como se describe IV 5.. inyectados NPCs conservan preferentemente un inmaduro, Nestin + (Figura 5C) fenotipo, mientras que pocos NPCs salir de la zona perivascular expresar NeuN (Figura 5D). Es de destacar que los NPCs inyecta iv en controles sanos no logran entrar en el sistema nervioso central a través de la vía vascular (Figura 5E). Después de la inyección iv de la APN, un número significativo de NPC inyectados se encuentran a nivel de los órganos no del SNC tales como el hígado, intestino, bazo, pulmón y riñón, pero no el corazón, tan pronto como 10 dpt (Figura 5F). NPCs no CNS acumulación están completamente libres de thes e los órganos periféricos de 30 dpt (Figura 5G).

Figura 1
Figura 1. Aislamiento de los PNJ de la SVZ de ratones adultos y generación de forma estable ampliables líneas de la APN. A, representación esquemática de los principales pasos críticos de la generación de forma estable ampliable, y la preparación de los NPCs ratón inyectables. B, Neuroesferas in vitro. C , NPCs cultivaron como neuroesferas se pasan cada 4-5 días. Números de células vivas y muertas se recogen y el número de células acumuladas representan gráficamente para generar una curva de crecimiento. La barra de escala en B es de 200 micras. Los datos de C son número acumulativo medio de células ± SD (n = 3).

gura 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51154/51154fig2.jpg "/>
Figura 2. Caracterización NPCs. A, que proliferan neuroesferas ratón expresan la proteína histona núcleo phh3 (verde), y la proteína de filamentos intermedios de tipo VI Nestin (rojo). Ser, después de 6 DIV en condiciones de diferenciación, NPCs son multipotentes hacia astroglial (GFAP, rojo en C), neuronal (MAP-2, verde en D) y oligodendrocitos (O4, verde en E, y MBP, de color rojo en la E) linajes. Cuantificación de GFAP, MAP-2-, y las células O4 expresan en 6 DIV después NPC diferenciación in vitro se demostró en B. Los datos en B son como media ± SD% (n = 3). Las barras de escala en CE son 50 micras. F, citometría de flujo análisis de la expresión de las principales moléculas de adhesión de la superficie celular que regulan leukocyte extravasación en neuroesferas ratón. Figura 2F es una traducción automática Pluchino et al. 2

Figura 3
Figura 3. Transducción de NPCs con lentivirus que expresan genes indicadores (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias. A y B, las imágenes de contraste de fase de neuroesferas (A) y NPCs diferenciadores (B) que han sido transducidas con lenti-GFP vector de 3 ª generación. Citometría de flujo de los NPCs en A. C, de tipo salvaje (no transducidas) y lenti-GFP NPCs transducidas cultivadas como neuroesferas se pasan cada 4-5 días. Se recogen los números de células vivas y muertas, y el número de células acumuladas trazan para generar una curva de crecimiento. La barra de escala enA y B es de 200 micras. Los datos de C son número acumulativo medio de células ± SD (n = 3).

Figura 4
Figura 4. Caracterización funcional de la EAE crónica. A, de peso diario en el seguimiento de MOG-e inmunizado CFA-ratones C57BL / 6 sobre un total de seguimiento de 40 dpi. B, monitoreo puntuación diaria EAE en MOG-e inmunizados con CFA ratones C57BL / 6 sobre un total de seguimiento de 40 dpi . Los datos se expresan los números como medios ± SD (n = 10 ratones / grupo).

La figura 5
Figura 5. Sistémicamente inyecta NPCs migrcomió en el parénquima de los ratones EAE. AE, tinción con X-gal de vibratomo de corte (70 micras) del cerebro (A) y la médula espinal (B) secciones de tejido de ratones EAE inyectaron iv con NPC singénicas, que muestra + células β-gal trasplantados ( NPCs células azules) que persisten dentro de las áreas del SNC perivasculares hasta el final del seguimiento clínico (106 dpi). C, β-gal + iv. inyectó (Azules) que persisten dentro de las áreas del SNC perivasculares, conservar una Nestin + (marrón) fenotipo. D , pocos NPCs que migran expresan NeuN + (marrón), siempre y cuando se trasladan fuera de la zona perivascular. E, tinción con X-gal en una sección de la médula espinal representante de una EAE ratón tratado de referencia. . Las barras de escala, 20 micras de FG, el análisis de tejidos que no sean el SNC muestra que la CI -. NPC o IV. Inyectados-(células azules) alcanzan prácticamente todos los órganos (. Por ejemplo, pulmón, hígado, bazo, corazón, intestino, riñón) ingeniohin 10 dpt (F), pero se eliminan de los mismos órganos en un 30 dpt (G). Figuras 5A-E se reproduce de referencia 5, mientras que las figuras 5F-G se reproduce de Pluchino et al. 2

La figura 6
. Figura 6 Representación esquemática del protocolo para la inyección sistémica de NPC en ratones con EAE principales pasos críticos de la inyección sistémica de NPC en ratones con EAE:. Desde la preparación de la CAM inyectable célula que expresa sola disociada NPC la sala de cultivo de células (A) , a la inyección en la vena de la cola de los ratones con EAE en el pico de la fase de la enfermedad efector / invasión (B), hacia la detección in vivo de los NPC inyectados que se han dirigidoel SNC (C), para los estudios patológicos in vivo de tejidos que permiten el estudio de los mecanismos de plasticidad terapéutico de NPC inyectados (D). En D, las células son verdes en oligodendrocitos, las células de color azul oscuro son los axones, las células de color azul claro se trasplantan NPCs, naranja células son los astrocitos, y glóbulos rojos son las células endoteliales.

<td> 2.5
Puntuación Respuestas Locomotor
0 Ratón normal. No hay signos evidentes de enfermedad
1 Cola Limp: flacidez completa de la cola, y la ausencia del curling en la punta de la cola cuando un ratón es recogido
1.5 Hind debilidad de las extremidades: el ratón muestra desconexiones ocasionales y breves al caminar sobre una marcha de pato
2 Cola flácida y debilidad de las extremidades traseras: cuando se coloca sobre la espalda, el ratón no puede girar a su posición normal
Parálisis de las extremidades traseras parcial: el ratón ya no puede utilizar las extremidades posteriores para mantener la postura de cadera o caminar, pero todavía se puede mover uno o ambos miembros posteriores, en cierta medida, los miembros anteriores no se verán afectados
3 Completar extremidad posterior parálisis: pérdida total de movimiento en las extremidades posteriores. El ratón se arrastra sólo en sus extremidades anteriores, que no se ven afectadas. Ratones en esta etapa se les da comida en el suelo de la jaula, tubos para sorber largos, y la inyección subcutánea diaria de soluciones hidratantes para evitar la deshidratación. Si los ratones desarrollan úlceras o lesiones en la piel que no se recuperan con el tratamiento, serán sacrificados en condiciones decentes
3.5 Miembro Anterior debilidad: cuando el lugar en una cuadrícula vertical, el ratón no es capaz de subir y poco a poco cae
4 Estado moribundo
5 Ratón encontrado muerto o sacrificado de acuerdo con los puntos finales humanitarios

Table 1. Cinco escala etapa de los signos clínicos y parálisis ascendente en ratones con EAE.

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Discussion

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Terapias basadas en células madre somáticas están surgiendo como una de las estrategias más prometedoras para el tratamiento de trastornos del SNC inflamatorias crónicas tales como MS2 11. Aunque todavía tienen que ser completamente dilucidado los mecanismos que sustentan sus efectos terapéuticos, el impacto significativo de la APN el trasplante en diferentes modelos experimentales de enfermedades neurodegenerativas ha dado lugar a la creencia de un tanto provocativa que las células madre pueden pronto ser aplicados en estudios con humanos. Sin embargo, antes de prever cualquier posible aplicación en humanos de este tipo de terapias innovadoras que necesitamos para hacer frente a algunas cuestiones clave y abordar algunas de las preguntas sin respuesta, tales como la identificación de la fuente ideal de células madre para el trasplante (autólogo vs alogénico, pluripotentes vs multipotentes) y la mejor ruta de la administración.

Las enfermedades neurodegenerativas se diferencian en sus fisiopatologías, con un poco de estar confinado en el espacio (por ejemplo. La médula espinal enjurado, accidente cerebrovascular), mientras que otros se caracterizan por una diseminación temporal-espacial (por ejemplo, MS). Se deriva que la inyección focal de las células (madre) puede ser un tratamiento adecuado para la antigua, si bien puede ser inadecuada o simplemente inviable para este último, donde la presencia de múltiples sitios de daño cerebral representa un desafío adicional que hay que superar.

Evidencia consistente ha demostrado que la administración intravenosa puede representar un protocolo válido (y bajo invasiva) para la administración de las células, con el apoyo de la capacidad intrínseca de las células madre para sentir el ambiente y, específicamente, la casa hacia el sitio (s) de daño. Sin embargo, la traducción de las terapias sistémicas NPC en clínicas todavía se ve obstaculizada por unas pocas limitaciones, tales como la posible acumulación de células trasplantadas en órganos no CNS periféricos (por ejemplo, pulmones, el bazo, los ganglios linfáticos y los riñones) que pueden o no pueden ser sitios de las respuestas inflamatorias locales in vivo. Si bien esto acum inespecíficaulación de NPC inyectados fuera del objetivo del SNC se borra rápidamente en ratones con EAE2 crónica, hay evidencia de la persistencia a largo plazo de la APN (o en algunos casos la segmentación exclusiva) a nivel de los órganos linfoides secundarios (por ejemplo. ganglios linfáticos y el bazo) después de la inyección sistémica en ratones con recaídas EAE5 19,20. El hecho de que un número significativo de NPC trasplantados recirculan hacia órganos no CNS crea un efecto de dilución, lo que reduce inevitablemente el número absoluto de NPC en el SNC. Curiosamente, sistémicamente inyectaron NPCs son terapéuticamente eficaz (por ejemplo, a través de acciones de regulación inmune), incluso cuando la acumulación exclusivamente fuera de la CNS 19,20. Y los efectos terapéuticos generales de NPCs inyectados dirigidas a la CNS sólo 5 o los ganglios linfáticos sólo 19 son comparables. Esto puede, en parte, debido a una plasticidad intrínseca de las células, que responden de manera diferente a los componentes moleculares de la surrounding microambiente. Cabe destacar que, si por un lado NPC trasplantados pueden sentir la presencia de citoquinas inflamatorias y ejercer su efecto terapéutico a través de mecanismos inmunomoduladores 16, por otro lado, pueden entrar en contacto con microambientes hostiles en última instancia conduce a la formación de tumores 25,26. Por estas razones, la opción preferida es en la actualidad para concentrar NPC inyectados en el SNC. Como tal, la administración intratecal (a través de una ruta lumbar o cisternal) es todavía la ruta prospectivo más aceptado de administración en los ensayos clínicos. Sin embargo, la multifocalidad y la heterogeneidad patológica de las lesiones de EM pueden limitar la eficacia de este enfoque.

Aquí se describe un protocolo eficiente para aislar, mantener y caracterizar progenitores neurales de ratón de la SVZ adultos y sucesivamente, cómo sistémicamente (tanto iv e ICV) inyectar NPC en ratones afectados por EAE crónica, uno de los más Stumodelos de MS muerto. Aunque relativamente simple y directo, estos protocolos presentan algunos pasos críticos que deben ser tomados en consideración. Al principio, es obligatorio para obtener una preparación de células de manera estable expandible y saludable. Tal como se describe durante todo el protocolo, la estabilidad de las células se puede inferir indirectamente al ver su tasa de crecimiento. Idealmente, deben neuroesferas alcanzan un diámetro de 150-200 micras cada 4-5 DIV y el porcentaje de muerte celular en pasajes deben ser muy bajo (menos de 10%). También, neuroesferas deben presentar una forma redonda compacta y regular en el microscopio. La infección con lentivirus puede interferir con la supervivencia y la estabilidad de las células. Para obtener una infección óptima, es obligatorio para obtener una titulación del virus de interés suficiente para obtener 3 x 10 6 TU / ml. De hecho, mientras por un lado una baja cantidad de virus podría conducir a un pequeño porcentaje de las células infectadas, por otra parte el uso de una alta cantidad parecierad probable conducir a un efecto de toxicidad (fuertemente dependiente de la gen de estar infectados). NPC pueden ser infectados múltiples veces con virus que se integran, si el resultado de la primera transducción de plomo a bajo porcentaje de células viables positivos del transgén. Siempre es una buena práctica tener comparación experimental dentro de los parámetros de estabilidad y viabilidad con el tipo salvaje, nontransduced, controla NPCs. En cuanto a la inducción de la EAE crónica, la parte más problemática está representado por la preparación de la emulsión. Como se ha descrito, la cristalería y el hielo deben ser de uso en todo momento. La preparación de la emulsión toma 30-45 minutos, y puede ser considerada lista para ser inyectada sólo cuando no se dispersa cuando se deja caer en el agua. Si la emulsión se disipa en agua, esto significa que aún no está listo y requiere una mayor mezcla.

Buena precisión durante el procedimiento de inyección IV en el momento de la administración de células es crítico. En primer lugar, es muy importante tener comosuspensión celular ingle, como la inyección de células agregadas puede obstruir las venas del ratón inyectado y conduciría a su muerte inmediata. Para asegurar la colocación correcta de la aguja en la vena, es una buena práctica para aspirar con la jeringa pocos microlitros de sangre. En el caso de la sangre no entra en la jeringa, el operador debe mover lentamente la aguja hacia atrás o hacia adelante hasta encontrar la ubicación correcta. Sólo en este punto puede la suspensión celular se inyecta lentamente. Es importante destacar que el operador debe normalmente no ser necesaria para aplicar cualquier presión en la jeringa ya que el líquido debe fluir fácilmente en la vena. Una inyección inadecuada daría lugar inevitablemente a una hinchazón subcutánea correspondiente al sitio de la inyección.

Vale la pena señalar que, en un futuro muy cercano sistémicamente inyecta NPCs2, 27, genéticamente modificado o no, pueden ellos mismos representar una opción terapéutica, así como proporcionar una herramienta importante para la entrega de m inmunológicomedicamentos odulatory y / o neuroprotectoras y agentes remielinizantes pro directamente en el SNC 28. Por lo tanto, si bien existen algunas limitaciones relacionadas con la administración sistémica de NPCs, tanto iv. e ICV. rutas última instancia, puede representar alternativa terapéutica válida en aquellas enfermedades en las que la inyección focal de las células puede no constituir el protocolo estándar de oro del tratamiento.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Jayden Smith por su revisión crítica y la edición de la prueba el manuscrito. Este trabajo ha recibido el apoyo de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (NMSS, becas parciales RG-4001-A1), la italiana Asociación de Esclerosis Múltiple (AISM, concede 2010/R/31), el Ministerio de Sanidad italiano (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), el Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del acuerdo de ERC-2010-STG subvención sin el Programa Marco de la Comunidad Europea séptimo (CE) 260511-SEM_SEM y (FP7/2007-2013) en virtud de Acuerdo de subvención n * el grado; 280772 - iONE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
EBSS Sigma E2888
L-Cystein Sigma Aldrich C7352
Papain Worthington 30H11965
EDTA Fisher Scientific D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult proliferation supplements Stem Cell Technologies 05701
Heparin Sigma H3393
Basic fibroblast growth factor Peprotech 100-18B-1000
Epidermal growth factor Peprotech AF-100-15-1000
Pen/Strep Invitrogen 1514012
Matrigel (coating solution) BD Biosciences 354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) Stem Cell Technologies 05704
Accumax eBioscience 00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg PAA Laboratories H15-011
Myco trace PAA Laboratories Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum PAA Laboratories B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether Sigma Aldrich T8787
Mouse anti Nestin Abcam ab11306
Rabbit anti GFAP DAKO 203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)  Abcam ab14955
Rabbit anti MAP-2 Abcam ab32454
Rat anti MBP AbD SEROTEC MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 Millipore MAB345
DAPI Invitrogen D1306
Mounting solution DAKO S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete Sigma Aldrich F5506
Mycobacterium tuberculosis DIFCO H37Ra
MOG(35–55)  Espikem
Pertussis toxin List Biological Laboratories 181
Tissue processing
Iris scissor straight Fine Sciences Tools 14060-09
Blunt/bended forceps Fine Sciences Tools 11080-02
Brain slicer Zivic Instruments BSMAS005-1
Surgical blades Swann-Morton 324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar) Boehringer Ingelheim 01LC0030
Xylazine (Rompun) Bayer 32371
Stereotaxic frame KOPF Model 900
Hamilton syringe Hamilton 7762-04
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Inyección sistémica de Neuronales células madre / progenitoras en ratones con EAE crónica
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Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).More

Donegà, M., Giusto, E., Cossetti, C., Schaeffer, J., Pluchino, S. Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE. J. Vis. Exp. (86), e51154, doi:10.3791/51154 (2014).

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