Introduction
尿外来体是尿空间正常和病理条件下，包括肾小球足细胞，肾小管细胞和细胞衬里，似乎是富集的miRNA 1的尿液引流系统下，来自所有类型的细胞多泡体（MVB）100nm的小囊泡内-2。许多研究人员已经发现不同的蛋白质在外来体从尿健康个体以及那些有肾和/或系统性疾病3-5隔离。外来体可以使用不同的方法，如两步骤差动超速离心有或无蔗糖6-7分离，结合纳米薄膜过滤器与超速离心8-9，或沉淀10-11。我们最近开发出一种简单，快速，可扩展，有效的方法来隔离尿外来体和检测miRNA与蛋白质生物标志物11。虽然生物标志物可以以各种不同的生物流体的检测出来，乌尔INE是患者的，因为它可以大量在相对非侵入性的方式获得的肾和泌尿道疾病的最方便的选择。
虽然有几种方法以分离尿液外来体6-11，最常用的方法依赖于微分超速离心用30％的蔗糖垫。虽然这种方法是有效的，并分离出与此过程所产生的外来体的质量是高的，该技术本身需要熟练的人员，是费时的，需要几个超速离心步骤。其他的方法，如过滤和沉淀，已经开发了用于外来体的分离，其中包括一个使用一个专有的沉淀试剂（ 即 ExoQuick-TC：系统Biosciences公司;加州山景城）。虽然用这个试剂沉淀是快速和相对容易的，相比于超速离心甲基分离的外泌体的纯度低OD。我们最近比较六种方法尿外来体的分离，包括使用ExoQuick-TC，我们开发了在我们的实验室11内的沉淀法的变形例。我们发现，这种改性沉淀法产生更高量的蛋白质，的miRNA和mRNA的并且过程本身是更快和更容易实现比超速离心。在这里，我们描述了在一个逐步的方式修改后的沉淀法的实验方案，并包括这种技术与外来体分离的其他方法相比的优点和缺点的讨论。改性沉淀方法包括外来体颗粒的初始沉淀，然后除去TH糖蛋白，它是相关与外来体蛋白，以及已知的，以减少从尿液外来体的产率。我们发现，这些修饰增加了从尿液外来体制剂的产率和纯度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：涉及采用改良沉淀法的尿中外来体的分离的步骤示于图1中的初始步骤涉及去除大的死细胞和细胞碎片通过离心。从每个后续步骤所收集的上清液中得到的最终沉淀对应于外来体，将其溶于蛋白质，RNA和DNA的进一步萃取分离溶液。
1.收集尿
- 之前收集尿液，根据制造商的说明制备蛋白酶抑制剂混合物，并添加3.125毫升此鸡尾酒到空的无菌容器中。含有蛋白酶抑制剂的管子就可以分发到志愿者尿液收集。
注：之所以添加蛋白酶抑制剂，是尽量减少尿样中蛋白降解。虽然我们专门用一种蛋白酶抑制剂的鸡尾酒西格玛，其它市售的蛋白酶抑制剂可以被取代。 - 收集大约10毫升第一无效尿液。处理尿不储存或冷藏收集后立即使用。在隔离使用修改后的沉淀法重复尿外来体;的重复中的一个是用于DNA，总RNA和蛋白质的提取，而另一种是对泌尿外来体颗粒的定量。
注：24小时尿样可以通过存储在4℃可收集切体隔离。
2.去除细胞碎片和TH糖蛋白（THP）
- 传送尿液样本到15ml离心管中。离心机将10ml的尿液在17000×g离心10分钟，在37℃下，以消除细胞和细胞碎片（ 图1）。
- 使用移液管，将上清转移到新的管中，以便进一步处理。重悬在500μl的隔离溶液的粒料（250毫蔗糖，10mM的熬炼anolamine，pH值7.6），接着用10分钟温育与DL-二硫苏糖醇（DTT：终浓度200毫克/毫升），在37℃。
注：DTT加到降解的THP，该捕获外来体，导致降低产率。照顾留上清液转移期间不受干扰的沉淀，并确认上清液是清澈粒料。 - 涡旋药丸样品每2分钟，直到沉淀完全溶解。然后加入500μl的隔离溶液溶解的颗粒。
- 紧接着加入隔离解决了沉淀，离心机在17000×g离心10分钟，在37℃。吸管将上清液与结合早期收集上清液。
- 重悬在50μl的SDS-PAGE分析分离溶液中的沉淀。
注：PBS或TBS，可以用来代替分离溶液，以悬浮颗粒。
3.隔离外来体颗粒的
- 到11毫升收集supern的atant，添加3.3 ExoQuick-TC试剂中并孵育在4℃下至少12小时。
注：上清液ExoQuick-TC试剂的体积的比例可以进行调整，以增加或减少外来体的产率。我们观察到，较小的体积加入试剂生产外来体的小产量。 - 培养后，离心样品/ ExoQuick-TC的混合物在10,000rpm×g离心30分钟，在25℃下。
- 将上清液转移到新的管中进行SDS-PAGE分析。
- 外来体粒料可以储存在-80℃用于DNA，RNA和蛋白质的提取，并使用酶联免疫吸附CD9 11外来体颗粒的定量。
注：外来体粒料可以储存在-80℃为1年有限冻融。
4.生物标志物检测和外切体颗粒分析
- 对于下游分析，使用DNA / RNA /蛋白质分离试剂盒和RNA分离き提取DNA，RNA和蛋白质的外来体沉淀根据制造商的说明吨。通过测定吸光度，在260和280nm处具有2微升样品的测定使用NanoDrop分光光度计浓度。
- 进行实时定量RT-PCR（定量PCR）荧光定量使用的microRNA检测（在本例中，我们使用人类的miR-192和miR-1207-5p专用检测）或miRNA特异引物。
- 对于SDS-PAGE分析，使用4-12％的Bis-Tris凝胶和分离蛋白质样品通过一维电泳。可视化，根据制造商的说明使用银染色试剂盒凝胶。
- 执行根据由制造商提供的说明使用PVDF膜免疫印迹分析。使用兔多克隆抗体细胞凋亡连锁基因-2相互作用蛋白X或ALIX和鼠单克隆抗体肿瘤易感基因101蛋白或TSG101在免疫印迹检测。通过开放获取NIH ImageJ的软件量化带的密度（http://rsbweb.nih.gov/ij/）或一个类似的计划。
- 量化用CD9 ELISA试剂盒按照制造商的说明获得的尿中外来体颗粒的数目。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
尿外来体进行肾上皮细胞分泌的蛋白质，miRNA与mRNA的生物标志物。这些外来体的分离和检测可以提供用于早期检测肾脏疾病的有用的诊断工具，例如糖尿病性肾病。有几种方法用于从人受试者收集的尿液样本的外来体的隔离。我们以前相比，尿外来体分离六种方法，调查得到的蛋白质的mRNA和miRNA水平11。这里我们的目标是在详细描述我们已经开发了用于尿外来体的高效分离改性沉淀法。
图1描述了使用修改后的沉淀法涉及泌尿外来体的分离的各种步骤的示意性代表流程图，其中一个重复的外来体的得到的沉淀物用CD9 ELISA试剂盒，其为我们提供了外来体颗粒的相对定量测定CD9。使用Qiagen DNA / RNA /蛋白质mini试剂盒产量的DNA，RNA和蛋白质处理的其它粒料，其被使用的NanoDrop分光光度计通过测定吸光度，在260和280nm处定量。
图2是使用免疫印迹分析（改编自参考11）在SDS-PAGE分析和生物标志物的检测结果的修正的再现。在泳道与未处理的尿和第一尿沉淀中，对应于90至100 kDa的，观察到的蛋白条带，指示的THP蛋白分别存在和去除。而在车道与最终的上清，切体颗粒，对应THP蛋白带，没有观察到，这表明在前面的步骤中去除THP的，疗法伊比增加外来体颗粒的产率。要访问的切体颗粒的纯度和灵敏度，免疫印迹检测生物标志物，如阿利克斯和TSG101被采用。我们发现阿利克斯和TSG101即使样本量低，使用说明显著纯切体颗粒的生物标志物分析和缺乏丰富的可溶性蛋白，包括THP的。做的western印迹的光密度分析来量化和测量检测的水平（数据未示出）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
大多数涉及外来体的沉淀，从尿方法不涉及脱除TH糖蛋白（THP）形成的聚合网络。这种蛋白是大量存在于尿液，其中在初始低速离心它推定陷阱外来体。在我们改进的方法，我们减少THP之前使用DTT以切体沉淀。 如图2中 ，观察到了更高量的THP在未处理的尿和沉淀，并在最后的上清液和外来体沉淀无THP，表明除去蛋白质。蛋白中的球团的量化表示6倍更高的产率，并且在沉淀的CD9的ELISA定量，观察到每毫升的尿液外来体的该收率比未改性沉淀法高出五倍（结果未显示11）。生物标志物阿利克斯6和8 TSG101在切体颗粒进行检测;我们只能检测集中使用这些蛋白质在未修改的沉淀法的样品。我们还使用改性沉淀法11观察到的miRNA（ 即中，miR-192和miR-1207-5p）和mRNA表达（ 即 ，TSG101，PDCD6IP和AQP2 12）的最高水平。的优点和本变形沉淀法的缺点示于表1。
| 优势 | 缺点 |
| 轻松简单的步骤和要求相对小的专业知识来执行 | 蛋白质从尿外来体得到的低纯度 |
| 不需要超速离心步骤 | 由于不存在的超速离心步骤中，相比于从超速离心方法获得的外来体丸中获得的尿外来体粒料并不如纯 |
| 使用卷Urin小Ë样品的外来隔离 | 以获得纯的蛋白质为具体分析，将需要的蛋白质的纯化步骤，如亲和层析 |
| 取得了良好的量的miRNA，mRNA和蛋白质从尿外来体相比，非改性沉淀法 | 需要用另外的DTT几个额外的步骤由TH糖蛋白，以减少包封相对于非修饰的沉淀法 |
| 特异性和分析的生物标志物的灵敏度类似于所获得，并使用超速离心法进行分析 | |
| 尿外来体可以分离从大量样品的时间，适合于临床试验 | |
| 少动手的时间相比，超速离心方法 |
表1.优点和修改precipita的优缺点化方法泌尿切体隔离。
我们得出结论，我们的沉淀法的变形例是一种简单，快速，高效分离尿外来体方法，是一种合适的替代超离心法，这是劳动密集的，并且需要昂贵的设备。我们的方法不需要超速离心步骤中，容易进行，并需要更少的步骤，同时仍然提供高收率或纯外来体用于随后分子分析。我们还表明，miRNA与mRNA的使用这种方法的产率是高的，因此可直接用于随后的下游的RNA谱的应用程序。然而，我们注意到，这种方法的一个限制是得到的蛋白质，这是不作为纯粹作为使用蔗糖梯度超速离心法得到的质量，并需要额外的纯化步骤之前，利用在下游蛋白质组学分析。目前，我们正在评估这一甲基的效用OD使用来自糖尿病肾病患者获得尿样品。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
这篇文章出版费用由SBI生物科学中支付。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
