Introduction
Exosomes urinaires sont de petites vésicules internes de 100 nm de corps multivésiculaires (MVB) provenant de tous les types de cellules dans des conditions normales et pathologiques dans l'espace urinaire y compris podocytes glomérulaires, les cellules des tubules rénaux et les cellules qui tapissent les systèmes de drainage urinaire qui semblent être enrichi pour miARN 1 -2. De nombreux chercheurs ont détecté des protéines distinctes dans exosomes isolés à partir de l'urine d'individus sains ainsi que ceux atteints d'insuffisance rénale et / ou de maladies systématiques 3-5. Les exosomes peuvent être isolés en utilisant différentes méthodes telles que deux étapes ultracentrifugation différentielle avec ou sans saccharose 6-7, combinant filtre nanomembrane avec ultracentrifugation 8-9, 10-11 ou précipitation. Nous avons récemment développé une méthode simple, rapide, évolutive et efficace pour isoler les exosomes urinaires et de détecter les miARN et des biomarqueurs protéiques 11. Bien que les biomarqueurs peuvent être détectés dans une variété de différents fluides biologiques, urine est le choix le plus pratique pour les patients atteints de maladies du rein et des voies urinaires, car il peut être obtenu en grandes quantités d'une manière relativement non invasive.
Bien qu'il existe plusieurs méthodes pour isoler les exosomes urinaires 6-11, le procédé le plus couramment utilisé dépend ultracentrifugation différentielle avec un coussin de saccharose à 30%. Bien que cette méthode soit efficace et la qualité des exosomes isolés résultant de cette procédure est élevée, la technique elle-même requiert un personnel qualifié et prend beaucoup de temps, ce qui nécessite plusieurs étapes d'ultracentrifugation. D'autres méthodes, telles que la filtration et la précipitation, ont été développés pour l'isolement d'exosomes, y compris une qui utilise un réactif de précipitation propriétaire (ce est à dire, ExoQuick-TC: Biosciences système; Mountain View, CA). Bien que les précipitations en utilisant ce réactif est rapide et relativement facile, la pureté des exosomes isolés est faible par rapport à la meth ultracentrifugationod. Récemment, nous avons comparé les six procédés pour l'isolement d'exosomes urinaires, y compris une modification de la méthode de précipitation au moyen ExoQuick-TC que nous avons développé dans notre laboratoire 11. Nous avons constaté que cette méthode de précipitation modifiée a donné de plus grandes quantités de protéines, de miARN et ARNm et la procédure elle-même était plus rapide et plus facile à mettre en œuvre que ultracentrifugation. Ici, nous décrivons le protocole expérimental de notre méthode de précipitation modifiée de manière progressive, et inclure une discussion sur les avantages et les inconvénients de cette technique par rapport à d'autres méthodes d'isolement de exosomes. Le procédé de précipitation modifié implique une précipitation initiale de particules d'exosomes, suivie de l'élimination de la protéine de Tamm-Horsfall, qui est corrélée avec des protéines exosomales, et connu pour réduire le rendement des exosomes à partir d'urine. Nous avons constaté que ces modifications ont augmenté le rendement et la pureté de la préparation de exosomal de l'urine.
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Protocol
REMARQUE:. Les étapes impliquées dans l'isolement des exosomes urinaires en utilisant le procédé de précipitation modifiée sont illustrés dans la Figure 1 Les premières étapes impliquent l'enlèvement de grandes cellules mortes et les débris cellulaires par centrifugation. Le culot final obtenu à partir du surnageant recueilli à partir de chaque étape subséquente correspond à la exosomes, qui est dissous dans une solution d'isolation pour une extraction supplémentaire de la protéine, d'ARN et de l'ADN.
1. Collecte de l'urine
- Avant la collecte de l'urine, préparer inhibiteur de protéase cocktail selon les instructions du fabricant et ajouter 3,125 ml de ce cocktail à une prise vide et stérile. Le tube contenant le cocktail d'inhibiteurs de protéase peut alors être distribué aux bénévoles pour la collecte d'urine.
REMARQUE: La raison de l'ajout d'un inhibiteur de protease est de réduire au minimum la dégradation des protéines dans l'échantillon d'urine. Bien que nous avons utilisé spécifiquement un cocktail d'inhibiteurs de protéase duSigma, d'autres inhibiteurs de protease disponibles dans le commerce peuvent être substitués. - Prélever environ 10 ml d'urine de la première miction. Traiter l'urine immédiatement après la collecte sans stockage ou de réfrigération. Isoler les exosomes urinaires en double en utilisant le procédé de précipitation modifié; un des exemplaires est pour l'ADN, l'ARN total et l'extraction des protéines, tandis que l'autre est pour la quantification des particules d'exosomes urinaires.
REMARQUE: Un échantillon d'urine de 24 heures peut être recueilli pour l'isolement de exosomes en stockant à 4 ° C.
2. Elimination des débris cellulaires et Tamm-Horsfall Protein (THP)
- Transfert des échantillons d'urine tubes de 15 ml de centrifugeuses. Centrifugeuse de 10 ml d'urine à 17 000 xg pendant 10 min à 37 ° C pour éliminer les cellules et les débris cellulaires (figure 1).
- Aide d'une pipette, transférer le surnageant dans un nouveau tube pour un traitement ultérieur. Remettre en suspension le culot dans 500 pl de solution d'isolation (250 mM de saccharose, 10 mM qui éprouveanolamine, pH 7,6), suivi par 10 minutes d'incubation avec DL-dithiothréitol (DTT: concentration finale de 200 mg / ml) à 37 ° C.
REMARQUE: la TNT est ajouté à dégrader THP, qui emprisonne exosomes, conduisant à une diminution des rendements. Prenez soin de laisser le culot sans être dérangés pendant le transfert du surnageant, et vérifiez que le surnageant est clair de granulés de bois. - Des échantillons de granulés Vortex toutes les 2 min jusqu'à ce que le culot soit complètement dissous. Ensuite, ajouter 500 ul de solution d'isolation pour le culot dissous.
- Immédiatement après l'addition de solution d'isolation de la pastille, centrifuger à 17 000 xg pendant 10 min à 37 ° C. Déposer le surnageant et de combiner avec le surnageant recueilli plus tôt.
- Reprendre le culot dans 50 ul de solution d'isolation pour l'analyse SDS-PAGE.
REMARQUE: PBS TBS ou peuvent être utilisés à la place de la solution d'isolation pour remettre en suspension le culot.
3. Isolement de Exosome Pellet
- Pour 11 ml de la Supern recueilliesatant, ajouter 3,3 ml de réactif ExoQuick-TC et incuber à 4 ° C pendant au moins 12 h.
REMARQUE: le rapport du volume de surnageant de réactif ExoQuick-TC peut être réglée pour augmenter ou diminuer le rendement de exosomal. Nous avons observé que les volumes moindres de réactif ajouté produisent des rendements inférieurs de exosomes. - Après incubation, centrifuger le mélange échantillon / ExoQuick-TC à 10 000 g pendant 30 min à 25 ° C.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube pour analyse par SDS-PAGE.
- Le culot d'exosomes peut être conservé à -80 ° C pour l'ADN, l'ARN et l'extraction des protéines et la quantification des particules d'exosomes en utilisant ELISA 11 CD9.
NOTE: Le culot d'exosomes peut être conservé à -80 ° C pendant 1 an avec congélation et de décongélation limitée.
4. biomarqueurs de détection et analyse des Exosome Pellet
- Pour les analyses en aval, extraire l'ADN, de l'ARN et de protéines à partir de la pastille de exosomes en utilisant le / ARN / kit d'isolement de protéines de l'ADN et un Ki d'isolement d'ARNt selon les instructions du fabricant. Déterminer les concentrations en utilisant un spectrophotomètre à Nanodrop en mesurant l'absorbance à 260 et 280 nm avec 2 pi d'échantillon.
- Effectuer quantitative en temps réel RT-PCR (qPCR) en utilisant des tests de microARN TaqMan (dans notre cas, nous avons utilisé les droits de miR-192- et miR-spécifiques 1207-5p-tests) ou des amorces spécifiques miARN.
- Pour l'analyse SDS-PAGE, en utilisant 4-12% Bis-Tris gel et les échantillons de protéines séparées par électrophorèse unidimensionnelle. Visualiser gels en utilisant le kit de coloration à l'argent conformément aux instructions du fabricant.
- Effectuer une analyse de buvardage de Western en utilisant des membranes de PVDF selon les instructions fournies par le fabricant. Utilisation anticorps polyclonal de lapin lié à l'apoptose gène-interacting protein 2 ou X Alix et un anticorps monoclonal de souris à gène de susceptibilité à la tumeur 101 protéine TSG101 ou à la détection par transfert de Western. Quantifier la densité des bandes par accès ouvert logiciel NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ouun programme similaire.
- Quantifier le nombre de particules d'exosomes urinaires obtenus en utilisant un kit ELISA CD9 selon les instructions du fabricant.
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Representative Results
Exosomes urinaires portent protéines, miARN et ARNm biomarqueurs sécrétées par les cellules épithéliales rénales. L'isolement et la détection de ces exosomes peuvent fournir un outil diagnostique utile pour la détection précoce des maladies rénales telles que la néphropathie diabétique. Il existe plusieurs méthodes pour l'isolement d'exosomes à partir d'échantillons d'urine prélevés chez des sujets humains. Nous avons déjà comparé six méthodes d'isolement de l'urine exosomes et étudié les protéines, les niveaux d'ARNm et des miRNA 11 résultant. Notre objectif ici est de décrire en détail la méthode de précipitation modifiée, nous avons développé pour l'isolement efficace des exosomes urinaires.
La figure 1 décrit le schéma fonctionnel représentant schématiquement diverses étapes impliquées dans l'isolement d'exosomes urinaires en utilisant le procédé de précipitation par modification du duplicata Un exosomes.culot obtenu est mesurée pour CD9 utilisant le kit ELISA CD9, qui nous fournit la quantification relative des particules d'exosomes. L'autre pastille traitée à l'aide Qiagen ADN / ARN / protéine Mini Kit rendements ADN, d'ARN et de protéines, qui ont été quantifiées en utilisant Nanodrop spectrophotomètre en mesurant l'absorbance à 260 et 280 nm.
La figure 2 est la reproduction modifiée des résultats sur l'analyse SDS-PAGE et détection de biomarqueurs en utilisant une analyse de transfert de western (adapté de référence 11). Dans les colonnes avec de l'urine non transformés et premier culot urinaire, une bande de protéine correspondant à 90 à 100 kDa a été observée indiquant la présence et l'élimination des protéines THP respectivement. Alors que dans les pistes avec surnageant final et exosomes pastille, la bande de protéine correspondant à THP n'a pas été observée, ce qui indique l'élimination du THP dans les étapes précédentes, therEby augmenter le rendement des exosomes pastille. Pour accéder à la pureté et la sensibilité des granules exosomes, détection Western blot de biomarqueurs tels que TSG101 Alix et a été employée. Nous avons détecté Alix et TSG101 même lorsque de faibles quantités d'échantillon ont été utilisés en précisant culot exosomes sensiblement pur pour l'analyse des biomarqueurs et l'absence de protéines solubles abondantes, notamment THP. L'analyse densitométrique des transferts de Western a été effectuée pour quantifier et mesurer le niveau de détection (données non présentées).
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Discussion
La plupart des procédés impliquant la précipitation des exosomes à partir d'urine ne abordent pas le retrait du réseau polymère formé par la protéine de Tamm-Horsfall (THP). Cette protéine est présente en grandes quantités dans l'urine, où il pièges putativement exosomes pendant la centrifugation à basse vitesse initiale. Dans notre méthode modifiée, nous avons réduit THP utilisant la TNT avant la précipitation exosomes. Comme le montre la Figure 2, une plus grande quantité de THP a été observée dans l'urine non transformés et pastille, sans THP dans le surnageant final et exosomes pastille, indiquant une élimination de la protéine. La quantification des protéines dans le culot a indiqué un rendement six fois plus élevée, et sur CD9 ELISA quantification de la pastille, on a observé que le rendement de exosomes par ml d'urine a été cinq fois plus élevé que le procédé de précipitation non modifié (résultats non montrés 11). Les biomarqueurs Alix 6 et 8 TSG101 ont été détectés dans le culot d'exosomes; nous ne avons pu détecter ces protéines en utilisant des concentréséchantillons dans le procédé de précipitation non modifié. Nous avons également observé les plus hauts niveaux de miARN (c.-à-miR-192 et miR-1207-5p) et expression de l'ARNm (c.-à-TSG101, PDCD6IP et AQP2 12) en utilisant le procédé de précipitation modifiée 11. Les avantages et les inconvénients de ce procédé de précipitation modifiée sont indiqués dans le tableau 1.
| Avantages | Inconvénients |
| Étapes simples facile et nécessite peu d'expertise par rapport à effectuer | Faible pureté des protéines obtenues à partir des exosomes urinaires |
| Ne nécessite pas une étape d'ultracentrifugation | En raison de l'absence des étapes d'ultracentrifugation, le culot urinaire exosomes obtenu ne est pas aussi pur que par rapport à la pastille obtenue à partir d'exosomes méthodes ultracentrifugation |
| Utilise petit volume de Urine échantillon pour l'isolement d'exosomes | Pour obtenir la protéine pure pour analyse spécifique, les étapes de purification des protéines telles que la Chromatographie d'affinité seraient nécessaires |
| Obtenu bonne quantité de miARN, ARNm et des protéines urinaires d'exosomes par rapport aux non-modifiée méthode de précipitation | Quelques étapes supplémentaires nécessaires avec l'addition de la TNT pour réduire la provocation par la protéine de Tamm-Horsfall par rapport aux non-modifiée méthode de précipitation |
| La spécificité et la sensibilité des biomarqueurs analysés étaient similaires à celles obtenues et analysées en utilisant la méthode d'ultracentrifugation | |
| Urinaires exosomes peuvent être isolées à partir de nombreux échantillons à la fois, convenable pour les essais cliniques | |
| Moins mains sur le temps par rapport aux méthodes ultracentrifugation |
Tableau 1. Avantages et inconvénients de precipita modifiéeméthode de tion pour l'isolement de exosome urinaire.
Nous concluons que notre modification de la méthode de précipitation est un moyen simple et efficace, rapide d'isoler les exosomes urinaires et est une alternative appropriée à la méthode de l'ultracentrifugation, qui est beaucoup de travail et nécessite un équipement coûteux. Notre méthode ne requiert aucune étape d'ultracentrifugation, est facile à réaliser et nécessite moins d'étapes, tout en offrant un rendement élevé ou exosomes purs pour les analyses moléculaires ultérieures. Nous montrons aussi que les rendements des miARN et ARNm en utilisant cette méthode sont élevés, et donc peuvent être directement utilisés dans les applications suivantes aval ARN de profilage. Toutefois, nous notons que la limitation de ce procédé est la qualité de la protéine obtenue, qui ne est pas aussi pur que celui obtenu en utilisant les procédés d'ultracentrifugation à gradient de saccharose, et nécessite des étapes supplémentaires de purification avant l'utilisation dans les analyses protéomiques aval. Nous évaluons actuellement l'utilité de cette method en utilisant des échantillons d'urine prélevés sur des patients atteints de néphropathie diabétique.
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Disclosures
Frais de publication de cet article ont été payés par SBI Biosciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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