Introduction
Urinary Exosomen sind kleine interne Bläschen von 100 nm von multivesicular bodies (MVB) von allen Zelltypen unter normalen und pathologischen Bedingungen in Urin-Raum einschließlich der glomerulären Podozyten, Nierentubuluszellen und Zellen entlang der Urindrainage-Systeme, die für die miRNAs 1 angereichert werden angezeigt abgeleitet -2. Viele Forscher haben unterschiedliche Proteine in Exosomen aus dem Urin von gesunden Personen als auch solche mit eingeschränkter Nieren- und / oder systematische Erkrankungen 3-5 getrennt erfasst. Exosomen kann unter Verwendung verschiedener Verfahren, wie zweistufige Differential Ultrazentrifugation mit oder ohne Sucrose 6-7 isoliert werden, die Kombination Nanofilter mit Ultrazentrifugation 8-9 oder Präzipitation 10-11. Vor kurzem haben wir eine einfache, schnelle, skalierbare und effektive Methode zur Behandlung von Harn Exosomen isolieren und zu erkennen miRNA und Protein-Biomarkern 11 entwickelt. Obwohl Biomarker können in einer Vielzahl von verschiedenen biologischen Flüssigkeiten nachgewiesen werden, urine ist die ideale Wahl für Patienten mit Erkrankungen der Niere und der ableitenden Harnwege, weil es in großen Mengen in einem relativ nicht-invasive Art und Weise erhalten werden.
Obwohl es verschiedene Verfahren zur Behandlung von Harn Exosomen isolieren 6-11, hängt die am meisten verwendeten Verfahren auf Differential Ultrazentrifugation mit einer 30% Saccharose-Kissen. Während dieses Verfahren effizient und die Qualität der resultierenden Exosomen mit diesem Verfahren isoliert hoch ist, das Verfahren selbst erfordert geschultes Personal und ist zeitaufwendig und erfordert mehrere Ultrazentrifugationsschritte. Andere Verfahren, wie Filtration und Fällung, wurden für die Isolierung der Exosomen entwickelt worden, einschließlich eine, die einen proprietären Ausfällungsreagenz verwendet (dh ExoQuick-TC: System Biosciences; Mountain View, CA). Obwohl Fällung mit dieser Reagenz schnell und relativ einfach, die Reinheit der Exosomen isoliert ist gering im Vergleich zu der Ultrazentrifugation method. Vor kurzem haben wir sechs Methoden zur Isolierung von Harn Exosomen, einschließlich einer Modifizierung der Fällungsverfahren unter Verwendung ExoQuick-TC, die in unserem Labor entwickelt 11 verglichen. Wir fanden, dass diese modifizierte Präzipitationsverfahren lieferte höhere Mengen an Protein, miRNA, und mRNAs und das Verfahren selbst schneller und einfacher zu implementieren als Ultrazentrifugation war. Hier beschreiben wir die Versuchsprotokoll unserer modifizierten Fällungsverfahren stufenweise, und verfügen über eine Diskussion der Vor- und Nachteile dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden der Exosom Isolation. Das modifizierte Fällungsverfahren beinhaltet eine anfängliche Ausfällung von Exosom-Partikel, gefolgt von der Entfernung Tamm-Horsfall-Protein, das mit exosomalen Proteine korreliert, und bekanntlich exosome Ausbeute von Urin zu verringern. Wir fanden, dass diese Modifikationen erhöht die Ausbeute und Reinheit des exosomalen Präparat aus Urin.
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Protocol
. Hinweis: Der in der Isolierung der Exosomen Harn unter Verwendung der modifizierten Fällungsverfahren beteiligten Schritte sind in der Figur 1 dargestellten anfänglichen Schritte beinhalten die Entfernung von großen toten Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation. Das endgültige Pellet aus der aus jedem nachfolgenden Schritt gesammelten Überstand erhalten entspricht der Exosomen, die in Isolationslösung für die weitere Gewinnung von Protein, RNA und DNA, gelöst wird.
1. Sammlung von Urin
- Vor der Urinsammlung, bereiten Protease-Inhibitor-Cocktail nach den Anweisungen des Herstellers und fügen 3,125 ml dieser Cocktail in ein leeres steriles Gefäß. Die Röhrchen mit dem Protease-Inhibitor-Cocktail kann dann Freiwillige für Urinsammlung verteilt werden.
HINWEIS: Der Grund für das Hinzufügen von Protease-Inhibitor ist, Proteinabbau in der Urinprobe zu minimieren. Obwohl wir speziell verwendet einen Proteaseinhibitor-Cocktail ausSigma, können andere im Handel erhältliche Proteasehemmer ersetzt werden. - Sammeln Sie etwa 10 ml der ersten Urin. Verarbeiten Sie die Urin unmittelbar nach der Entnahme ohne Lagerung oder Kühlung. Isolieren Sie die Harnwege Exosomen in zweifacher Ausfertigung mit der modifizierten Fällungsverfahren; einer der beiden Analysen für DNA, Gesamt-RNA und Proteinextraktion, während die andere für die Quantifizierung von Harn Exosom-Partikel.
HINWEIS: Ein 24-Stunden-Urinprobe für Exosom Isolierung durch Lagerung bei 4 ° C gewonnen werden.
2. Entfernung von Zelltrümmern und Tamm-Horsfall Protein (THP)
- Übertragen Urinproben auf 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge 10 ml Harn bei 17.000 × g für 10 min bei 37 ° C, um Zellen und Zelltrümmer (Figur 1) zu beseitigen.
- Mit einer Pipette den Überstand in ein frisches Röhrchen für die weitere Verarbeitung. Das Pellet in 500 ul Isolierungslösung (250 mM Saccharose, 10 mM prüfetAmin, pH 7,6), gefolgt von 10-minütiger Inkubation mit DL-Dithiothreitol (DTT: Endkonzentration 200 mg / ml) bei 37 ° C.
HINWEIS: DTT wird hinzugefügt, um THP, die Exosomen Fallen abgebaut, was zu einer verminderten Erträge. Achten Sie darauf, um das Pellet während der Übertragung des Überstandes ungestört zu lassen, und bestätigt, dass der Überstand frei von Pellets. - Vortex Pelletproben alle 2 min, bis das Pellet vollständig aufgelöst ist. Dann fügen Sie 500 ul der Isolation Lösung des gelösten Pellets.
- Unmittelbar nach der Zugabe der Isolierungslösung zu dem Pellet, Zentrifuge bei 17.000 × g für 10 min bei 37 ° C. Pipette die überstehende und sich mit dem früheren Überstand gesammelt.
- Das Pellet in 50 ul Isolierungslösung für die SDS-PAGE-Analyse.
HINWEIS: PBS oder TBS kann anstelle Isolierungslösung verwendet, um das Pellet zu resuspendieren.
3. Isolierung Exosom Pellet
- Bis 11 ml des gesammelten supernatant Fügen 3,3 ml ExoQuick-TC Reagenz und Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 12 Std.
ANMERKUNG: Das Verhältnis des Volumens des Überstandes, um ExoQuick-TC Reagenz eingestellt werden kann, um zu erhöhen oder zu verringern exosomalen Ausbeute. Wir beobachteten, dass geringere Mengen an Reagens hinzugefügt kleinere Erträge von Exosomen. - Nach der Inkubation Zentrifuge wird die Probe / ExoQuick-TC Mischung bei 10.000 × g für 30 min bei 25 ° C.
- Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die SDS-PAGE-Analyse.
- Die exosome Pellet bei -80 ° C für DNA, RNA und Protein-Extraktion und Quantifizierung von Exosom-Partikel mit CD9 ELISA 11 gespeichert werden.
HINWEIS: Die exosome Pellet bei -80 ° C für 1 Jahr bei begrenzten Einfrieren und Auftauen gelagert werden.
4. Biomarker-Erkennung und Analyse der Exosom Pellet
- Für Downstream-Analysen, extrahieren DNA, RNA und Protein aus dem Exosom Pellet unter Verwendung des DNA / RNA / Protein-Extraktions-Kit und eine RNA-Isolierung kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen Konzentrationen unter Verwendung eines Nanodrop Spektralphotometer durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 nm mit 2 ul Probe.
- Führen quantitative Echtzeit-RT-PCR (qPCR) mit TaqMan MicroRNA Assays (in unserem Fall haben wir menschliche miR-192- und miR-1207-5p spezifische Assays) oder miRNA-spezifischen Primern.
- Für SDS-PAGE-Analyse, verwendet 4-12% Bis-Tris-Gel und getrennte Proteinproben durch eindimensionale Elektrophorese. Visualisieren Gele unter Verwendung der Silberfärbung Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Führen Western Blot Analyse unter Verwendung von PVDF-Membranen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden polyklonalen Kaninchen-Antikörper, um die Apoptose-verknüpften Gens-2 interagierende Protein X oder ALIX und monoklonalen Maus-Antikörpers an Tumor Suszeptibilitätsgens 101 Protein oder TSG101 in der Western-Blot-Detektion. Quantifizieren Sie die Dichte der Banden von Open-Access-NIH ImageJ Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oderein ähnliches Programm.
- Quantifizieren Sie die Anzahl der Harnwege mit einem CD9 ELISA-Kit nach Herstellerangaben erhalten Exosom Partikel.
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Representative Results
Urinary Exosomen tragen Protein, miRNA und mRNA-Biomarker von Nierenepithelzellen abgesondert. Die Isolierung und Detektion dieser Exosomen kann ein nützliches Diagnosewerkzeug zur Früherkennung von Nierenkrankheiten bereitzustellen, wie diabetische Nephropathie. Es gibt verschiedene Verfahren zur Isolierung von Exosomen aus Urinproben von menschlichen Probanden gesammelt. Wir haben vorher gegen sechs Methoden der Urin Exosom Isolation und untersucht resultierende Protein, mRNA und miRNA Ebenen 11. Unser Ziel war es, eine detaillierte Beschreibung der modifizierten Fällungsverfahren haben wir für eine effiziente Isolierung von Harn-Exosomen entwickelt.
Abbildung 1 beschreibt schema repräsentatives Flussdiagramm verschiedener Schritte unter Verwendung des modifizierten Fällungsverfahren zur Isolierung von Harn Exosomen beteiligt. Eine der doppelten exosomePellet erhalten für CD9 mit dem CD9 ELISA-Kit, das uns mit der relativen Quantifizierung Exosom Partikel bietet gemessen. Der andere Pellet verarbeitet mit mini Kit Ausbeuten Qiagen DNA / RNA / Protein-DNA, RNA und Protein, die mit Nanodrop Spektralphotometer durch Messung der Absorption bei 260 und 280 nm quantifiziert wurden.
Abbildung 2 ist die modifizierte Wiedergabe der Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse und den Nachweis von Biomarkern mit Western-Blot-Analyse (nach Lit. 11 angepasst). In den Spuren mit unverarbeiteten Urin und ersten Urin Pellet, einem Protein entsprechende Bande 90 bis 100 kDa beobachtet, was das Vorhandensein und die Entfernung der THP-Protein sind. Während in den Spuren mit der endgültigen Überstand und Pellet Exosom, das Protein entsprechende Bande THP wurde nicht beobachtet, was auf die Entfernung der THP in den früheren Schritten, thereby Erhöhung der Ausbeute an exosome Pellets. Um die Reinheit und die Empfindlichkeit der Exosom Pellets gelangen, wurde Western-Blot-Nachweis von Biomarkern, wie Alix und TSG101 eingesetzt. Wir haben festgestellt Alix und TSG101 auch bei geringen Probenmengen wurden verwendet, zeigt deutlich reiner Exosom Pellet für Biomarker-Analyse und Abwesenheit von reichlich lösliche Proteine einschließlich THP. Densitometrische Analyse der Western Blots wurde getan, um zu quantifizieren und messen die Nachweisgrenze (Daten nicht gezeigt).
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Discussion
Die meisten Verfahren, die Ausfällung der Exosomen aus Urin adressieren nicht die Entfernung des polymeren Netzwerks von Tamm-Horsfall-Protein (THP) gebildet. Dieses Protein ist in großen Mengen im Urin, wo sie mutmaßlich Fallen Exosomen während der anfänglichen Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit vorhanden ist. In unserem modifizierten Methode reduzierten wir THP mit DTT vor Exosom Niederschlag. Wie in Figur 2 gezeigt, wurde eine größere Menge von THP in unverändertem Urin und Pellet beobachtet, ohne THP in der endgültigen Überstand und Pellet exosome Angabe der Entfernung des Proteins. Quantifizierung von Protein im Pellet angegeben sechsmal höhere Ausbeute und für CD9 ELISA Quantifizierung des Pellets wurde beobachtet, dass die Ausbeute von Exosom pro ml Urin wurde fünfmal höher ist als das unmodifizierte Präzipitationsverfahren (Ergebnisse nicht gezeigt 11). Die Biomarker Alix 6 und TSG101 8 wurden in der Exosom Pellet festgestellt wird; konnten wir nur erkennen diese Proteine unter Verwendung von konzentrierterProben im unmodifizierten Präzipitationsverfahren. Wir beobachteten auch das höchste Niveau der miRNA (dh miR-192 und miR-1207-5p) und mRNA-Expression (dh TSG101, PDCD6IP und AQP2 12) nach der modifizierten Fällungsverfahren 11. Die Vor- und Nachteile dieser modifizierten Fällungsverfahren sind in Tabelle 1 gezeigt.
| Vorteile | Nachteile |
| Einfache einfachen Schritten und erfordert relativ wenig Expertise durchführen | Geringe Reinheit der Proteine aus Urinary Exosomen erhaltenen |
| Eine Ultrazentrifugationsschritt erfordert keine | Aufgrund der Abwesenheit der Ultrazentrifugationsschritte ist die Urinary exosome Pellet erhaltene nicht so rein wie im Vergleich zu der Exosom Pellet aus Ultrazentrifugation Methoden erhalten |
| Verwendet kleinen Volumen Urine Probe zur Isolierung von Exosomen | Um reine Protein zur spezifischen Analyse zu erhalten, Proteinreinigungsschritte wie Affinitätschromatographie erforderlich wären |
| Erhalten gute Menge miRNA, mRNA und Proteinen aus Urinary Exosomen im Vergleich zu nicht-modifizierten Präzipitationsverfahren | Einige zusätzliche Schritte unter Zugabe von DTT benötigt, um Einschluss von Uromodulin reduzieren im Vergleich zu nicht modifizierten Fällungsverfahren |
| Spezifität und Sensitivität der Biomarker analysiert waren vergleichbar zu erhalten, und unter Verwendung von Ultrazentrifugenmethode analysiert | |
| Urinary Exosomen aus großen Anzahl von Proben auf einmal getrennt werden, die für klinische Studien | |
| Weniger Handhabungszeit gegenüber Ultrazentrifugenverfahren |
Tabelle 1: Vor- und Nachteile der veränderten Niederschlagsmethode für Harn Exosom Isolation.
Wir schließen daraus, dass unsere Modifikation des Fällungsverfahren ist eine einfache, schnelle und effiziente Weise, um den Urin Exosomen isoliert und ist eine geeignete Alternative zu der Ultrazentrifugationsverfahren, was arbeitsintensiv ist und eine teure Ausrüstung erfordert. Unsere Methode erfordert keine Ultrazentrifugationsschritt, ist einfach durchzuführen und erfordert weniger Schritte, während immer noch eine hohe Ausbeute oder reine Exosomen für nachfolgende molekulare Analysen. Wir zeigen auch, dass die Ausbeuten der miRNA und mRNA unter Verwendung dieses Verfahrens sind hoch, und somit direkt in den nachfolgenden Downstream-RNA-Profiling-Anwendungen verwendet werden. Wir nehmen jedoch, dass eine Beschränkung dieses Verfahrens ist die Qualität des erhaltenen Proteins, die nicht so rein ist wie das unter Verwendung der Saccharose-Ultrazentrifugation Verfahren erhalten, und erfordert zusätzliche Reinigungsschritte vor der Verwendung in nachgeschalteten Proteomanalysen. Derzeit prüfen wir den Nutzen dieser method Verwendung von Patienten mit diabetischer Nephropathie erhaltenen Urinproben.
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Disclosures
Veröffentlichungskosten für diesen Artikel wurden von SBI Biosciences bezahlt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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