Introduction
मूत्र exosomes miRNAs 1 के लिए समृद्ध होना दिखाई देते हैं कि मूत्र निकासी प्रणाली अस्तर केशिकागुच्छीय podocytes, गुर्दे की छोटी नली कोशिकाओं और कोशिकाओं सहित मूत्र अंतरिक्ष में सामान्य और रोग की स्थिति के तहत सभी प्रकार की कोशिकाओं से व्युत्पन्न multivesicular निकायों (MVB) के 100 एनएम के छोटे आंतरिक पुटिकाओं हैं -2। कई शोधकर्ताओं ने स्वस्थ व्यक्तियों के मूत्र के रूप में अच्छी तरह से गुर्दे और / या व्यवस्थित रोगों 3-5 के साथ उन लोगों से अलग exosomes में विशिष्ट प्रोटीन का पता चला है। Exosomes ultracentrifugation 8-9, या वर्षा 10-11 के साथ nanomembrane फिल्टर के संयोजन, इस तरह के साथ या सूक्रोज 6-7 बिना दो कदम अंतर ultracentrifugation के रूप में विभिन्न तरीकों का उपयोग कर अलग किया जा सकता है। हमने हाल ही में मूत्र exosomes अलग और miRNA और प्रोटीन बायोमार्कर 11 का पता लगाने के लिए एक सरल, तेज, स्केलेबल और प्रभावी तरीका विकसित किया है। बायोमार्कर विभिन्न जैविक तरल पदार्थ की एक किस्म में पता लगाया जा सकता है, उरine यह एक अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव तरीके से बड़ी मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है क्योंकि गुर्दे और मूत्र पथ के रोगों के साथ रोगियों के लिए सबसे सुविधाजनक विकल्प है।
मूत्र exosomes 6-11 अलग करने के लिए कई तरीके हैं हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रक्रिया एक 30% sucrose के तकिया के साथ अंतर ultracentrifugation पर निर्भर करता है। इस विधि के कुशल है और इस प्रक्रिया के साथ पृथक जिसके परिणामस्वरूप exosomes की गुणवत्ता उच्च है, तकनीक ही कुशल कर्मियों की आवश्यकता है और समय लेने वाली है, कई ultracentrifugation चरणों की आवश्यकता होती है। ऐसे निस्पंदन और वर्षा के रूप में अन्य तरीकों, एक मालिकाना वर्षा अभिकर्मक का उपयोग करता है कि एक सहित, exosomes के अलगाव के लिए विकसित किया गया है (यानी, ExoQuick-तृकां: सिस्टम बायोसाइंसेज, माउंटेन व्यू, सीए)। इस अभिकर्मक का उपयोग कर वर्षा तेजी से और अपेक्षाकृत आसान है, हालांकि, पृथक exosomes की पवित्रता ultracentrifugation मेथ की तुलना में कम हैआयुध डिपो। हमने हाल ही में हम हमारी प्रयोगशाला में 11 में विकसित किया है कि ExoQuick-तृकां का उपयोग कर वर्षा विधि के एक संशोधन सहित मूत्र exosomes के अलगाव के लिए छह तरीके हैं, की तुलना में। हम इस संशोधित तेज़ी विधि प्रोटीन, miRNA, और mRNAs और खुद को तेजी से और ultracentrifugation से लागू करने के लिए आसान था प्रक्रिया की उच्च मात्रा झुकेंगे पाया। यहाँ, हम एक stepwise फैशन में हमारे संशोधित तेज़ी विधि का प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और exosome अलगाव के अन्य तरीकों के साथ तुलना में इस तकनीक के फायदे और नुकसान के एक चर्चा शामिल है। संशोधित तेज़ी विधि exosomal प्रोटीन के साथ सहसंबद्ध, और मूत्र से exosome उपज को कम करने के लिए जाना जाता है, जो Tamm-HORSFALL प्रोटीन, को हटाने के बाद exosome कणों की एक शुरुआती तेज़ी, शामिल है। हम इन संशोधनों के मूत्र से exosomal तैयारी की उपज और पवित्रता बढ़ पाया।
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Protocol
नोट:। संशोधित तेज़ी विधि का उपयोग कर मूत्र exosomes के अलगाव में शामिल कदम चित्रा 1 में सचित्र हैं आरंभिक चरणों centrifugation द्वारा बड़े मृत कोशिकाओं को हटाने और सेल मलबे को शामिल करना। प्रत्येक बाद कदम से एकत्र सतह पर तैरनेवाला से प्राप्त अंतिम गोली प्रोटीन, आरएनए, और डीएनए के आगे निकासी के लिए अलगाव समाधान में भंग कर रहा है जो exosome, से मेल खाती है।
मूत्र 1. संग्रह
- मूत्र संग्रह करने से पहले, निर्माता के निर्देशों के अनुसार protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल तैयार है और एक खाली बाँझ संदूक के लिए इस कॉकटेल के 3.125 मिलीग्राम जोड़ें। प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल युक्त ट्यूब तो मूत्र संग्रह के लिए स्वयंसेवकों को वितरित किया जा सकता है।
नोट: protease अवरोध करनेवाला जोड़ने के लिए कारण मूत्र नमूने में प्रोटीन गिरावट को कम से कम करने के लिए है। हम विशेष रूप से से एक protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल इस्तेमाल किया यद्यपिसिग्मा, अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीज इनहिबिटर्स प्रतिस्थापित किया जा सकता है। - प्रथम शून्य मूत्र के लगभग 10 मिलीलीटर लीजिए। तुरंत संग्रह के बाद भंडारण या प्रशीतन बिना मूत्र की प्रक्रिया। संशोधित तेज़ी विधि का उपयोग कर दो प्रतियों में मूत्र exosomes पृथक; अन्य मूत्र exosome कणों की मात्रा का ठहराव के लिए है, जबकि डुप्लिकेट की एक, डीएनए, कुल शाही सेना और प्रोटीन निकासी के लिए है।
ध्यान दें: एक 24 घंटा मूत्र का नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के द्वारा exosome अलगाव के लिए एकत्र किया जा सकता है।
सेल मलबे और Tamm-HORSFALL प्रोटीन 2. निकालना (THP)
- 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए मूत्र के नमूने स्थानांतरण। अपकेंद्रित्र 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 XG पर मूत्र के 10 एमएल कोशिकाओं और सेल मलबे (चित्रा 1) को खत्म करने के लिए।
- एक विंदुक का उपयोग करना, आगे की प्रक्रिया के लिए एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। अलगाव समाधान के 500 μl में गोली Resuspend (250 मिमी सुक्रोज, 10 मिमी triethअंतिम एकाग्रता 200 मिलीग्राम / एमएल) 37 डिग्री सेल्सियस पर: डीएल-dithiothreitol (डीटीटी के साथ 10 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा anolamine, पीएच 7.6)।
नोट: डीटीटी की पैदावार में कमी आई के लिए अग्रणी exosomes जो जाल THP, नीचा करने के लिए जोड़ा गया है। सतह पर तैरनेवाला के स्थानांतरण के दौरान undisturbed गोली छोड़ने के लिए ध्यान रखना, और सतह पर तैरनेवाला गोली से स्पष्ट है कि इस बात की पुष्टि। - भंवर गोली नमूने गोली तक हर दो मिनट में पूरी तरह से भंग कर रहा है। तब भंग गोली अलगाव समाधान के 500 μl जोड़ें।
- इसके तत्काल बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 XG पर अलगाव गोली का हल, सेंट्रीफ्यूज के अलावा के बाद। Pipet सतह पर तैरनेवाला और पहले एकत्र सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन।
- एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए अलगाव समाधान के 50 μl में गोली resuspend।
नोट: पीबीएस या टीबीएस गोली resuspend करने के बजाय अलगाव समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Exosome गोली के 3. अलगाव
- एकत्र supern के 11 मिलीलीटरatant, ExoQuick-टीसी अभिकर्मक के 3.3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और कम से कम 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
नोट: ExoQuick-टीसी अभिकर्मक के लिए सतह पर तैरनेवाला की मात्रा के अनुपात को बढ़ाने या exosomal उपज में कमी करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। हम जोड़ा अभिकर्मक की कम संस्करणों exosomes के छोटे पैदावार का उत्पादन है कि मनाया। - ऊष्मायन के बाद, अपकेंद्रित्र 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 XG पर नमूना / ExoQuick-टीसी मिश्रण।
- एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
- exosome गोली डीएनए, आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण और CD9 एलिसा 11 का उपयोग कर exosome कणों की मात्रा का ठहराव के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
नोट: exosome गोली सीमित ठंड और विगलन के साथ एक वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
4. biomarker पहचान और Exosome गोली का विश्लेषण
- बहाव के विश्लेषण के लिए, डीएनए / आरएनए / प्रोटीन अलगाव किट और एक शाही सेना अलगाव की का उपयोग कर exosome गोली से डीएनए, आरएनए और प्रोटीन निकालनेनिर्माता के निर्देशों के अनुसार टी। नमूना के 2 μl के साथ 260 पर absorbance और 280nm को मापने के द्वारा एक Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग सांद्रता निर्धारित करते हैं।
- मात्रात्मक वास्तविक समय आरटी-पीसीआर (qPCR) TaqMan microRNA assays का उपयोग या miRNA के विशिष्ट प्राइमरों (हमारे मामले में, हम मानव मीर 192- और मीर-1207-5p-विशिष्ट assays के लिए प्रयोग किया जाता) प्रदर्शन।
- एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए, एक आयामी वैद्युतकणसंचलन द्वारा 4-12% बीआईएस Tris जेल और अलग प्रोटीन के नमूने का उपयोग करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार चांदी धुंधला किट का उपयोग कर जैल कल्पना।
- निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों के अनुसार PVDF झिल्ली का प्रयोग पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करते हैं। पश्चिमी धब्बा पता लगाने में ट्यूमर संवेदनशीलता जीन 101 प्रोटीन या TSG101 को apoptosis के से जुड़े जीन-2 बातचीत प्रोटीन एक्स या Alix और माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करें। खुली पहुंच एनआईएच ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा बैंड के घनत्व यों (http://rsbweb.nih.gov/ij/) याएक ऐसे ही कार्यक्रम।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक CD9 एलिसा किट का उपयोग कर प्राप्त मूत्र exosome कणों की संख्या यों।
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Representative Results
मूत्र exosomes गुर्दे उपकला कोशिकाओं से स्रावित प्रोटीन, miRNA और mRNA के बायोमार्कर ले। इन exosomes के अलगाव और पता लगाने के लिए इस तरह मधुमेही नेफ्रोपैथी के रूप में गुर्दा रोगों का जल्दी पता लगाने के लिए एक उपयोगी नैदानिक उपकरण प्रदान कर सकता है। मानव विषयों से एकत्र मूत्र के नमूनों से exosomes के अलगाव के लिए कई तरीके हैं। हम पहले से मूत्र exosome अलगाव के छह विधियों की तुलना में और प्रोटीन, mRNA के, और miRNA का स्तर 11 जिसके परिणामस्वरूप जांच की। यहाँ हमारा उद्देश्य विस्तार में हम मूत्र exosomes के कुशल अलगाव के लिए विकसित किया है संशोधित तेज़ी विधि का वर्णन करने के लिए किया गया था।
चित्रा 1 संशोधित तेज़ी विधि का उपयोग कर मूत्र exosomes के अलगाव में शामिल विभिन्न चरणों के योजनाबद्ध प्रतिनिधि प्रवाह चार्ट का वर्णन है। डुप्लिकेट exosome में से एकप्राप्त गोली exosome कणों के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के साथ हमें प्रदान करता है जो CD9 एलिसा किट का उपयोग करते हुए CD9 के लिए मापा जाता है। 260 और 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया है, जो क्विएज़न डीएनए / आरएनए / प्रोटीन मिनी किट पैदावार डीएनए, आरएनए और प्रोटीन का उपयोग संसाधित अन्य गोली,।
चित्रा 2 (संदर्भ में 11 से अनुकूलित) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण और बायोमार्कर का पता लगाने पर परिणाम की संशोधित प्रजनन है। असंसाधित मूत्र और पहली मूत्र गोली, यह दर्शाता है 90 केडीए से 100 मनाया गया के लिए इसी एक प्रोटीन बैंड के साथ गलियों में क्रमशः THP प्रोटीन की उपस्थिति और हटाने। अंतिम सतह पर तैरनेवाला और exosome गोली के साथ गलियों में, THP करने के लिए इसी प्रोटीन बैंड नहीं मनाया गया, वहीं पिछले चरणों में THP को हटाने का संकेत है, वहाँEby exosome गोली की पैदावार बढ़ रही है। Exosome छर्रों की पवित्रता और संवेदनशीलता का उपयोग करने के लिए, इस तरह के एलिक्स और TSG101 रूप बायोमार्कर के पश्चिमी धब्बा पता लगाने में कार्यरत था। हम नमूने की कम मात्रा बायोमार्कर विश्लेषण और THP सहित प्रचुर मात्रा में घुलनशील प्रोटीन के अभाव के लिए काफी शुद्ध exosome गोली का संकेत का उपयोग किया गया, यहां तक कि जब एलिक्स और TSG101 का पता चला। पश्चिमी blots का Densitometric विश्लेषण यों और पहचान के स्तर को मापने के लिए किया गया था (डेटा) नहीं दिखाया।
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Discussion
मूत्र से exosomes की तेज़ी से जुड़े अधिकांश विधियों Tamm-HORSFALL प्रोटीन (THP) द्वारा गठित बहुलक नेटवर्क को हटाने का पता नहीं है। इस प्रोटीन यह कथित जाल प्रारंभिक कम गति centrifugation के दौरान exosomes जहां मूत्र में बड़ी मात्रा में मौजूद है। हमारे संशोधित पद्धति में हम exosome वर्षा के पूर्व डीटीटी का उपयोग कर THP कम कर दिया। चित्रा 2 में दिखाया गया है, THP के एक उच्च राशि प्रोटीन को हटाने के संकेत है, अंतिम सतह पर तैरनेवाला और exosome गोली में कोई THP साथ, असंसाधित मूत्र और गोली में मनाया गया। गोली में प्रोटीन की मात्रा का ठहराव छह गुना अधिक उपज संकेत है, और गोली के CD9 एलिसा मात्रा का ठहराव पर, यह (परिणाम 11) नहीं दिखाया मूत्र की मिलीलीटर प्रति exosome की है कि उपज असंशोधित तेज़ी विधि की तुलना में पांच गुना ज्यादा हो गया था मनाया गया। बायोमार्कर एलिक्स 6 और TSG101 8 exosome गोली में पता चला रहे थे; हम केवल इन प्रोटीनों केंद्रित का उपयोग कर पता लगा सकता हैअसंशोधित तेज़ी विधि में नमूने हैं। हम भी संशोधित तेज़ी विधि 11 का उपयोग कर miRNA (यानी, मीर-192 और मीर-1207-5p) और mRNA अभिव्यक्ति (यानी, TSG101, PDCD6IP और AQP2 12) के उच्चतम स्तर मनाया। फायदे और इस संशोधित तेज़ी विधि का नुकसान तालिका 1 में दिखाया जाता है।
| लाभ | नुकसान |
| आसान सरल कदम और प्रदर्शन करने के लिए सापेक्ष थोड़ा विशेषज्ञता की आवश्यकता है | मूत्र exosomes से प्राप्त प्रोटीन की कम शुद्धता |
| एक ultracentrifugation कदम की आवश्यकता नहीं है | Ultracentrifugation विधियों से प्राप्त exosome गोली की तुलना में होने के कारण ultracentrifugation चरणों के अभाव को प्राप्त मूत्र exosome गोली के रूप में शुद्ध नहीं है |
| Urin की छोटी मात्रा का उपयोग करता हैexosomes के अलगाव के लिए ई नमूना | विशिष्ट विश्लेषण के लिए शुद्ध प्रोटीन प्राप्त करने के लिए, इस तरह की आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के रूप में प्रोटीन शुद्धि चरणों की जरूरत होगी |
| गैर संशोधित तेज़ी विधि की तुलना में मूत्र exosomes से अच्छा miRNA, mRNA की राशि और प्रोटीन प्राप्त | डीटीटी के अलावा के साथ की जरूरत है कुछ अतिरिक्त कदम गैर संशोधित तेज़ी विधि की तुलना में Tamm-HORSFALL प्रोटीन से फंसाने को कम करने के लिए |
| विशिष्टता और विश्लेषण किया बायोमार्कर की संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए इसी तरह के थे और ultracentrifugation विधि का उपयोग विश्लेषण | |
| मूत्र exosomes नैदानिक ट्रेल्स के लिए उपयुक्त है, एक समय में नमूनों की बड़ी संख्या से अलग किया जा सकता | |
| कम हाथों पर समय ultracentrifugation तरीकों की तुलना |
तालिका 1. फायदे और संशोधित precipita का नुकसानमूत्र exosome अलगाव के लिए tion के विधि।
हम तेज़ी विधि के बारे में हमारी संशोधन मूत्र exosomes अलग करने के लिए एक सरल, तेज, कारगर तरीका है और श्रम प्रधान है और महंगे उपकरणों की आवश्यकता है जो ultracentrifugation विधि, के लिए एक उपयुक्त विकल्प है कि समाप्त। अभी भी बाद में आणविक विश्लेषण के लिए एक उच्च उपज या शुद्ध exosomes प्रदान करते हुए हमारे विधि, कोई ultracentrifugation कदम की आवश्यकता प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और कम चरणों की आवश्यकता है। हम भी इस पद्धति का उपयोग miRNA और mRNA की पैदावार अधिक होती है, और इसलिए सीधे बाद में नीचे की ओर आरएनए रूपरेखा अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, हम इस पद्धति की एक सीमा सूक्रोज ढाल ultracentrifugation तरीकों का उपयोग कर प्राप्त किया है कि जैसे ही शुद्ध नहीं है जो प्राप्त प्रोटीन की गुणवत्ता है, और नीचे की ओर प्रोटिओमिक विश्लेषण में पूर्व उपयोग करने के लिए अतिरिक्त शुद्धि चरणों की आवश्यकता है कि ध्यान दें। वर्तमान में हम इस मेथ की उपयोगिता का आकलन कर रहे हैंआयुध डिपो मधुमेही नेफ्रोपैथी के साथ रोगियों से प्राप्त मूत्र के नमूने का उपयोग कर।
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Disclosures
इस लेख के लिए प्रकाशन फीस एसबीआई बायोसाइंसेज द्वारा भुगतान किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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