Introduction
Мочевой экзосомы небольшие внутренние пузырьки 100 нм мультивезикулярных органов (MVB), полученных из клеток всех типов в нормальных и патологических условиях в моче пространства, включая клубочков подоцитов, клетках почечных канальцев и клеток, выстилающих мочевые системы дренажа, которые появляются в обогащении микроРНК 1 -2. Многие исследователи обнаружили различные белки в экзосом, выделенных из мочи здоровых лиц, а также пациентов с почечной и / или системными заболеваниями 3-5. Экзосомы может быть выделен с помощью различных методов, таких как двухступенчатой дифференциального ультрацентрифугирования с или без сахарозы 6-7, комбинируя наномембраны фильтр ультрацентрифугирования 8-9 или 10-11 осадков. Мы недавно разработали простой, быстрый, масштабируемый и эффективный метод, чтобы изолировать мочевых экзосомы и выявления микроРНК и белка биомаркеров 11. Хотя биомаркеры могут быть обнаружены в самых разных биологических жидкостях, игине является наиболее удобен для больных с заболеваниями почек и мочевого тракта, поскольку он может быть получен в больших количествах в относительно неинвазивным способом.
Хотя существует несколько методов, чтобы изолировать мочевого экзосомы 6-11, наиболее часто используемые процедуры, зависит от дифференциального ультрацентрифугирования с 30% сахарозы подушке. В то время как этот способ является эффективным и качество получаемых экзосом изолированных с этой процедурой является высокой, сама техника требует квалифицированного персонала и отнимает много времени и требует несколько шагов ультрацентрифугирования. Другие методы, такие как фильтрация и осадков, были разработаны для изоляции экзосом, в том числе тот, который использует запатентованную осадков реагент (т.е. ExoQuick-TC: Система биологических наук; Mountain View, CA). Хотя осадков использованием этого реагента очень быстро и сравнительно легко, чистота выделенных экзосом является низкой по сравнению с ультрацентрифугирования метOD. Мы недавно сравнил шесть методов для выделения в моче экзосом, в том числе модификации метода осаждения с использованием ExoQuick-TC, которые мы разработали в нашей лаборатории 11. Мы обнаружили, что этот модифицированный способ осадков дали более высокие количества белка, микроРНК, и мРНК и сама процедура была быстрее и проще в реализации, чем ультрацентрифугированием. Здесь мы опишем экспериментальный протокол нашего модифицированного метода осаждения ступенчато, и включают в себя обсуждение преимуществ и недостатков этого метода по сравнению с другими методами изоляции экзосома. Модифицированный метод осаждения включает начальное осаждение частиц экзосом, с последующим удалением Тамм-Хорсфолл белка, который коррелирует с exosomal белков, и известно, снижают экзосома выход из мочи. Мы обнаружили, что эти модификации повышает выход и чистоту препарата exosomal из мочи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ:. Этапы выделения мочевой экзосом с использованием модифицированного метода осаждения показаны на рисунке 1 Первые шаги включают удаление больших мертвых клеток и клеточных обломков путем центрифугирования. Конечный осадок, полученный из надосадочной жидкости, полученной от каждого последующего шага соответствует экзосома, который растворен в растворе изоляции для дальнейшей экстракции белка, РНК и ДНК.
1. Сбор мочи
- До сбора мочи, подготовить ингибитор протеазы коктейль в соответствии с инструкциями изготовителя и добавить 3,125 мл этого коктейля на пустой стерильной емкости. Трубка, содержащая ингибитор протеазы коктейль затем могут быть распространены на волонтеров для сбора мочи.
Примечание: причина для добавления ингибитора протеазы, чтобы минимизировать деградацию белка в образце мочи. Хотя мы специально использовали ингибитор протеазы коктейль изСигма, другие коммерчески доступные ингибиторы протеазы могут быть замещены. - Собирают приблизительно 10 мл первого пустот мочи. Процесс мочу сразу после сбора без хранения или охлаждения. Изолировать мочевых экзосомы в двух экземплярах с использованием модифицированного метода осаждения; один из дубликатов для ДНК, РНК и общего белка экстракцией, а другой для количественного определения частиц экзосом мочевых.
Примечание: 24 ч образец мочи можно собрать для изоляции экзосома при хранении при 4 ° С.
2. Удаление остатков клеток и Тамма-Horsfall белка (THP)
- Трансфер образцы мочи до 15 мл центрифужные пробирки. Центрифуга 10 мл мочи при 17000 мкг в течение 10 мин при 37 ° С, чтобы устранить клетки и клеточных обломков (рисунок 1).
- С помощью пипетки, передавать супернатант в чистую пробирку для дальнейшей обработки. Ресуспендируют осадок в 500 мкл раствора изоляции (250 мМ сахарозы, 10 мМ испытующемуanolamine, рН 7,6) с последующим 10-минутной инкубации с DL-дитиотреитола (DTT: конечная концентрация 200 мг / мл) при 37 ° С.
Примечание: ДТТ добавляют к ухудшению ТНР, который поглощает экзосомы, что приводит к снижению урожайности. Позаботьтесь, чтобы оставить осадок ненарушенных во время передачи супернатанта и убедитесь, что супернатант ясно окатышей. - Образцы гранул Вихревые каждые 2 мин до осадок полностью не растворится. Затем добавляют 500 мкл раствора изоляции в растворенном осадке.
- Сразу же после добавления изоляции раствора к осадку, центрифугируют при 17000 х г в течение 10 мин при 37 ° С. Пипеткой супернатант и в сочетании с надосадочной жидкости, собранной ранее.
- Ресуспендируют осадок в 50 мкл изоляции раствора для анализа SDS-PAGE.
Примечание: PBS, или терапию, может быть использован вместо раствора изоляции, чтобы вновь суспендируют таблетку.
3. Выделение экзосома Пелле
- Для 11 мл собранной supernatant, добавить 3,3 мл ExoQuick-TC реагента и инкубировать при температуре 4 ° С в течение по крайней мере 12 часов.
Примечание: Отношение объема надосадочной жидкости до ExoQuick-TC реагента можно регулировать, чтобы увеличить или уменьшить выход exosomal. Мы заметили, что меньшие объемы добавленной реагента производят меньшие урожаи экзосом. - После инкубации, центрифуги смеси образца / ExoQuick-ТК при 10000 х г в течение 30 мин при 25 ° С.
- Передача супернатант в новую пробирку для анализа SDS-PAGE.
- Экзосом осадок можно хранить при -80 ° С в течение ДНК, РНК и белка экстракции и количественного определения частиц экзосом использованием ELISA CD9 11.
ПРИМЕЧАНИЕ: экзосом осадок может храниться при -80 ° С в течение 1 года с ограниченным замораживания и оттаивания.
4. биомаркеров для выявления и анализа экзосома Пелле
- Для последующих анализов, извлечения ДНК, РНК и белка из экзосома гранул с использованием ДНК / РНК / комплект изоляции белка и РНК изоляции кит в соответствии с инструкциями изготовителя. Определение концентрации с использованием спектрофотометра NanoDrop путем измерения оптической плотности при 260 и 280 нм с 2 мкл образца.
- Выполните количественный реального времени RT-PCR (КПЦР) с помощью TaqMan микроРНК анализов (в нашем случае мы использовали человеческие микроРНК-192 стран и Мир-1207-5p специфические анализы) или микроРНК-специфических праймеров.
- Для анализа SDS-PAGE, используйте 4-12% Bis-Tris гель и отдельные образцы белка одномерного электрофореза. Представьте гели с использованием набора окраски серебром в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выполните Вестерн-блоттинга с использованием PVDF мембраны в соответствии с указаниями производителя. Использование кроличьих поликлональных антител к апоптоз-сшитый ген-2 взаимодействующего белка X или ALIX и мышиных моноклональных антител к ген восприимчивости опухолей 101 белка или TSG101 в Вестерн-блот-обнаружения. Количественная плотность полос открытого доступа программного обеспечения NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) илиАналогичная программа.
- Определить число мочевыводящих частиц экзосом полученных с использованием набора CD9 ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мочевой экзосомы нести белок, микроРНК и мРНК биомаркеров, выделяемые из почек эпителиальных клеток. Выделение и определение из этих экзосом может обеспечить полезную диагностическую инструмент для ранней диагностики заболеваний почек, таких как диабетическая нефропатия. Есть несколько способов изоляции экзосом из образцов мочи, собранных от человеческих субъектов. Мы ранее сравнению шесть методов выделения мочи экзосома и исследованы полученного белка, уровень мРНК, и микроРНК 11. Наша цель здесь в том, чтобы подробно описать модифицированного метода осаждения, которую мы разработали для эффективного выделения мочевой экзосом.
Рисунок 1 описывает принципиальную представительный блок-схема различных этапов в изоляции мочевых экзосом с использованием модифицированного метода осаждения. Один из дубликата экзосомаОсадок, полученный измеряется для CD9 с использованием набора ELISA CD9, что обеспечивает нам с относительной количественной оценки экзосом частиц. Другой осадок обрабатывали с использованием набора Qiagen ДНК / РНК / белок мини урожайности комплект ДНК, РНК и белка, которые были количественно с помощью спектрофотометра NanoDrop путем измерения оптической плотности при 260 и 280 нм.
Фиг.2 представляет модифицированный воспроизведение результатов анализа на SDS-PAGE и обнаружения биомаркеров с помощью Вестерн-блоттинга (адаптировано из ссылки 11). В дорожках с необработанной мочи и недержанием первой таблеткой, полосы белка, соответствующей 90 до 100 кДа, что указывало на Наличие и удаление ТНР белка соответственно. В то время как на дорожках с конечного супернатанта и экзосома гранулы, не наблюдалось полоса белка, соответствующий THP, что указывает на удаление ТНР на более ранних этапах, TherEby увеличения выхода экзосома гранул. Чтобы получить доступ к чистоту и чувствительность экзосом гранул, работал вестерн-блот обнаружение биомаркеров, таких как Аликс и TSG101. Мы обнаружили, Аликс и TSG101 даже тогда, когда низкие количества образца были использованы с указанием значительно чистый экзосома гранул для анализа биомаркеров и отсутствие обильных растворимых белков, включая ТНР. Денситометрический анализ вестерн-блоттинга было сделано, чтобы количественно определить и измерить уровень обнаружения (данные не показаны).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большинство методов с участием осаждение экзосом из мочи не учитывают удаление полимерного сети, образованной Тамм-Хорсфолл белка (ТНР). Этот белок присутствует в больших количествах в моче, где предположительно ловушки экзосомы во время начальной низкоскоростным центрифугированием. В нашем модифицированного метода мы уменьшили ТНР с помощью DTT до экзосома осадков. Как показано на рисунке 2, большее количество ТНР наблюдалось в необработанной моче и гранулы, без ТНР в конечном супернатанте и экзосома гранулы, указывающий удаление белка. Количественное определение белка в гранул указано в шесть раз более высокий выход, так и на CD9 ELISA количественного определения осадка, было отмечено, что урожайность экзосома на мл мочи в пять раз выше, чем в способе немодифицированного осадков (результаты не показаны 11). В биомаркеры Alix 6 и TSG101 8 были обнаружены в экзосома окатышей; мы могли бы только обнаружить эти белки, используя концентрированнуюОбразцы в методе неизмененном осадков. Мы также наблюдали самые высокие уровни микроРНК (т.е. Мир-192 и Мир-1207-5p) и экспрессии мРНК (т.е., TSG101, PDCD6IP и AQP2 12) с использованием модифицированного метода осаждения 11. Преимущества и недостатки этого модифицированного метода осаждения приведены в таблице 1.
| Преимущества | Недостатки |
| Легкие простые шаги и требует относительно мало экспертов для проведения | Низкий чистота белков получены от недержания экзосом |
| Не требует шаг ультрацентрифуги | Из-за отсутствия шагов ультрацентрифугирования, мочевого экзосом Осадок, полученный не так чисты, как по сравнению с экзосома осадка, полученного из методов ультрацентрифугирования |
| Использует небольшой объем Урине образец для изоляции экзосом | Для получения чистого белка для конкретного анализа, этапы очистки белков, такие как аффинная хроматография будут необходимы |
| Получено хорошее количество микроРНК, мРНК и белков от недержания экзосом сравнению с теми, модифицированного метода осаждения | Несколько дополнительных шагов, необходимых с добавлением DTT для уменьшения захвата Тамма-Horsfall белка по сравнению с не-модифицированного метода осаждения |
| Специфичность и чувствительность биомаркеров анализируемых были аналогичны, что получены и проанализированы с использованием метода ультрацентрифугирования | |
| Мочевые экзосомы может быть выделен из большого количества образцов за один раз, подходит для клинических испытаний | |
| Меньше практического времени по сравнению с методами Ультрацентрифугирование |
Таблица 1. Преимущества и недостатки модифицированной precipitaмым методом для изоляции экзосома пузыря.
Мы пришли к выводу, что наша модификация метода осаждения является простой, быстрый, эффективный способ изолировать мочевых экзосомы и подходящей альтернативой метода ультрацентрифугирования, который является трудоемким и требует дорогостоящего оборудования. Наш метод не требует ультрацентрифугирования шаг, легко выполнить, и требует меньше шагов, в то же время обеспечивая высокий выход или чисто экзосомы для последующих молекулярных исследований. Мы также показывают, что урожайность микроРНК и мРНК с помощью этого метода высока, и, следовательно, может быть использован непосредственно в последующих последующих применений РНК профилирования. Тем не менее, отметим, что ограничение этого метода является качество белка, полученного, который не так чисто, как получены с использованием сахарозы градиентные методы Ультрацентрифугирование, и требует дополнительных стадий очистки до утилизации в прямом протеомическим анализов. Мы в настоящее время оценивает полезность этого метOD с использованием образцов мочи, полученных от пациентов с диабетической нефропатии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Публикация сборы для этой статьи были оплачены SBI биологических наук.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
