Introduction
Exosomas urinario son pequeñas vesículas internas de 100 nm de los cuerpos multivesiculares (MVB) derivados de todos los tipos de células en condiciones normales y patológicas en el espacio urinario incluyendo podocitos glomerulares, células del túbulo renal y las células que revisten los sistemas de drenaje urinario que parecen ser enriquecido para miRNAs 1 -2. Muchos investigadores han detectado proteínas distintas en exosomas aislados de la orina de individuos sanos, así como aquellos con insuficiencia renal y / o enfermedades sistemáticas 3-5. Los exosomas se pueden aislar utilizando diferentes métodos, tales como de dos etapas de ultracentrifugación diferencial con o sin sacarosa 6-7, la combinación de filtro nanomembrana con ultracentrifugación 8-9, 10-11 o precipitación. Recientemente hemos desarrollado un método simple, rápido, escalable y eficaz para aislar exosomas urinario y detectar miRNA y biomarcadores de proteínas 11. Aunque los biomarcadores pueden ser detectados en una variedad de diferentes fluidos biológicos, urine es la opción más conveniente para los pacientes con enfermedades de los riñones y del tracto urinario, ya que puede obtenerse en grandes cantidades de una manera relativamente no invasiva.
Aunque existen varios métodos para aislar exosomas urinario 6-11, el procedimiento más comúnmente utilizado depende de ultracentrifugación diferencial con un colchón de sacarosa al 30%. Si bien este método es eficiente y la calidad de los exosomas resultantes aisladas con este procedimiento es alto, la técnica en sí requiere de personal capacitado y consume mucho tiempo, que requiere varios pasos de ultracentrifugación. Otros métodos, tales como filtración y precipitación, se han desarrollado para el aislamiento de exosomas, incluyendo uno que utiliza un reactivo de precipitación de propiedad (es decir, ExoQuick-TC: Biosciences sistema; Mountain View, CA). Aunque precipitación usando este reactivo es rápido y relativamente fácil, la pureza de los exosomas aislados es baja en comparación con la ultracentrifugación metod. Recientemente nos comparamos seis métodos para el aislamiento de los exosomas urinario, incluyendo una modificación del método de precipitación usando ExoQuick-TC que hemos desarrollado en nuestro laboratorio 11. Encontramos que este método de precipitación modificado produjo mayores cantidades de proteína, miRNA y los ARNm y el procedimiento en sí era más rápido y más fácil de implementar que ultracentrifugación. Aquí se describe el protocolo experimental de nuestro método de precipitación modificado de una manera gradual, e incluir un análisis de las ventajas y desventajas de esta técnica en comparación con otros métodos de aislamiento exosome. El método de precipitación modificada implica una precipitación inicial de partículas de exosoma, seguido de la eliminación de la proteína de Tamm-Horsfall, que se correlaciona con las proteínas exosomal, y se sabe que reducir el rendimiento exosome de la orina. Se encontró que estas modificaciones aumentan el rendimiento y la pureza de la preparación exosomal de la orina.
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Protocol
NOTA:. Los pasos implicados en el aislamiento de los exosomas urinarios utilizando el método de precipitación modificado se ilustran en la Figura 1 Los primeros pasos implican la eliminación de grandes células muertas y los desechos celulares por centrifugación. El sedimento final obtenido a partir del sobrenadante recogido de cada paso subsiguiente corresponde a la exosome, que se disuelve en solución de aislamiento para una mayor extracción de proteína, ARN y ADN.
1. Recolección de orina
- Antes de la recogida de orina, preparar cóctel inhibidor de proteasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante y añadir 3,125 ml de este cóctel a un receptáculo estéril vacía. El tubo que contiene el cóctel inhibidor de la proteasa se puede distribuir a los voluntarios para la recogida de orina.
NOTA: La razón de la adición de inhibidor de la proteasa es reducir al mínimo la degradación de proteínas en la muestra de orina. Aunque hemos utilizado específicamente un cóctel inhibidor de la proteasa deSigma, otros inhibidores de la proteasa comercialmente disponibles pueden ser sustituidos. - Recoger aproximadamente 10 ml de orina de primera evacuación. Procesar la orina inmediatamente después de la recolección sin almacenamiento o refrigeración. Aislar los exosomas urinario en duplicado utilizando el método de precipitación modificado; uno de los duplicados es para el ADN, el ARN total y la extracción de proteína, mientras que el otro es para la cuantificación de partículas de exosoma urinario.
NOTA: Una muestra de orina de 24 horas se pueden recoger para el aislamiento exosome mediante el almacenamiento a 4 ° C.
2. La eliminación de los restos celulares y Tamm-Horsfall Proteína (THP)
- Transferir las muestras de orina de 15 ml tubos de centrífuga. Centrifugar 10 ml de orina a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C para eliminar las células y los residuos celulares (Figura 1).
- Con una pipeta, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para su posterior procesamiento. Resuspender el precipitado en 500 l de solución de aislamiento (sacarosa 250 mM, 10 mM prueba lasanolamine, pH 7.6) seguido de 10 min de incubación con DL-ditiotreitol (DTT: concentración final de 200 mg / ml) a 37 ° C.
NOTA: la TDT se añade para degradar THP, que atrapa los exosomas, lo que lleva a la disminución de los rendimientos. Tenga cuidado de dejar el pellet inalteradas durante la transferencia del sobrenadante, y confirme que el sobrenadante esté libre de pellets. - Muestras de pellets Vortex cada 2 minutos hasta que la pastilla se disuelva completamente. A continuación, añadir 500 l de solución de aislamiento al sedimento disuelto.
- Inmediatamente después de la adición de solución de aislamiento al sedimento, se centrifuga a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C. Pipetear el sobrenadante y se combinan con el sobrenadante recogido antes.
- Resuspender el precipitado en 50 l de solución de aislamiento para el análisis de SDS-PAGE.
NOTA: PBS o TBS se pueden utilizar en lugar de solución de aislamiento para resuspender el pellet.
3. Aislamiento de exosome Pellet
- Para 11 ml de la supern recogidaatant, añadir 3,3 ml de reactivo de ExoQuick-TC y se incuba a 4 ° C durante al menos 12 h.
NOTA: La relación de volumen de sobrenadante a reactivo ExoQuick-TC se puede ajustar para aumentar o disminuir el rendimiento exosomal. Hemos observado que menores volúmenes de reactivo añadido producen rendimientos más pequeños de exosomas. - Después de la incubación, se centrifuga la mezcla de muestra / ExoQuick-TC a 10.000 xg durante 30 min a 25 ° C.
- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para el análisis SDS-PAGE.
- El sedimento exosome se puede almacenar a -80 ° C para el ADN, el ARN y la extracción de proteínas y cuantificación de las partículas de exosoma usando ELISA 11 CD9.
NOTA: El sedimento exosome se puede almacenar a -80 ° C durante 1 año con la congelación y descongelación limitada.
4. La detección de biomarcadores y Análisis de exosome Pellet
- Para los análisis corriente abajo, extraer el ADN, ARN y proteínas a partir del sedimento usando el exosome / ARN / kit de aislamiento de proteínas de ADN y un ki aislamiento de ARNt de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar las concentraciones utilizando un espectrofotómetro Nanodrop midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm con 2 l de muestra.
- Realizar cuantitativa en tiempo real RT-PCR (qPCR) utilizando ensayos TaqMan microARN (en nuestro caso, hemos utilizado miR-192- y 1207-5p específicas MIR ensayos humanos) o cebadores miRNA-específicos.
- Para el análisis de SDS-PAGE, usar 4-12% de gel de Bis-Tris y muestras de proteínas separadas por electroforesis unidimensional. Visualizar geles utilizando el kit de tinción de plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Realizar análisis de transferencia de Western usando membranas de PVDF de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Use anticuerpo policlonal de conejo a la apoptosis ligada al gen-2 interactuando proteína X o ALIX y anticuerpo monoclonal de ratón a genes de susceptibilidad tumoral 101 proteína o TSG101 en la detección de Western blot. Cuantificar la densidad de las bandas por el libre acceso software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oun programa similar.
- Cuantificar el número de partículas de exosoma urinarios obtenidos usando un kit de ELISA CD9 según las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
Exosomas urinarios llevan proteínas, miRNA y de ARNm biomarcadores secretadas por las células epiteliales renales. El aislamiento y la detección de estos exosomas pueden proporcionar una herramienta de diagnóstico útil para la detección precoz de enfermedades renales tales como la nefropatía diabética. Hay varios métodos para el aislamiento de exosomas a partir de muestras de orina recogidas de sujetos humanos. Anteriormente comparamos seis métodos de aislamiento exosome orina y se investigaron resultante de proteínas, los niveles de ARNm y miARN 11. Nuestro objetivo aquí es describir en detalle el método de precipitación modificado hemos desarrollado para el aislamiento eficiente de los exosomas urinario.
La Figura 1 describe el diagrama de flujo esquemático representativo de diversas etapas implicadas en el aislamiento de exosomas urinarios utilizando el método de precipitación modificada. Uno de los exosome duplicadosedimento obtenido se mide para CD9 utilizando el kit ELISA CD9, lo que nos proporciona la cuantificación relativa de partículas exosome. El otro pellet procesados utilizando Qiagen ADN / ARN / proteína de mini rendimientos kit de ADN, ARN y proteína, que se cuantificaron utilizando espectrofotómetro Nanodrop mediante la medición de la absorbancia a 260 y 280 nm.
La Figura 2 es la reproducción modificada de los resultados en el análisis de SDS-PAGE y detección de biomarcadores mediante el análisis de Western blot (adaptada de la referencia 11). En los carriles con la orina sin procesar y primera pellet urinaria, una banda de proteína correspondiente a 90 a 100 kDa se observó que indica la presencia y la eliminación de la proteína THP, respectivamente. Mientras que en los carriles con sobrenadante final y pellet exosome, no se observó la banda de proteína correspondiente a THP, indicando la eliminación de THP en los pasos anteriores, Thereby aumentar el rendimiento de pellet exosome. Para acceder a la pureza y la sensibilidad de los pellets de exosoma, se empleó la detección de transferencia Western de biomarcadores tales como Alix y TSG101. Detectamos Alix y TSG101 incluso cuando pequeñas cantidades de muestra se utilizaron indicando pellet exosome significativamente puro para el análisis de biomarcadores y la ausencia de abundantes proteínas solubles incluyendo THP. Se realizó el análisis densitométrico de las transferencias de Western para cuantificar y medir el nivel de detección (datos no mostrados).
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Discussion
La mayoría de los métodos que implican la precipitación de exosomas de la orina no se ocupan de la eliminación de la red polimérica formada por la proteína de Tamm-Horsfall (THP). Esta proteína está presente en grandes cantidades en la orina, donde supuestamente trampas exosomas durante la centrifugación inicial baja velocidad. En nuestro método modificado redujimos THP utilizando la TDT antes de la precipitación exosome. Como se muestra en la Figura 2, se observó una mayor cantidad de THP en la orina sin procesar y pellet, sin THP en el sobrenadante final y pellet exosome, indicando la eliminación de la proteína. La cuantificación de proteínas en el sedimento indica seis veces mayor rendimiento, y en CD9 ELISA cuantificación de la pastilla, se observó que el rendimiento de exosome por ml de orina fue cinco veces mayor que el método de precipitación no modificada (resultados no mostrados 11). Los biomarcadores Alix 6 y 8 Tsg101 se detectaron en el sedimento exosome; que sólo hemos podido detectar estas proteínas utilizando concentradosmuestras en el método de precipitación no modificados. También observamos los más altos niveles de miRNA (es decir, miR-192 y miR-1207-5p) y la expresión del ARNm (es decir, TSG101, PDCD6IP y AQP2 12) utilizando el método de precipitación 11 modificado. Las ventajas y desventajas de este método de precipitación modificados se muestran en la Tabla 1.
| Ventajas | Desventajas |
| Fácil sencillos pasos y requiere poca experiencia con respecto a realizar | Bajo la pureza de las proteínas obtenidas de exosomas urinarios |
| No requiere un paso ultracentrifugación | Debido a la ausencia de los pasos de ultracentrifugación, el sedimento urinario exosome obtenido no es tan pura como en comparación con el sedimento exosome obtenido a partir de métodos de ultracentrifugación |
| Utiliza pequeño volumen de Urine muestra para el aislamiento de exosomas | Para obtener proteína pura para análisis específico, serían necesarias etapas de purificación de proteínas, tales como cromatografía de afinidad |
| Obtenido buena cantidad de miRNA, ARNm y proteínas a partir de exosomas urinarias en comparación con el método de precipitación no modificada | Pocos pasos adicionales necesarios con la adición de la TDT para reducir el atrapamiento por la proteína de Tamm-Horsfall en comparación con el método de precipitación no modificada |
| Especificidad y sensibilidad de los biomarcadores analizados fueron similares a los obtenidos y analizados mediante el método de ultracentrifugación | |
| Exosomas urinario pueden ser aislados de gran número de muestras a la vez, adecuada para ensayos clínicos | |
| Menos manos a la vez en comparación con los métodos de ultracentrifugación |
Tabla 1. Ventajas y desventajas de precipita modificadométodo para el aislamiento de la exosome urinaria.
Llegamos a la conclusión de que nuestra modificación del método de precipitación es una manera simple, rápida y eficiente para aislar exosomas urinarios y es una alternativa adecuada para el método de ultracentrifugación, que es laborioso y requiere un equipo caro. Nuestro método no requiere paso ultracentrifugación, es fácil de realizar, y requiere menos pasos, sin dejar de ofrecer un alto rendimiento o exosomas puros para análisis moleculares posteriores. También muestran que los rendimientos de los miARN y mRNA utilizando este método son altos, y por lo tanto se pueden utilizar directamente en posteriores aplicaciones de perfiles de ARN aguas abajo. Sin embargo, observamos que una limitación de este método es la calidad de la proteína obtenida, que no es tan pura como la obtenida usando los métodos de ultracentrifugación en gradiente de sacarosa, y requiere pasos adicionales de purificación antes de la utilización en los análisis proteómicos aguas abajo. Actualmente estamos evaluando la utilidad de esta metanfetaminaod usando muestras de orina obtenidas de pacientes con nefropatía diabética.
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Disclosures
Las tasas de publicación de este artículo fueron pagados por OSE Biosciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
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