Introduction
İdrar eksozomlar miRNA'ların 1 zenginleştirilmiş görünmektedir idrar drenaj sistemlerinin astar glomerüler Podositler, renal tübül hücreleri ve hücreler de dahil olmak üzere idrar alanı normal ve patolojik koşullar altında tüm hücre tipleri türetilen multiveziküler organları (MVB), 100 nm küçük bir iç veziküllerdir -2. Pek çok araştırmacı, sağlıklı bireylerin idrar aynı zamanda böbrek ve / veya sistematik hastalık 3-5 olan izole eksozom belirgin proteinleri tespit ettik. Eksozomlar, ultra santrifüjleme, 8-9 ya da 10-11 çökeltme ile nanomembrane filtrenin birlikte, bu ya da sukroz 6-7 olmaksızın iki aşamalı bir diferansiyel ultra-santrifüj gibi farklı yöntemler kullanılarak izole edilebilir. Biz son zamanlarda idrar eksozomlar izole ve miRNA ve protein biyomarkerları 11 algılamak için, basit, hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir yöntem geliştirdik. Biyomarkerler farklı biyolojik sıvıların çeşitli tespit edilebilir olsa da, urine nispeten invazif olmayan bir şekilde büyük miktarlarda elde edilebilir, çünkü, böbrek ve idrar yolu hastalıkları olan hastalar için uygun bir seçimdir.
Idrar eksozomlar 6-11 izole etmek birkaç yöntem olmasına rağmen, en yaygın kullanılan prosedür% 30 sukroz yastık ile diferansiyel Ultrasantrifügasyon bağlıdır. Bu yöntem etkili değildir ve bu yönteme izole elde edilen eksozom kalitesi yüksek olsa da, teknik kendisi uzman personel gerektirir ve zaman alıcı birçok adımları ultrasantrifügasyon, zorunlu kılmaktadır. Bu, süzme ve çökeltme gibi başka yöntemler, özel bir özelliği, çökeltme reaktifinin kullanan bir de dahil olmak üzere, eksozom izolasyonu için geliştirilmiştir (örneğin, ExoQuick-TC: Sistem Biosciences, Mountain View, CA). Bu reaktif kullanılarak yağış hızlı ve nispeten kolay olmasına rağmen, izole eksozomlann saflık Ultrasantrifügasyon meth kıyasla düşüktürod. Kısa bir süre önce laboratuarımızda 11 geliştirilen ExoQuick-TC ile çökeltme yönteminin bir modifikasyonu dahil olmak üzere idrar eksozomlann izole edilmesi için altı yöntemi olarak karşılaştırılmıştır. Biz bu değiştirilmiş çöktürme yöntemi protein, miRNA ve mRNA'larının ve kendisi daha hızlı ve daha Ultrasantrifügasyon uygulamak kolay oldu prosedürün daha yüksek miktarlarda vermiştir bulundu. Burada, biz kademeli bir şekilde bizim modifiye yağış yöntemi deneysel protokol açıklar ve eksozom izolasyonu diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında bu tekniğin avantajları ve dezavantajları bir tartışma vardır. değiştirilmiş çöktürme yöntemi exosomal proteinleri ile ilişkili ve idrardan eksozom veriminin azalmasına yol açtığı bilinmektedir Tamm-Horsfall proteini ile uzaklaştırılarak elde edilmiş eksozom partiküllerinin ilk çökeltme, içerir. Biz, bu değişimler idrardan exosomal hazırlama verim ve saflıkta arttırdığı bulunmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not:. Modifiye çökeltme yöntemi kullanılarak idrar eksozomlann izole söz konusu olan adımlar, Şekil 1 'de gösterilmektedir, ilk adım santrifüj ile büyük ölü hücrelerin çıkarılması ve hücre artıkları içerir. Her bir sonraki aşamada toplanan kültür bakiyesinden elde edilen nihai pelet, protein, RNA ve DNA daha fazla ekstre için ayırma çözeltisi içinde eritilir eksozom tekabül eder.
İdrar 1. Koleksiyonu
- Idrar toplama öncesinde, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir proteaz inhibitörü kokteyli hazırlamak ve boş steril hazne Bu kokteyl 3.125 ilave edin. proteaz inhibitörü kokteyli içeren Tüp daha sonra idrar toplama gönüllülere dağıtılabilir.
Not: proteaz inhibitörü ilave nedeni idrar numunesi içinde bulunan proteini bozulmasını en aza indirmektir. Biz özellikle bir proteaz inhibitörü kokteyl kullanılmasına rağmenSigma, diğer ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörleri ikame edilebilir. - İlk boşluk idrar yaklaşık 10 ml toplayın. Toplandıktan hemen sonra depolama veya soğutma olmadan idrar işleyin. Modifiye yağış yöntemini kullanarak kopya üriner eksozomlar yalıtmak; üriner eksozom partiküllerinin ölçülmesi için ise çiftleri biri, DNA, toplam RNA ve protein ekstre içindir.
NOT: 24 saat idrar numunesi 4 ° C'de saklayarak eksozom izolasyonu için toplanabilir.
Hücre Moloz ve Tamm-Horsfall Protein 2. Kaldırma (THP)
- 15 ml santrifüj tüplerine idrar örnekleri aktarın. Santrifüj 37 ° C'de 10 dakika boyunca 17,000 x g'de idrar 10 mi hücreleri ve hücre kalıntısını (Şekil 1) ortadan kaldırmak için.
- Bir pipet kullanarak, daha fazla işlem için yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. Izolasyon çözeltisi 500 ul pelletini (250 mM sakaroz, 10 mM Trietilamininnihai konsantrasyon 200 mg / ml), 37 ° C 'de DL-ditiyotreitol (DTT ile 10 dakika inkübasyon ile takip anolamine, pH 7.6).
Not: DTT verim azalmasına yol açan, eksozomlar yakalar THP, indirgeme eklenir. Süpernatant transferi sırasında rahatsız pelet bırakmak özen, ve yüzer pelet açık olduğunu doğrulayın. - Vortex pelet örnekleri pelet kadar her 2 dk tamamen çözülür. Ardından çözünmüş pelet izolasyon çözeltisi 500 ul ekleyin.
- 37 ° C, 10 dakika için 17,000 x g'de izole pelet çözeltisi santrifüj ilave edildikten sonra. Pipetleyin süpernatant ve önceki toplanan süpernatant ile birleştirmek.
- SDS-PAGE analizi için ayırma çözeltisi 50 ul pelletini.
Not: PBS veya TBS pelletini yerine yalıtım çözeltisi kullanılabilir.
Exosome Peleti 3. İzolasyonu
- Toplanan supern 11 mlatant, ExoQuick-TC ayıracı 3.3 ml ilave edilir ve en az 12 saat süre ile 4 ° C'de inkübe edin.
Not: ExoQuick-TC reaktif süpernatant hacmine oranı arttırmak veya exosomal verim azaltmak için ayarlanabilir. Bu ilave reaktif az miktarlar eksozom küçük anomerin görülmektedir. - Inkübasyondan sonra, santrifüj 25 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de örnek / ExoQuick-TC karışımı.
- SDS-PAGE analizi için temiz bir tüpe süpernatant aktarın.
- eksozom pelet, DNA, RNA ve protein ekstraksiyonu ve CD9 ELISA 11 kullanılarak eksozom partiküllerinin ölçümü için, -80 ° C'de saklanabilir.
Not: eksozom pelet sınırlı dondurma ve eritme ile 1 yıl boyunca, -80 ° C'de saklanabilir.
4. Biyomarker Algılama ve Exosome Peleti Analizi
- Alt baş analizler için, DNA / RNA / protein izolasyon kiti ve bir RNA izolasyon Ki ile eksozom topağından DNA, RNA ve protein özüüreticinin talimatlarına uygun olarak T. Örnek 2 ul 260 absorbans ve 280nm ölçerek Nanodrop spektrofotometre kullanılarak konsantrasyonlarını belirleyin.
- Kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR (qPCR), TaqMan microRNA deneyleri kullanılarak veya miRNA-spesifik primerler (bizim durumumuzda, biz insan miR-192- ve miR-1207-5p özel deneyleri kullanılır) gerçekleştirin.
- SDS-PAGE analizi için, tek boyutlu elektroforez ile% 4-12 Bis-Tris jel ve ayrı protein numuneleri kullanmaktadır. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, gümüş boya kitini kullanarak jeller görselleştirmek.
- Üretici tarafından sağlanan talimatlara uygun olarak PVDF membranlar kullanılarak Western blot analizi. Western blot algılama tümör bir gen 101 protein veya TSG101 apoptoz bağlantılı gen-2 etkileşimli protein X veya Alix ve fare monoklonal antikor tavşan poliklonal antikor kullanın. Açık erişim NIH ImageJ yazılımı tarafından bantların yoğunluğu ölçmek (http://rsbweb.nih.gov/ij/) veyabenzer bir program.
- Üreticinin talimatlarına göre bir CD9 ELISA kiti kullanılarak elde edilen idrar eksozom parçacıkların sayısını ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İdrar eksozomlar böbrek epitel hücrelerinden salgılanan protein MiRNA ve mRNA biyolojik işaretleri taşırlar. Bu eksozomlann izolasyon ve algılama gibi diyabetik nefropati gibi böbrek hastalıklarının erken teşhisi için yararlı bir tanısal araç sağlayabilir. Insan deneklerden alınan idrar örneklerinde eksozomlann izole edilmesi için bir kaç yöntem vardır. Biz daha önce idrar eksozom izolasyon altı yöntemleri karşılaştırıldığında ve protein, mRNA ve miRNA düzeyleri 11 Elde incelenmiştir. Burada amacımız detaylı üriner eksozom verimli izolasyonu için geliştirilmiş olan değiştirilmiş yağış yöntemi tarif oldu.
Şekil 1 modifiye yağış yöntemi kullanılarak idrar eksozom izolasyonu ile ilgili çeşitli adımlar şematik temsili akış şemasını açıklar. Yinelenen exosome biriElde edilen pelet, eksozom partiküllerinin nispi miktar elde etmemizi sağlayan CD9 ELISA kiti kullanılarak CD9 ölçülür. 260 ve 280 nm'de absorbans ölçülerek Nanodrop spektrofotometre kullanılarak ölçüldü Qiagen DNA / RNA / Protein Mini Kit verim DNA, RNA ve protein kullanılarak işlenen diğer topak.
Şekil 2, (referans 11 uyarlanmıştır) Western lekeleme analizi kullanılarak, SDS-PAGE analizi ve biyolojik algılama sonuçlarının değiştirilmiş üretimidir. Işlenmemiş idrar ve ilk idrar pelet gösteren 90 kDa ila 100 gözlenmiştir tekabül eden bir protein şeridi ile şerit olarak sırasıyla THP proteininin varlığı ve kaldırma. Son süpernatant ve eksozom pelet ile şerit, THP karşılık gelen protein bandı gözlenmezken, önceki adımda THP çıkarılmasını gösteren, thereby eksozom pelet verimini arttırarak gerçekleştirilir. Eksozom pelet saflığını ve hassasiyetini erişmek için, bu tür Alix ve TSG101 gibi biyomarkerların western blot algılama kullanılmıştır. Biz örnek düşük miktarlarda biyobelirtecin analizi ve THP dahil bol çözünür proteinlerin yokluğunda önemli ölçüde saf eksozom pelet belirten kullanılan edildi bile Alix ve TSG101 algılandı. Burada Western lekelerinin densitometrik analizi, ölçmek ve tespit seviyesinin ölçülmesi için yapıldı (veriler gösterilmemiştir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Idrardan eksozom çökelmesini içeren çok yöntem Tamm-Horsfall proteini (THP) tarafından oluşturulan polimerik ağ kaldırılmasını ele alınmamıştır. Bu protein, bu varsayımsal trans ilk düşük hızlı santrifüj içinde eksozomlar idrar, büyük miktarlarda mevcuttur. Modifiye yönteminde, sonuç eksozom çökeltme öncesinde DTT kullanılarak THP azaltmıştır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, THP, daha yüksek bir miktar, proteine çıkarılmasını gösteren, son yüzer tabakanın ve eksozom pelet içinde herhangi bir THP ile, işlenmemiş idrar ve topak görülmüştür. Pelet protein miktarının belirlenmesi altı kat daha yüksek verim belirtilen ve pelet CD9 ELISA nicelenmesine, bu (sonuçlar 11 gösterilmemiştir) idrar ml başına exosome bu verim değiştirilmemiş yağış yöntemine göre beş kat daha fazla gözlendi. biyo-Alix 6 ve TSG101 8 eksozom pelet tespit edilmiştir; sadece, bu proteinler, konsantre edilir kullanarak algılayabilirdeğiştirilmemiş çökeltme yöntemi de örnekler. Ayrıca modifiye edilmiş çöktürme yöntemi 11 ile miRNA (yani, miR-192 ve miR-1207-5p) ve mRNA ifadesi (örneğin, TSG101, PDCD6IP ve AQP2 12) en yüksek düzeyde gözlenmiştir. avantaj ve bu değiştirilmiş çökeltme yöntemin dezavantajları, Tablo 1 'de gösterilmektedir.
| Avantajları | Dezavantajları |
| Kolay, basit adımlar ve gerçekleştirmek için görece küçük uzmanlık gerektirir | İdrar eksozom elde edilen proteinlerin düşük saflık |
| Bir Ultrasantrifügasyon adımı gerektirmez | Ultrasantrifüj yöntem ile elde edilen eksozom pelet ile karşılaştırıldığında nedeniyle Ultrasantrifüj adımları olmaması nedeniyle, elde edilen idrar eksozom topak saf değil |
| Urin küçük hacim kullanıreksozomlann izole edilmesi için E numunesi | Belirli bir analiz için saf bir protein elde etmek için, örneğin yakınlık kromatografisi gibi protein saflaştırma adımları gerekli olacaktır |
| Modifiye edilmemiş çöktürme yöntemine göre idrar eksozom iyi MiRNA, mRNA miktarı ve proteinler elde edildi | DTT ilavesi ile gerekli birkaç ekstra adımlar olmayan modifiye yağış yöntemine göre Tamm-Horsfall proteini tarafından sürüklenmesini azaltmak için |
| Özgüllük analiz biyomarkerların duyarlılık elde edilene benzerdi ve ultra-santrifüj yöntemi kullanılarak analiz | |
| İdrar eksozomlar klinik yollar için müsait, bir seferde örneklerin çok sayıda izole edilebilir | |
| Az eller zaman Ultrasantrifüj yöntemlerle karşılaştırıldığında |
Tablo 1. Avantajları ve modifiye bir çökelti dezavantajlarıidrar eksozom izolasyonu için yon yöntemi.
Biz yağış yöntemi bizim değişiklik idrar eksozomlar izole basit, hızlı, etkili yoludur ve emek-yoğun ve pahalı ekipman gerektirir Ultrasantrifügasyon yöntemine uygun bir alternatif olduğu sonucuna varıldı. Hala daha sonraki moleküler analizler için yüksek verim veya saf eksozomlar sunarken yöntem, hiçbir Ultrasantrifügasyon adımı gerektirir gerçekleştirmek kolay ve daha az adımları gerektirir. Ayrıca, bu yöntem kullanılarak miRNA ve mRNA verimleri yüksektir, ve bu sayede takip eden alt baş RNA profil uygulamalarında kullanılabileceğini gösterir. Bununla birlikte, bu yöntemin bir sınırlama sukroz gradyan ultrasantrifüjleme yöntemler kullanılarak elde edilen kadar saf olmayan bir şekilde elde edilen protein, kalitesi, ve alt baş proteomik analizlerde önce kullanım için ek saflaştırma adımları gerektirir unutmayın. Şu anda bu meth programı değerlendiriyorod diyabetik nefropatili hastalarda elde edilen idrar numuneleri kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu yazı için yayın ücretleri SBI Biosciences tarafından ödendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
