Introduction
exosomes البولية هي الحويصلات الداخلية صغيرة من 100 نيوتن متر من الهيئات عديد الحويصلات (MVB) المستمدة من جميع أنواع الخلايا تحت الظروف العادية والمرضية في الفضاء البولية بما في ذلك podocytes الكبيبي، وخلايا النبيبات الكلوية والخلايا المبطنة للشبكات الصرف البولية التي يبدو أنها المخصب لmiRNAs 1 -2. وقد كشفت العديد من الباحثين البروتينات متميزة في exosomes معزولة عن البول الأفراد الأصحاء وكذلك مع كلوي و / أو الأمراض منهجية 3-5. Exosomes يمكن عزلها باستخدام طرق مختلفة مثل خطوتين التفاضلي تنبيذ فائق مع أو بدون السكروز 6-7، والجمع بين مرشح nanomembrane مع تنبيذ فائق 8-9، أو هطول الأمطار 10-11. لقد وضعت مؤخرا طريقة بسيطة وسريعة وقابلة للتطوير وفعال لعزل exosomes البولية وكشف ميرنا ومؤشرات حيوية البروتين 11. على الرغم من أن المؤشرات الحيوية يمكن اكتشافه في مجموعة متنوعة من السوائل البيولوجية المختلفة، اورالمعهد الوطني للإحصاء هو الخيار الأكثر ملاءمة للمرضى الذين يعانون أمراض الكلى والمسالك البولية لأنه يمكن الحصول على كميات كبيرة بطريقة نسبيا غير الغازية.
على الرغم من أن هناك عدة طرق لعزل exosomes البولية 6-11، فإن الإجراء الأكثر شيوعا يعتمد على تنبيذ فائق التفاضلي مع وسادة السكروز 30٪. في حين أن هذا الأسلوب هو كفاءة وجودة exosomes الناتجة معزولة مع هذا الإجراء عالية، وأسلوب في حد ذاته يتطلب الموظفين المهرة وهي، والتي تتطلب العديد من الخطوات تنبيذ فائق تستغرق وقتا طويلا. أساليب أخرى، مثل الترشيح وهطول الأمطار، وقد وضعت لعزل exosomes، بما في ذلك واحد يستخدم الملكية هطول الأمطار كاشف (أي ExoQuick-TC: نظام العلوم البيولوجية، ماونتن فيو، كاليفورنيا). وعلى الرغم من هطول الأمطار باستخدام هذا كاشف بشكل سريع وسهل نسبيا، ونقاء exosomes معزولة منخفض بالمقارنة مع المنهجيات تنبيذ فائقالتطوير التنظيمي. ونحن مؤخرا مقابل ستة طرق لعزل exosomes البولية، بما في ذلك تعديل طريقة الترسيب باستخدام ExoQuick-TC التي قمنا بتطويرها في مختبرنا 11. وجدنا أن هذه الأمطار طريقة تعديل أثمرت كميات أكبر من البروتين، ميرنا، ومن mRNAs والإجراء نفسه كان أسرع وأسهل للتنفيذ من تنبيذ فائق. هنا، نحن تصف بروتوكول تجريبي لدينا هطول طريقة تعديلها بطريقة تدريجية، وتشمل مناقشة مزايا وعيوب هذه التقنية مقارنة مع غيرها من أساليب exosome العزلة. ويشمل هطول الأمطار على طريقة تعديل الأولي من الجسيمات exosome، تليها إزالة البروتين تام-هورسفال، الذي يرتبط مع بروتينات exosomal، والمعروف للحد من العائد exosome من البول. وجدنا أن هذه التعديلات زيادة المحصول ونقاء إعداد exosomal من البول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم توضيح الخطوات المتبعة في عزل exosomes البولية باستخدام طريقة الترسيب تعديل في الشكل (1) وتشمل الخطوات الأولية إزالة الخلايا الميتة الكبيرة والحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي. بيليه النهائي تم الحصول عليها من طاف جمعها من كل خطوة لاحقة يتوافق مع exosome، والذي يذوب في محلول العزلة لمزيد من استخراج البروتين، RNA، DNA و.
1. جمع البول
- قبل جمع البول، وإعداد مثبط البروتياز الكوكتيل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وإضافة 3.125 مل من هذا الكوكتيل إلى وعاء معقم فارغة. الأنبوب الذي يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز ويمكن بعد ذلك يتم توزيعها على المتطوعين لجمع البول.
ملاحظة: السبب لإضافة مثبط البروتياز هو تقليل تدهور البروتين في عينة من البول. على الرغم من أننا تستخدم خصيصا كوكتيل مثبط البروتياز منسيغما، يمكن أن تكون بديلا غيرها من مثبطات الأنزيم البروتيني المتاحة تجاريا. - جمع حوالي 10 مل من البول باطلة أولا. معالجة البول مباشرة بعد جمع دون تخزين أو التبريد. عزل exosomes البولية في نسختين باستخدام طريقة الترسيب المحورة؛ واحدة من التكرارات هو لDNA، RNA الكلي واستخراج البروتين، في حين أن الآخر هو لتقدير حجم الجسيمات exosome البولية.
ملاحظة: يمكن جمع عينة البول 24 ساعة لexosome العزلة عن طريق تخزين عند 4 درجات مئوية.
2. إزالة الحطام الخلية وتام-هورسفال البروتين (THP)
- نقل عينات البول إلى 15 مل أنابيب الطرد المركزي. الطرد المركزي 10 مل من البول في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 37 ° C للقضاء على الخلايا والحطام الخلية (الشكل 1).
- باستخدام ماصة، ونقل طاف لأنبوب جديد لمزيد من المعالجة. Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من حل العزلة (250 ملي السكروز، 10 ملي triethanolamine، ودرجة الحموضة 7.6)، يليه 10 دقيقة الحضانة مع DL-dithiothreitol (DTT: نهائي تركيز 200 ملغ / مل) عند 37 درجة مئوية.
يضاف DTT أن تتحلل THP، أي يصيد exosomes، مما يؤدي إلى انخفاض العوائد: ملاحظة. احرص على ترك بيليه دون عائق أثناء نقل طاف، وتأكيد أن طاف هو واضح من بيليه. - عينات بيليه دوامة كل 2 دقيقة حتى بيليه يذوب تماما. ثم إضافة 500 ميكرولتر من حل العزلة إلى بيليه المنحل.
- على الفور بعد إضافة حل العزلة إلى بيليه، الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. الماصة وطاف مع الجمع بين طاف جمعها في وقت سابق.
- Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من حل العزلة لتحليل SDS-PAGE.
ملاحظة: برنامج تلفزيوني أو TBS يمكن استخدامها بدلا من حل العزلة إلى resuspend الكرية.
3. عزل Exosome بيليه
- إلى 11 مل من supern جمعهاatant، إضافة 3.3 مل من ExoQuick-TC كاشف واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 12 ساعة.
ملاحظة: نسبة حجم طاف لExoQuick-TC كاشف يمكن تعديلها لزيادة أو تقليل العائد exosomal. لاحظنا أن كميات أقل من كاشف أضاف تنتج غلة أصغر من exosomes. - وبعد الحضانة، الطرد المركزي المزيج عينة / ExoQuick-TC في 10،000 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- نقل طاف لأنبوب جديد لتحليل SDS-PAGE.
- ويمكن تخزين بيليه exosome في -80 درجة مئوية لمدة DNA، RNA واستخراج البروتين وتقدير حجم الجسيمات exosome باستخدام CD9 ELISA 11.
ملاحظة: يمكن تخزين بيليه exosome في -80 درجة مئوية لمدة 1 سنة مع تجميد محدود والذوبان.
4. كشف العلامات البيولوجية وتحليل Exosome بيليه
- لتحليل المصب، استخراج DNA و RNA والبروتين من بيليه exosome باستخدام DNA / RNA / طقم العزلة البروتين وكي العزلة RNAر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحديد تركيزات باستخدام معمل NanoDrop من خلال قياس الامتصاصية في 260 و 280nm مع 2 ميكرولتر من العينة.
- أداء الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR (QPCR) باستخدام فحوصات الرنا الميكروي TAQMAN (في حالتنا، كنا الإنسان مير 192- ومير 1207-5p محددة المقايسات) أو الاشعال ميرنا محددة.
- لتحليل SDS-PAGE، استخدم 4-12٪ مكرر تريس هلام وعينات البروتين منفصلة من قبل الكهربائي واحدة الأبعاد. تصور المواد الهلامية استخدام عدة الفضة تلطيخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إجراء تحليل لطخة غربية باستخدام الأغشية PVDF وفقا للتعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. استخدام الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة لموت الخلايا المبرمج الجين المرتبط-2 التفاعل بروتين X أو ALIX والفأر وحيدة النسيلة الأجسام المضادة للورم قابلية الجينات 101 البروتين أو TSG101 في الكشف طخة الغربي. قياس كثافة العصابات التي كتبها الوصول المفتوح البرمجيات NIH يماغيج (http://rsbweb.nih.gov/ij/) أوبرنامج مماثل.
- تحديد عدد من الجزيئات exosome البولية تم الحصول عليها باستخدام مجموعة CD9 ELISA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
exosomes البولية تحمل البروتين، ميرنا ومرنا المؤشرات الحيوية يفرز من خلايا الظهارية الكلوية. عزل وكشف عن هذه exosomes قد توفر أداة تشخيصية مفيدة للكشف المبكر عن أمراض الكلى مثل اعتلال الكلية السكري. هناك عدة طرق لعزل exosomes من عينات البول التي جمعت من البشر. نحن سابقا مقابل ستة طرق البول exosome العزل والتحقيق مما أدى بروتين، مستويات مرنا، وميرنا 11. كان هدفنا هنا لوصف بالتفصيل هطول طريقة تعديل وضعنا لعزل فعالة من exosomes البولية.
ويصف الشكل 1 الرسم البياني التمثيلي التخطيطي لمختلف الخطوات المتبعة في عزل exosomes البولية باستخدام طريقة الترسيب المعدلة. واحدة من exosome المكررةيتم قياس بيليه الحصول عليها عن CD9 استخدام عدة CD9 ELISA، الذي يوفر لنا الكمي النسبي للجسيمات exosome. بيليه آخر معالجتها باستخدام QIAGEN DNA / RNA / البروتين عائدات مجموعة صغيرة DNA، RNA والبروتين، والتي تم قياسها باستخدام معمل NanoDrop معمل من خلال قياس الامتصاصية في 260 و 280 نانومتر.
الرقم 2 هو استنساخ معدلة من النتائج على تحليل SDS-PAGE وكشف العلامات البيولوجية باستخدام تحليل لطخة الغربي (مقتبس من المرجع 11). وفي الممرات مع البول غير المجهزة وأول بيليه البولية، وفرقة بروتين الموافق 90 و 100 كيلو دالتون لوحظ مبينا وجود وإزالة البروتين THP على التوالي. بينما في الممرات مع طاف النهائي وexosome بيليه، لم يكن لوحظ الفرقة البروتين الموافق THP، مما يدل على إزالة THP في الخطوات السابقة، ذرإيبي زيادة العائد من exosome بيليه. للوصول إلى النقاء وحساسية من الكريات exosome، كان يعمل الكشف طخة الغربي من المؤشرات الحيوية مثل أليكس وTSG101. اكتشفنا أليكس وTSG101 حتى عندما كميات منخفضة من العينة كانت تستخدم يشير النقي بشكل كبير بيليه exosome لتحليل العلامات البيولوجية وغياب البروتينات القابلة للذوبان وفيرة بما في ذلك THP. وقد تم تحليل الكثافة من البقع الغربية لتحديد وقياس مستوى الكشف (لا تظهر البيانات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معظم الطرق التي تنطوي على ترسيب exosomes من البول لا تعالج إزالة شبكة البوليمرية التي شكلتها البروتين تام-هورسفال (THP). هذا البروتين موجود في كميات كبيرة في البول، حيث exosomes أنه الفخاخ مزعومة أثناء الأولي الطرد المركزي بسرعة منخفضة. في أسلوبنا تعديل خفضنا THP باستخدام DTT قبل هطول الأمطار exosome. كما هو مبين في الشكل 2، لوحظ وجود كمية أكبر من THP في البول غير المجهزة وبيليه، مع عدم THP في طاف النهائي وexosome بيليه، ما يدل على إزالته من البروتين. الكمي من البروتين في بيليه أشار عائدات أعلى ست مرات، وعلى CD9 ELISA الكمي من بيليه، لوحظ أن العائد من exosome لكل مل من البول وخمس مرات أعلى من هطول الأمطار طريقة معدلة (النتائج لم تظهر 11). تم الكشف عن المؤشرات الحيوية أليكس 6 و 8 في TSG101 بيليه exosome. يمكننا أن كشف فقط هذه البروتينات باستخدام تتركزالعينات في هطول الأمطار طريقة معدلة. لاحظنا أيضا أعلى مستويات ميرنا (أي مير-192 ومير 1207-5p) والتعبير مرنا (أي TSG101، PDCD6IP وAQP2 12) باستخدام طريقة الترسيب تعديل 11. وتظهر مزايا وعيوب هذه الطريقة هطول الأمطار تعديل في الجدول 1.
| مزايا | عيوب |
| خطوات بسيطة سهلة وتتطلب خبرة قليلة النسبية لأداء | نقاء منخفضة من البروتينات التي تم الحصول عليها من exosomes البولية |
| لا يتطلب خطوة تنبيذ فائق | نظرا لغياب الخطوات تنبيذ فائق، بيليه exosome البولية التي تم الحصول عليها ليست نقية مثل مقارنة بيليه exosome تم الحصول عليها من طرق تنبيذ فائق |
| يستخدم كمية صغيرة من Urinعينة ه لعزل exosomes | للحصول على البروتين النقي للتحليل معين، خطوات تنقية البروتين مثل اللوني تقارب ستكون هناك حاجة |
| الحصول على كمية جيدة من ميرنا، مرنا والبروتينات من exosomes البولية مقارنة بغير المعدلة هطول طريقة | بضع خطوات الإضافية المطلوبة مع اضافة DTT للحد من الوقوع في الشرك من البروتين تام-هورسفال مقارنة بغير المعدلة هطول طريقة |
| كانت خصوصية وحساسية المؤشرات الحيوية تحليلها مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها وتحليلها باستخدام طريقة تنبيذ فائق | |
| exosomes البولية يمكن عزله عن عدد كبير من العينات في وقت واحد، مناسبة لتجارب سريرية | |
| أقل اليدين في الوقت المحدد مقارنة الأساليب تنبيذ فائق |
الجدول 1. مزايا وعيوب precipita تعديلطريقة نشوئها لالبولية العزلة exosome.
نستنتج أن نقدمها تعديل لطريقة هطول الأمطار هو سريع طريقة بسيطة، وفعالة لعزل exosomes البولية ويعتبر بديل مناسب لطريقة تنبيذ فائق، وهو كثيفة العمالة ويتطلب معدات باهظة الثمن. يتطلب طريقة لدينا أي خطوة تنبيذ فائق، من السهل القيام بها، ويتطلب أقل من الخطوات، في حين لا يزال توفير العائد المرتفع أو exosomes نقية للالتحليلات الجزيئية لاحقة. وتبين لنا أيضا أن غلة ميرنا ومرنا باستخدام هذه الطريقة مرتفعة، وبالتالي يمكن استخدامها مباشرة في احقة المصب تطبيقات التنميط RNA. ومع ذلك، نلاحظ أن وجود قيود على هذا الأسلوب هو نوعية البروتين التي تم الحصول عليها، وهي ليست نقية كما أن الحصول عليها باستخدام أساليب التدرج تنبيذ فائق السكروز، ويتطلب خطوات تنقية إضافية قبل استخدامها في التحليلات البروتين المصب. ونحن حاليا بتقييم جدوى هذه المنهجياتالتطوير التنظيمي باستخدام عينات البول التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من اعتلال الكلية السكري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم دفع رسوم النشر لهذا المقال من قبل العلوم البيولوجية الفرعية للتنفيذ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
