Introduction
Urin exosomes er små interne vesikler på 100 nm av multivesikulære organer (MVB) avledet fra alle celletyper under normale og patologiske tilstander i urin plass inkludert glomerulære podocytes, nyretubuli celler og celler lining urindreneringssystemer som ser ut til å bli beriket for mirnas 1 -2. Mange forskere har oppdaget forskjellige proteiner i exosomes isolert fra urinen til friske individer så vel som de med nedsatt nyre- og / eller systematiske sykdommer 3-5. Exosomes kan isoleres ved hjelp av forskjellige metoder slik som to-trinns differensialultrasentrifugering med eller uten sukrose 6-7, ved å kombinere nanomembrane filter med ultrasentrifuge 8-9, eller utfelling 10-11. Vi har nylig utviklet en enkel, rask, skalerbar og effektiv metode for å isolere urin exosomes og oppdage miRNA og protein biomarkører 11. Selv biomarkører kan detekteres i en rekke forskjellige biologiske fluider, urine er den mest praktiske valget for pasienter med sykdommer i nyrene og urinveiene, fordi den kan oppnås i store mengder i et forholdsvis ikke-invasiv måte.
Selv om det finnes flere metoder for å isolere urin exosomes 6-11, den mest brukte fremgangsmåten er avhengig av differensialultrasentrifugering med en 30% sukrose pute. Selv om denne metoden er effektiv, og kvaliteten av de resulterende exosomes isolert med denne fremgangsmåten er høy, den teknikk som i seg selv krever faglært personell, og er tidkrevende, krever flere ultra-sentrifugeringstrinn. Andre metoder, som filtrering og nedbør, har blitt utviklet for isolering av exosomes, inkludert en som bruker en proprietær nedbør reagens (dvs. ExoQuick-TC: System biovitenskap, Mountain View, California). Selv om utfelling ved hjelp av denne reagens er rask og relativt lett, er lav renhet exosomes isolert i forhold til ultrasentrifuge method. Vi har nylig sammenlignet seks fremgangsmåter for isolering av urin exosomes, inkludert en modifikasjon av fremgangsmåten ved hjelp av utfelling ExoQuick-TC som vi utviklet i vårt laboratorium 11. Vi fant ut at dette endret nedbør metoden ga høyere mengder av protein, miRNA, og mRNA og selve inngrepet var raskere og enklere å implementere enn ultracentrifugation. Her beskriver vi den eksperimentelle protokollen av vår modifiserte nedbør metode i en stegvis, og inkluderer en drøfting av fordeler og ulemper ved denne teknikken sammenlignet med andre metoder for exosome isolasjon. Den modifiserte utfelling metoden innebærer en første utfelling av exosome partikler, etterfulgt av fjerning av Tamm-Horsfall protein, som er korrelert med exosomal proteiner og er kjent for å redusere exosome utbytte fra urin. Vi har funnet at disse modifikasjoner øker utbyttet og renheten av exosomal preparat fra urin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
. MERK: Trinnene som er involvert i isolering av urin exosomes ved hjelp av den modifiserte utfellingsmetoden er illustrert i figur 1. De innledende trinn omfatter fjerning av store døde celler og celleavfall ved sentrifugering. Den endelige pellet erholdt fra supernatanten samlet fra hver etterfølgende trinn tilsvarer den exosome, som oppløses i isolasjon løsning for videre ekstraksjon av protein, RNA og DNA.
1. Innsamling av Urin
- Før urin samling, forberede proteasehemmer cocktail i henhold til produsentens instruksjoner og legge til 3,125 ml av denne cocktail til en tom steril beholder. Røret inneholdende protease inhibitor cocktail kan deretter bli distribuert til frivillige for urinoppsamling.
MERK: Grunnen til å tilsette proteasehemmer er å minimalisere proteindegradering i urinprøven. Selv om vi spesielt brukt en proteasehemmer cocktail fraSigma, kan andre kommersielt tilgjengelige proteaseinhibitorer være substituert. - Samle ca 10 ml første ugyldig urin. Behandle urin umiddelbart etter samling uten lagring eller kjøling. Isolere urin exosomes i to eksemplarer ved hjelp av den modifiserte nedbør metoden; en av dubletter er for DNA, RNA og protein total ekstraksjon, mens den andre er for kvantifisering av urin exosome partikler.
MERK: En 24-timers urinprøve kan samles for exosome isolasjon ved å lagre ved 4 ° C.
2. Fjerning av celleavfall og Tamm-Horsfall Protein (THP)
- Overfør urinprøver til 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger 10 ml urin ved 17.000 xg i 10 min ved 37 ° C for å fjerne celler og celleavfall (figur 1).
- Ved hjelp av en pipette, overføres supernatanten til et nytt rør for videre behandling. Resuspender pelleten i 500 pl av isolasjons oppløsning (250 mM sukrose, 10 mM triethanolamine, pH 7,6) etterfulgt av 10 min inkubering med DL-ditiotreitol (DTT: endelig konsentrasjon på 200 mg / ml) ved 37 ° C.
MERK: DTT er lagt til degradere THP, som feller exosomes, som fører til redusert avkastning. Vær nøye med å forlate pellet uforstyrret under overføring av supernatanten, og bekrefter at det overstående er klar av pellet. - Vortex pelletprøver hvert 2 min inntil pelleten fullstendig oppløst. Deretter legger 500 mL av isolasjon løsning på oppløst pellet.
- Umiddelbart etter tilsetningen av isolasjons løsning på pelleten, sentrifuger ved 17 000 xg i 10 min ved 37 ° C. Pipetter supernatanten og kombinere med supernatanten oppsamlet tidligere.
- Resuspender pelleten i 50 ul av isolasjons løsning for SDS-PAGE-analyse.
MERK: PBS eller TBS kan brukes i stedet for isolering løsning for å resuspendere pelleten.
3. Isolering av Exosome Pellet
- Til 11 ml av den oppsamlede supernatant, tilsett 3,3 ml ExoQuick-TC-reagens og inkuber ved 4 ° C i minst 12 timer.
MERK: Forholdet mellom volum av supernatant til ExoQuick-TC reagens kan justeres for å øke eller redusere exosomal utbytte. Vi observerte at mindre mengder lagt reagent produsere mindre avkastning av exosomes. - Etter inkubering, sentrifuger prøven / ExoQuick-TC blanding ved 10.000 xg i 30 min ved 25 ° C.
- Overfør supernatanten til et nytt rør for SDS-PAGE-analyse.
- Den exosome pellets kan lagres ved -80 ° C i DNA, RNA og proteinutvinning og kvantifisering av exosome partikler ved bruk av ELISA CD9 11.
MERK: exosome pellet kan oppbevares ved -80 ° C i 1 år med begrenset frysing og tining.
4. Biomarkør Detection og analyse av Exosome Pellet
- For nedstrøms analyser, ekstrahere DNA, RNA og protein fra exosome pellet ved bruk av DNA / RNA / Protein isolert kit og en RNA-isolering kit henhold til produsentens instruksjoner. Bestemme konsentrasjoner ved hjelp av et Nanodrop spektrofotometer ved måling av absorbansen ved 260 og 280 nm med 2 pl av prøven.
- Utføre kvantitativ real time RT-PCR (qPCR) ved hjelp av Taqman mikroRNA analyser (i vårt tilfelle brukte vi menneskelige Mir-192- og Mir-1207-5p-spesifikke analyser) eller miRNA-spesifikke primere.
- For SDS-PAGE analyse, bruker 4-12% Bis-Tris gel og separate proteinprøver av endimensjonale elektroforese. Visual gels hjelp av sølvfargesett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Utføre western blot analyse ved hjelp av PVDF membraner i henhold til instruksjonene fra produsenten. Bruk kaninpolyklonalt antistoff til apoptose bundet gen-2 samspill protein X eller ALIX og mus monoklonalt antistoff mot tumor resistensgenet 101-protein eller TSG101 i western blot deteksjon. Kvantifisere tettheten av bandene med åpen tilgang NIH ImageJ programvare (http://rsbweb.nih.gov/ij/) elleret lignende program.
- Kvantifisere antall urin exosome partikler oppnådd ved bruk av en CD9 ELISA kit i henhold til produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Urin exosomes bære protein, miRNA og mRNA biomarkører utskilt fra nyre epitelceller. Isoleringen og deteksjon av disse exosomes kan gi et nyttig diagnostisk verktøy for tidlig påvisning av nyresykdommer slik som diabetisk nefropati. Det finnes flere metoder for isolering av exosomes fra urinprøver samlet inn fra mennesker. Vi har tidligere sammenlignet seks metoder for urin exosome isolasjon og undersøkt resulterer protein, mRNA, og miRNA nivåer 11. Vårt mål her var å beskrive i detalj den modifiserte nedbør metoden vi har utviklet for effektiv isolering av urin exosomes.
Figur 1 beskriver skjematisk representativt flytskjema over forskjellige trinn i isoleringen av urin exosomes ved hjelp av den modifiserte utfellingsmetoden. En av de dupliserte exosomepellet innhentet måles for CD9 bruker CD9 ELISA kit, som gir oss den relative kvantifisering av exosome partikler. Den andre pellet behandles ved hjelp av Qiagen DNA / RNA / Protein mini kit utbytter DNA, RNA og protein, som ble kvantifisert ved hjelp av Nanodrop spektrofotometer ved måling av absorbansen ved 260 og 280 nm.
Figur 2 er en modifisert gjengivelse av resultatene på SDS-PAGE-analyse og biomarkør deteksjon ved hjelp av western blot-analyse (tilpasset fra referanse 11). I baner med ubehandlet urin og først urin pellet, et proteinbånd som tilsvarer 90 til 100 kDa ble observert indikerer nærvær og fjerning av THP-protein hhv. Mens i baner med endelig supernatant og exosome pellet ble proteinbånd svarende til THP ikke observert, noe som viser fjerning av THP i tidligere trinn, therEby øke utbyttet av exosome pellet. For å få tilgang til renhet og følsomhet av exosome pellets, ble western blot påvisning av biomarkører som Alix og TSG101 ansatt. Vi oppdaget Alix og TSG101 selv når lave mengder av prøven ble brukt som indikerer betydelig ren exosome pellet for biomarkør analyse og fravær av rikelig løselige proteiner inkludert THP. Densitometrisk analyse av de vestlige blotter ble gjort for å kvantifisere og måle nivået for påvisning (data ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste metoder som involverer utfelling av exosomes fra urin ikke adressen fjerning av det polymere nettverk dannet av Tamm-Horsfall protein (THP). Dette proteinet finnes i store mengder i urin, hvor det putatively feller exosomes under innledende lavhastighetssentrifugering. I vår modifiserte metode reduserte vi THP bruker DTT før exosome nedbør. Som vist i figur 2, ble en høyere mengde av THP observert i den ubehandlede urin og pellet, med ingen THP i den endelige supernatant og pellet exosome, som indikerer fjerning av proteinet. Kvantifisering av protein i pelleten er angitt seks ganger høyere utbytte, og på CD9 ELISA kvantifisering av pelleten, ble det observert at utbyttet av exosome per ml urin ble fem ganger høyere enn den umodifiserte utfellingsmetoden (resultater ikke vist 11). Biomarkørene Alix 6 og TSG101 8 ble oppdaget i exosome pellet; vi bare kunne oppdage disse proteinene bruker konsentrertprøvene i umodifisert utfellingsmetoden. Vi har også observert de høyeste nivåene av miRNA (dvs. Mir-192 og Mir-1207-5p) og mRNA uttrykk (dvs. TSG101, PDCD6IP og AQP2 12) ved hjelp av den modifiserte utfellingsmetoden 11. Fordelene og ulempene ved denne modifiserte utfellingsmetoden er vist i tabell 1.
| Fordeler | Ulemper |
| Enkle enkle trinn og krever relativt lite kompetanse til å utføre | Lav renhet av proteiner erholdt fra urin exosomes |
| Krever ikke en ultrasentrifuge skritt | På grunn av fravær av ultrasentrifugetrinn, er den urin exosome pelleten oppnådd ikke så ren som i forhold til exosome pellet oppnådd fra ultrasentrifugemetoder |
| Bruker lite volum Urine prøve for isolering av exosomes | For å få ren protein for spesifikk analyse, ville protein rensetrinn som affinitetskromatografering være nødvendig |
| Innhentet god mengde miRNA, mRNA og proteiner fra Urin exosomes sammenlignet med ikke-modifiserte nedbør metode | Noen ekstra skritt som trengs med tillegg av DTT å redusere entrapment av Tamm-Horsfall protein sammenlignet med ikke-modifiserte nedbør metode |
| Spesifisitet og sensitivitet av biomarkører som ble analysert var lik den som ble oppnådd og analysert ved hjelp av metoden Ultrasentrifugering | |
| Urin exosomes kan isoleres fra stort antall prøver på en gang, egnet for klinisk stier | |
| Mindre hands-on tid sammenliknet med ultrasentrifuge metoder |
Tabell 1. Fordeler og ulemper ved endret utfeltmetode for urin exosome isolasjon.
Vi konkluderer med at vår modifikasjon av utfellingsmetoden er en enkel, rask og effektiv måte å isolere urin exosomes og er et egnet alternativ til ultrasentrifugemetoden, noe som er arbeidskrevende og krever kostbart utstyr. Vår metode krever ingen ultracentrifugation skritt, er lett å utføre, og krever mindre trinn, samtidig som du får en høy avkastning eller rene exosomes for påfølgende molekylære analyser. Vi viser også at utbyttene av miRNA og mRNA ved hjelp av denne metoden er høy, og følgelig kan anvendes direkte i etterfølgende nedstrøms RNA profilering applikasjoner. Imidlertid ser vi at en begrensning av denne metode er kvaliteten av proteinet erholdt, som ikke er så rent som det som ble oppnådd ved hjelp av ultra-sentrifugeringsmetoder sukrosegradient, og krever ytterligere rensetrinn før anvendelse i nedstrøms proteomic analyser. Vi er for tiden å vurdere nytten av denne method hjelp av urinprøver oppnådd fra pasienter med diabetisk nefropati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Publiserings avgifter for denne artikkelen ble betalt av SBI biovitenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning 15 ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
References
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
