Summary
اتساع الأوعية الدموية (NV) من القرنية يمكن أن يعقد الأمراض البصرية متعددة. الاستفادة من وجود والقلوي الحرق نموذج الإصابة التي تسيطر عليها، ومستوى قياس الكمي من NV القرنية يمكن أن تنتج عن دراسة الآلية من NV القرنية وتقييم العلاجات المحتملة لاضطرابات التوعية المستحدثة.
Abstract
في ظل ظروف طبيعية، والقرنية هي اوعائي، وهذه الشفافية أمر ضروري للحفاظ على البصر جيدة. اتساع الأوعية الدموية (NV) من القرنية، والتي يمكن أن يكون سببها الصدمة، القرنية أو الأمراض المعدية، ينهار ما يسمى "شرف عائية 'القرنية ويشكل أساس الأمراض البصرية المتعددة التي قد تؤدي إلى العمى. على الرغم من أن هناك العديد من الخيارات العلاجية المتاحة، والحاجة الطبية الأساسية المقدمة من الأمراض التوعية المستحدثة القرنية لا تزال غير الملباة. من أجل تطوير علاجات آمنة وفعالة، وهادفة، لا بد من نموذج يمكن الاعتماد عليها من NV القرنية والتدخل الدوائي. هنا، نحن تصف إصابة القلويات الحرق نموذج اتساع الأوعية الدموية القرنية في الماوس. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتطبيق إصابة القلويات حرق تسيطر على القرنية، وإدارة مجمع الدوائية المصالح، وتصور النتيجة. هذا الأسلوب يمكن أن تكون أجهزة قياسالتل لدراسة آليات والفرص أمام التدخل في NV القرنية واضطرابات التوعية المستحدثة الأخرى.
Introduction
العمى القرنية هو رابع سبب الأكثر شيوعا من العمى، مسؤولة عن ما يقرب من 4٪ من جميع الحالات 1. اتساع الأوعية الدموية القرنية (NV) تلعب دورا هاما في كثير من هذه الأمراض، بما في ذلك التهاب القرنية بالهربس (أهم الأمراض المعدية المسببة للعمى في الغرب) والتراخوما (السبب الرئيسي للعمى في جميع أنحاء العالم المعدية) 2. وتشمل العلاجات الحالية المنشطات، والأدوية المضادة للالتهابات (المسكنات)، والعلاجات المضادة للVEGF، والسيكلوسبورين A وكذلك التقنيات الجراحية التقليدية أو بالليزر 3. ومع ذلك، فإن الطبيعة المنهكة بشدة من الأمراض NV مقرها القرنية، وقلة المرافق الجراحية قادرة على معالجة NV القرنية، وعدم وجود خيار الدوائية أداء قويا بقيادة مائدة مستديرة الخبراء مؤخرا أن نخلص إلى أن، على الرغم من العلاجات موجودة، والحاجة الطبية الأساسية قدم من قبل هذه الأمراض لا تزال غير الملباة 4.
القرنية البشريةيتكون من 5 طبقات، 3 طبقات الخلوية (الظهارية، اللحمية والبطانة) و2 واجهة (بومان الغشاء وغشاء ديسميه). وهو يعمل كحاجز الميكانيكية والسطحية للعين الانكسار. طبيعته شفافة هو نتيجة لتوازن دقيق لمكوناته وجزء لا يتجزأ من وظيفة مناسبة لها 5. عادة اوعائي، يتلقى القرنية الدم من microvessels على طول الحافة الخارجية والتي يتم تغذيتها من الهدبية والشرايين العيون. يحدث القرنية NV عندما حافزا يشجع الأوعية الدموية من هذه السفن مما يسمح لها أن تنمو نحو مركز القرنية، وبالتالي تحد من الرؤية 6. ويشمل الأوعية الدموية القرنية hemangiogenesis وlymphangiogenesis، مما يؤدي في نشوب الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية من الممرات الأوعية الدموية الحوفي نحو مركز القرنية. وهذا يؤدي إلى انهيار القرنية "امتياز عائية"، زيادة في عتامة القرنية والتليف، اختلال القرنية لاyers، وذمة 7. مشغلات دقيقة من NV القرنية عديدة، بدءا من الاستجابة للأمراض المعدية مثل التراخوما إلى حالة يسببها كيميائيا تسبب الأدوية التقليدية، والمواد الكيميائية الصناعية، أو عوامل الحرب الكيميائية حتى.
الآليات الجزيئية لهذه العملية ليست، حتى الآن، تتميز بشكل كامل؛ ومع ذلك، فقد تم تحديد عدد قليل من اللاعبين الرئيسيين. في ظل ظروف طبيعية القرنية تمتلك فريد 'امتياز عائية' التي تحتفظ بها مجموعة زائدة من العوامل المضادة للعائية (مثل ذوبان VEGF-R1) 8. ومع ذلك، واستجابة لحافز خارجي (مثل إصابة)، سيكون هناك upregulation المحلية من العوامل المؤيدة للعائية (مثل VEGF-A). هذه النصائح ميزان العوامل المؤيدة والمضادة للعائية الذي يكمن وراء امتياز عائية القرنية، ويؤدي إلى وhemangiogenesis، lymphangeogenesis، والتهاب، وبالتالي التسبب في أمراض القرنية وحتى العمى 9.
<ع الطبقة = "jove_content"> ونظرا للم تلب الحاجة الطبية لهذه الأمراض المنهكة للغاية، فإنه من مصلحة إلى الميدان لديهم نموذج حيواني موثوقة من NV القرنية. نحن هنا تقديم مثل هذا النموذج: تسيطر إصابة القلويات الحرق. وقد استخدمت نماذج مختلفة لافتة للإصابة على أساس استخدام فلتر حلقات رقة منذ 1970s 10. في عام 1989، وتتميز مجموعة من أطباء العيون كلية الطب بجامعة هارفارد نموذجا مستوى القرنية اصابة القلوي حرق المركزية في أرنب على أساس تمرغ قطعة من ورق الترشيح دائرية مع هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) وتطبيقه على القرنية في مجموعة محددة من تركيزات 11. منذ ذلك الحين، وقد تم تكييف هذه التقنية لاستخدامها في 12-14 الماوس. في الآونة الأخيرة، ودرس في المختبر وانغ الآثار العلاجية للdeacetylase هيستون (HDAC) مثبط ساها في التسبب في NV القرنية باستخدام الماوس القرنية القلوي حرق إصابة نموذج 15. تم بناء منهجية الماوس القرنية نموذج إصابة القلويات حرق المقدمة هناأساسا على العمل قبل ورقتين أخرى 14،16.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: بروتوكول التالية ونتائج ممثلة استخدام مثبط HDAC ساها باعتبارها مركب سبيل المثال. ومع ذلك، وهذا البروتوكول هو بأي حال من الأحوال تقتصر على استخدام ساها، وينصح كأسلوب عام لاختبار آثار المركبات القابلة للذوبان على اتساع الأوعية الدموية القرنية. سوف تحتاج إلى تعديلات طفيفة يتم للحصول على درجة من التخفيف وكذلك تواتر ومدة التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، سوف المركبات القابلة للذوبان في الماء بسهولة تكون قادرة على أن تدار في غياب DMSO.
بيان الأخلاقية: يجب فقط أن يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للقانون واللوائح الوطنية المؤسسية. تمت الموافقة على هذا البروتوكول للاستخدام من قبل جامعة تولين المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.
1. إعداد مواد (في ترتيب الاستخدام)
- قطع قطعة من ورق الترشيح السليلوز (11 ميكرون) إلى 2 ملم الدوائر.
- إعداد محلول هيدروكسيد الصوديوم 1 M من قبلحل 20 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في 500 مل المقطر H 2 O. تخزين في درجة حرارة الغرفة. تنبيه: حلول هيدروكسيد الصوديوم هي تآكل ويمكن أن يسبب حروق القلويات.
- إعداد كوكتيل مخدر عن طريق تمييع 10 مل من 100 ملغ / مل الكيتامين و 2.5 مل من 20 ملغ / مل في زيلازين 37.5 مل من برنامج تلفزيوني 1X لتركيز النهائي من 20 ملغ / مل الكيتامين و 4 ملغ / مل زيلازين.
- إعداد محلول 0.5٪ من بروباراكايين هيدروكلوريد (لتسكين موضعي) عن طريق إذابة 500 ملغ من هيدروكلوريد بروباراكايين في 100 مل من برنامج تلفزيوني تصفيتها.
- إعداد برنامج تلفزيوني 1X عن طريق إذابة 8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام من بوكل، 1.44 ز نا 2 هبو 4، و 0.23 غرام من ناه 2 ص 4 في 900 مل من H 2 O. المقطر ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تجلب الحل إلى الحجم النهائي من 1،000 مل مع المقطر H 2 O ومرشح لضمان العقم.
- إعداد 1،000 خ حلول المخزون من ساها في ~ 100 ملم في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) عن طريق إذابة 26.4 ملغ من ساها في 1 مل من DMSO. تمييع ل1X (~ 10 ميكرومتر)الحل في برنامج تلفزيوني لتصفية كل استخدام. تخزين الحل السهم عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. تنبيه: DMSO هو السم المعروف والمغير.
- إعداد محلول 4٪ من بارافورمالدهيد (PFA) لتثبيت. تحت غطاء الكيميائية، ويحل 4 غرام من PFA في 90 مل من برنامج تلفزيوني. جلب الخليط إلى 65 درجة مئوية ويعاير إلى الرقم الهيدروجيني من 7.4. مرة واحدة وقد حل PFA، وجلب الحل إلى الحجم النهائي من 100 مل. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. تنبيه: PFA هو المعروف أن الحساسية المسببة للسرطان، والسامة.
- إعداد عازلة تمنع 1X عن طريق تمييع 5 مل من مصل الماعز و 500 من المجاهدين تريتون X-100 في 94.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- إعداد 1X العازلة الغسيل عن طريق تمييع 500 من المجاهدين تريتون X-100 في 99.5 مل من برنامج تلفزيوني.
2. القلويات حرق الإصابات ومجمع العلاج
- بلل قطعة مستديرة من ورق الترشيح، ~ 2 مم في القطر، في حل من هيدروكسيد الصوديوم M 1.
- تخدير الفأر مع حقنة من 100 ملغ / كغ الكيتامين و 5 ملغ / كغ زيلازين، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافى المعنوى هو ~ 100 ميكرولتر من مخدر كوكتيل من الخطوة 1.3 لكل 25 غرام الماوس. التخدير يجب أن تأخذ ~ 1-2 دقيقة لتعيين بوصة عمق التخدير قد يحددها معسر بلطف أخمص القدمين أو ذيل الحيوان، إذا التخدير كافية وينبغي أن يكون هناك أي رد. ملاحظة: يجب توخي الحذر لضمان الماوس لا تستسلم للتخدير يسببها انخفاض حرارة الجسم.
- باستخدام شافطة، وتطبيق موضعيا قطرة من 0.5٪ بروباراكايين هيدروكلوريد على سطح القرنية لتسكين المحلية.
- باستخدام ملقط معقم، والتقاط قطعة من ورق الترشيح هيدروكسيد الصوديوم غارقة. إذا لاحظت الزائدة هيدروكسيد الصوديوم أو التشبث يقطر من ورقة الترشيح، اضغط لفترة وجيزة ورقة الترشيح غارقة على قطعة جافة من ورق الترشيح لامتصاص الزائد. وضع قطعة من ورق الترشيح هيدروكسيد الصوديوم غارقة في القرنية المركزية. اتركه لمدة 30 ثانية لتوليد حرق القلويات الحادة من ~ 2 × 2 مم 2 في المنطقة. الميكروسكوب الجراحي مفيد في وضع صحيح ورقة الترشيح. ملاحظة: عين واحدة فقط من ليالي الماوسيكون اصيب hould معها مع الآخر بمثابة السيطرة.
- إزالة ورقة الترشيح. باستخدام حقنة 10 مل، مسح بلطف العين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X مرتين ليغسل المتبقية 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
- تطبق على الفور قطرة من 1X ساها الحل تعمل (أو السيطرة على السيارة التي تتألف من برنامج تلفزيوني المخفف DMSO لا تحتوي على ساها) موضعيا على القرنية. تكرار 3x/day التطبيق لمدة 14 يوما. ملاحظة: خلال هذه الفترة لا ينصح مرهم مضاد حيوي موضعي لأنها قد تتداخل مع تطور الإصابة وتسليم المجمع. استخدام المضادات الحيوية حل السائل، مثل 3٪ جنتاميسين الحل، بدلا من ذلك.
- الانتقال مباشرة إلى التقييم السريري (بروتوكول 3 أدناه) أو التضحية الماوس واستأصل العينين لالقرنية مسطحة جبل (البروتوكول 4 أدناه) أو التقليدية البارافين / الأنسجة المجمدة.
3. التقييم السريري
- إجراء فحص اليومي من الفئران بطريقة أعمى تحت المجهر الجراحي ويسجل جorneal NV على أساس عتامة القرنية، NV، وحجم السفينة. استخدام اثنين على الأقل من المراقبين وتسجيل النتيجة النهائية وهذا هو المتوسط من الاثنين.
- يسجل عتامة القرنية على مقياس من 0-4. 0 = واضحة تماما؛ 1 = ضبابي قليلا، قزحية والتلميذ مرئية بسهولة؛ 2 = مبهمة قليلا، قزحية والتلميذ لا يزال كشفها؛ 3 = مبهمة، والتلاميذ بالكاد يمكن كشفها؛ و4 = مبهمة تماما مع أي رأي للتلميذ.
- يسجل NV على مقياس من 0-3. 0 = لا neovessels؛ 1 = neovessels في حوف القرنية؛ 2 = neovessels تمتد حوف القرنية والاقتراب من مركز القرنية؛ 3 = neovessels تمتد وسط القرنية.
- يسجل حجم السفينة على مقياس من 0-3. 0 = لا neovessels؛ 1 = neovessels كشفها تحت المجهر الجراحي؛ 2 = neovessels رؤيتها بسهولة تحت المجهر الجراحي؛ 3 = neovessels ينظر اليه بسهولة دون المجهر.
- باستخدام كاميرا رقمية، والتقاط الصور ممثل العين في 7 أيام و 14 يوما.
4.القرنية تلطيخ وشقة الجبال
- إصلاح العين منزوعة النواة في PFA 4٪ لمدة 1 ساعة على الأقل في 4 درجات مئوية.
- نقل العين إلى برنامج تلفزيوني 1X واستخدام الملقط لإزالة الأنسجة الزائدة بعناية.
- مع المعونة من الميكروسكوب الجراحي، واستخدام إبرة (قياس 18) أو الجزئي سكين لخرم المنطقة المحيطة بالقرنية من العين (ملاحظة: هذا يجب إصدار السائل من العين).
- من ثقب المحرز في القسم 4.3.1 استخدام زوج من مقص جراحي لقطع الجزء الأمامي من العين (القرنية) من الجزء الخلفي.
- نقل القرنية مرة أخرى في PFA 4٪ بين عشية وضحاها لتثبيت في 4 درجات مئوية.
- تجاهل PFA 4٪ (تنبيه: PFA خطرة ويجب التخلص منها وفقا للأنظمة المؤسسية) وشطف القرنية ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لإزالة أي PFA المتبقية.
- احتضان في عرقلة العازلة 1X لا يقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة لpermeabilize الأنسجة ومنع ملزم غير محدد من الأجسام المضادة الأولية.
- تطبيق الأجسام المضادة الأولية في 1X العازلة حظر، في التخفيف 100-500 أضعاف. (مثل الفئران لمكافحة فأر PECAM-1-للكشف عن الأوعية الدموية في 1:100، أرنب المضادة للماوس-LYVE-1 للكشف عن الأوعية اللمفاوية في 1:500، و / أو anti-mouse-F4/80 الفئران للكشف عن الضامة في 1:100). احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- يغسل ست مرات مع 1X العازلة الغسيل لمدة 1 ساعة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير منضم بالكامل.
- تطبيق الضد الثانوية في 1X العازلة حظر على 500-1،000 التخفيف أضعاف. (على سبيل المثال 488 نانومتر الفلورسنت الموسومة الماعز المضادة للمفتش الجرذان في 1:800 أو الفلورسنت 594 نانومتر الموسومة الماعز المضادة للأرنب مفتش في 1:800). احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة كل لإزالة الأجسام المضادة الثانوية بالكامل غير منضم.
- نقل القرنية في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة و، بمساعدة الميكروسكوب الجراحي، وجعل بعناية أربعة شقوق من المحيط نحو المائةإيه. وهذا ينبغي تقسيم القرنية إلى أربعة أجزاء متساوية في الحجم تقريبا (الشكل الناتج ينبغي أن ننظر بدلا مثل فراشة) والسماح لها الاستلقاء على الشريحة.
- جبل مع تصاعد المناسبة المتوسطة للتصوير الفلورسنت. للحصول على أفضل النتائج، يجب أن يمكن تصوير العينات فورا وأخذ الصور الرقمية، ولكن يمكن تخزينها لعدة أسابيع محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد إصابة القلويات الحرق، يحدث NV القرنية في التنبؤ بها، تعتمد على الوقت المناسب. الشكل 1 يوضح الفرق صارخ سواء في اتساع الأوعية الدموية وعتامة القرنية بين حيوان غير المعالجة (الشكل 1A) وحيوان تعامل مع مثبط HDAC ساها (الشكل 1B ) في نقطة زمنية لمدة 7 أيام.
أرقام 2A و 2B يبرهن على وجود جبل مسطح القرنية من العين السيطرة غير المعالجة الأولية مع PECAM-1-1 LYVE وتلطيخ والثانوية اليكسا فلور 488 و 594 تلطيخ (على التوالي). أرقام 2C و 2D تظهر نفس تلطيخ على العين تعامل اليومي مع وHDAC المانع ساها، لاحظ الانخفاض الكبير في كل hemangiogenesis وlymphangiogenesis.
أرقام 3A 3B وتقديم نظرة مفصلة على البقع اثنين. يخدم PECAM-1 علامة لBLOسفن التطوير التنظيمي (الشكل 3A)، في حين LYVE-1 يربط على وجه التحديد إلى الأوعية اللمفاوية (الشكل 3B). يظهر تراكب حقلين في الشكل 3C، مما يتيح المقارنة بين hemangiogenesis مقابل lymphangiogenesis فضلا عن مقارنة مورفولوجيا الخلايا المختلفة.
التالية PFA التثبيت (الخطوة 4.1)، يمكنك استخدام بروتوكولات باجتزاء التقليدية (غير مفصل في البروتوكول أعلاه) لتوليد أقسام إما مجمدة أو البارافين جزءا لا يتجزأ من العين. في حين أن هذا لا يسمح على نفس المستوى من تقدير حجم الغزو الذي جبل مسطح يفعل، ويمكن المقاطع السهمي للقرنية تظهر لك سمك القرنية وعمق النسبي للأنابيب داخل العين. أرقام 3D-F يظهر، أقسام المجمدة السهمي القرنية وإما F4/80 (بلعم تلطيخ)، دابي (تلطيخ النووية)، أو صورة المدمجة.
الشكل 1. تطور اتساع الأوعية الدموية القرنية بعد سبعة أيام إصابة القلويات الحرق. (A) صورة الممثل من العين دون علاج. (ب) صورة الممثل من العين معاملة ثلاث مرات يوميا مع مجمعنا الفائدة (المانع HDAC ساها). لاحظ الفرق في عتامة القرنية واتساع الأوعية الدموية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صور ممثل عنصر تحكم غير المعالجة (A و B) وساها المعالجة (C و & #160؛ بعد D) القرنية سبعة أيام القلوي حرق إصابة (A و C) صورة حقل واسع من الأوعية الدموية تلطيخ الخلايا البطانية مع PECAM-1. (B و D) صورة حقل واسع من اللمفاوي تلطيخ الخلايا البطانية مع LYVE-1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3 (أ) الأوعية الدموية تلطيخ الخلايا البطانية مع PECAM-1. (B) اللمفاوي تلطيخ الخلايا البطانية مع LYVE-1. (C) مدموجة PECAM-1/LYVE-1 تلطيخ. (D) F4/80 تلطيخ الضامة في قسم المجمدة السهمي. (E) دابي الحادي وaining من نواة الخلية في خفض المجمدة قسم السهمي. (F) مدموجة F4/80 وتلطيخ دابي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا النتائج في مستويات استنساخه من hemangiogenesis، lymphangiogenesis، والتهاب، مما يجعله نظام مثالي لدراسة هذه (المترابطة) العمليات الثلاث. في حين تنتج هذه الطريقة NV القرنية مركزية، العديد من الطرق التي تم تطويرها لتتسبب في المزيد من توجه NV، وهي خياطة القرنية وزرع 17 عامل النمو معربا عن الكريات 18، قد يكون أيضا من الفائدة. تم تصميم بروتوكول لدينا للاستخدام في الماوس الكبار، وتوفير وسيلة سهلة لاستخدام نموذج حيواني في الوقت الذي تسمح أيضا مختبر للاستفادة الكاملة من مجموعة كبيرة من التقنيات الجزيئية والمعدلة وراثيا ليست متاحة بعد للثدييات أكبر. بروتوكول أعلاه ونتائج ممثلة من التفصيل استخدام الفئران على خلفية C57BL/6J. أن الفئران البيضاء أيضا أن تكون مناسبة ويمكن أن توفر لتسهيل التصوير؛ ومع ذلك، يشير إلى وجود دراسة حديثة أن الاستجابة التوعية المستحدثة من الفئران البيضاء قد لا تكون مثيرة 19. علاوة على ذلك، على عكس العديد مننماذج اتساع الأوعية الدموية الأخرى، ويمكن أن سجل NV القرنية مع الفحص من خلال الميكروسكوب الجراحي أو حتى بالعين المجردة. إذا كنت بحاجة لتقدير أكثر صرامة لمدى اتساع الأوعية الدموية، الصور الرقمية للشقة جبل الملون يمكن تحليلها عن طريق عدد من حزم البرمجيات، ومثال على كيفية القيام بذلك مع فوتوشوب CS4 يمكن أن يرى في كونر، وآخرون. الأخيرة الطبيعة البروتوكولات ورقة "الكمي لاعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين في الماوس" 20.
هيدروكلوريد بروباراكايين هو مسكن استر الأمينية تطبيقها كحل موضعي (فمن الممكن أن أعضاء آخرين من هذه العائلة من شأنه أن يكون مقبولا على قدم المساواة). على الرغم من أن يتم وضع الحيوان تحت التخدير العام لإجراء العملية، نرى تسكين موضعي إضافي ضرورة أخلاقية لمنع الألم التراجع إلى القرنية. لا بد أن PBS تستخدم لتخفيف المركب الخاص بك وطرد تتم تصفيته العين وتبقى نظيفة طوال عشرالإجراء ه (التحقق من وجود علامات واضحة للتلوث قبل كل استعمال). ويسمى برنامج تلفزيوني لمدة يعتمد على تقليد مختبر الفردية؛ أي محلول ملحي متوازن يعادل يجب تحقيق النتيجة المرجوة. وبالمثل، يمكن أن يسمى المراجعات البروتوكول المناعية المقدمة هنا لفي حالة استخدام الأجسام المضادة من مصادر أخرى (أي درجة من التخفيف مطلوب).
أصعب تقنيا أجزاء من هذا الإجراء هي موضع الأولي من ورقة الترشيح هيدروكسيد الصوديوم غارقة وتشريح القرنية. نوصي أن كلا من تقنيات أن تمارس قبل الإجراء الفعلي. يجب وضع ورق الترشيح في وسط القرنية من أجل تعزيز مستوى متساو من اتساع الأوعية الدموية من جميع الجهات. وبأي درجة من تعويض خلق مستوى عال من التباين من الفأر إلى الماوس. تشريح القرنية يتطلب قدرا كبيرا من البراعة اليدوية. ومن المرجح أن تشوه ردا على محاولة لخرم المنطقة المحيطة بالقرنية العين.نوصي باستخدام حادة، صغيرة إبرة مقياس لجعل خفض الأولي والافراج عن الضغط داخل. بعد يتم إجراء ثقب الأولية، وزوج من مقص جراحي يمكن إدراجها في حفرة وتستخدم لقطع على طول خط وهمي يفصل بين الأمامي من العين من العين كوب الخلفي. يجب العمل ببطء وبعناية تسفر عن القرنية سليمة.
تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن الغرض الأساسي من هذا البروتوكول هو لفحص فعالية من المركبات المختلفة في علاج القرنية إصابة القلويات الحرق كما أن لديها القدرة على أن تستخدم لدراسة الجرح القرنية إعادة epitheliaztion، تليف القرنية، والجذعية الظهارية الحوفي تجديد الخلايا. وعلاوة على ذلك، فإنه يخدم كنموذج عام لاستكشاف آليات hemangiogenesis المرضية، lymphangiogenesis، والالتهابات. السهولة النسبية التي يمكن أن يؤديها البروتوكول، فضلا عن طبيعته موسع، يمثل فرصة جذابة للفي الجسم الحي مجمع فحص واختبار فعاليةق، وتوصيف نماذج الماوس المعدلة وراثيا فيما يتعلق الأوعية الدموية المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نحن ممتنون للمساعدة الدكتور شينيو لى في إعداد المخطوطة. وأيد SW من صندوق بدء التشغيل من جامعة تولين، مجلس البحوث جائزة الباحث جديد الرئيس من مركز UT ساوث ويسترن الطبي، المعاهد الوطنية للصحة منح EY021862، وهي جائزة التطوير الوظيفي من البحوث لمنع الأساس العمى، وجائزة برايت التركيز في السن المتصلة تحلل البقعة الصفراء البحوث .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 18 G Needle | BD | 305918 | |
| 10 ml Syringe | BD | 306575 | |
| 25 G Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, VECTASHIELD | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5 mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. Global estimates of visual impairment. Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).
- Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. Corneal Blindness: A Global Perspective. Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).
- Gupta, D., Illingworth, C. Treatments for corneal neovascularization: a review. Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).
- Cursiefen, C., et al. Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable. Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).
- Delmonte, D., Kim, T. Anatomy and Physiology of the Cornea. J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
- Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options. Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).
- Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. Corneal Neovascularization. Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).
- Ambati, B., et al. Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1. Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).
- Cursiefen, C., et al. VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment. J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).
- Jiri, O. Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries. Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).
- Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Saika, S., et al. Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice. Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).
- Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).
- Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).
- Li, X., et al. Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model. Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).
- Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis. Acta Ophthalmol. , (2012).
- Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern. Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).
- Rogers, M., et al. The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness. Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).
- Connor, K., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological. Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).
