Summary
A neovascularização (NV) da córnea pode complicar múltiplas patologias visuais. Utilizando um modelo controlado lesão alcalino-queima, um nível quantificável da NV córnea pode ser produzido para o estudo mecanicista da NV córnea e avaliação de potenciais terapias para doenças neovascular.
Abstract
Sob condições normais, a córnea é avascular, e esta transparência é essencial para manter uma boa acuidade visual. Neovascularização (NV) da córnea, o que pode ser causado por trauma, ceratoplastia ou doença infecciosa, decompõe o chamado 'privilégio angiogénico' da córnea e forma a base de várias patologias visuais que podem mesmo conduzir à cegueira. Embora existam várias opções de tratamento disponíveis, a necessidade médica fundamentais apresentados por patologias neovascular córnea permanece inacabado. A fim de desenvolver terapias seguras, eficazes e direcionados, é necessário um modelo confiável de NV córnea e intervenção farmacológica. Aqui, descrevemos um modelo de neovascularização corneana lesão álcali-queimadura no mouse. Este protocolo fornece um método para a aplicação de uma lesão alcalino-queima controlada para a córnea, a administração de um composto farmacológico de interesse, e a visualização do resultado. Este método poderia ser instrumentaltal para o estudo dos mecanismos e oportunidades de intervenção em NV córnea e outros distúrbios neovascular.
Introduction
Cegueira da córnea é a quarta causa mais comum de cegueira, responsável por cerca de 4% de todos os casos de 1. Neovascularização da córnea (NV) desempenha um papel importante em muitas destas patologias, incluindo a ceratite herpética (a principal causa infecciosa de cegueira no Ocidente) e tracoma (a principal causa de cegueira no mundo inteiro infeccioso) 2. As terapias atuais incluem esteróides, medicamentos anti-inflamatórios não-esteróides (AINE), terapias anti-VEGF e ciclosporina A, bem como as técnicas cirúrgicas convencionais ou a laser 3. No entanto, a natureza altamente debilitante de patologias NV base da córnea, a escassez de instalações cirúrgicas capazes de tratar NV córnea, ea falta de uma opção farmacológica fortemente a realização de uma mesa redonda liderada especialista recente a concluir que, apesar das terapias existentes, a necessidade médica fundamentais apresentado por estas patologias permanece insatisfeita 4.
A córnea humanaé composto por 5 camadas, 3 camadas celulares (epitelial, estroma e endotélio) e 2 de interface (membrana de Bowman e membrana Descemet). Ela funciona como uma barreira mecânica e a superfície de refracção para o olho. A sua natureza transparente é a conseqüência de um delicado equilíbrio de seus componentes, e é parte integrante da sua função própria 5. Normalmente avascular, a córnea recebe sangue microvasos que correm ao longo do seu bordo exterior, que são alimentados a partir da ciliar e artérias oftálmicas. Corneal NV ocorre quando um estimulo promove a angiogénese dos vasos, permitindo-lhes crescer em direcção ao centro da córnea e assim limitar a visão 6. Angiogênese corneana inclui hemangiogenesis e lymphangiogenesis, o que resultará no crescimento interno dos vasos sanguíneos e vasos linfáticos da arcada vascular do limbo em direção ao centro da córnea. Isto leva a uma quebra de córnea "privilégio angiogênico", um aumento na opacidade da córnea e fibrose, rompimento da córnea laYERS, edema e 7. Os gatilhos precisas de NV córnea são inúmeras, que vão desde uma resposta a doenças infecciosas, como o tracoma a um estado induzido quimicamente causado medicamentos tradicionais, produtos químicos industriais, ou até mesmo agentes de guerra química.
Os mecanismos moleculares deste processo não são, ainda, totalmente caracterizado; no entanto, alguns jogadores-chave foram identificados. Sob condições normais, a córnea possui um único 'privilégio angiogénico "mantida por um conjunto redundante de factores anti-angiogénicos (tais como solúveis de VEGF-R1) 8. No entanto, em resposta a um estímulo externo (por exemplo, uma lesão), não haverá uma regulação positiva locais de factores pró-angiogénicos (por exemplo, VEGF-D). Este dicas o equilíbrio de fatores pró e anti-angiogênicos que subjaz privilégio angiogênico da córnea, e leva a hemangiogenesis, lymphangeogenesis e inflamação, portanto, causando patologia da córnea e até cegueira 9.
<p class = "jove_content"> Dada a necessidade médica não atendida desta patologia altamente debilitante, é de interesse para o campo para ter um modelo animal confiável de NV córnea. Aqui apresentamos um modelo desse tipo: controlado lesão álcali-queimadura. Vários modelos olho-lesão com base em uso de anéis de papel de filtro são usados desde 1970 10. Em 1989, um grupo de oftalmologistas Harvard Medical School caracterizado um modelo padrão de lesão da córnea alcalino-queimadura central em coelhos com base no embebendo um pedaço de papel de filtro circular com hidróxido de sódio (NaOH) e aplicando-a à córnea a uma gama específica de concentrações 11. Desde então esta técnica tem sido adaptada para uso no rato 12-14. Recentemente, o laboratório de Wang estudou os efeitos terapêuticos da histona deacetilase (HDAC) SAHA na patogênese da NV córnea utilizando um modelo de lesão da córnea alcalino-burn rato 15. A metodologia do modelo de lesão da córnea do rato alcalino-burn aqui apresentado foi construídoprincipalmente no trabalho prévio de dois outros jornais 14,16.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: O seguinte protocolo e os resultados representativos utilizar o inibidor HDAC SAHA como um composto de exemplo. No entanto, este protocolo é de modo algum limitado ao uso de SAHA, e é recomendada como um método geral para testar os efeitos de compostos solúveis em neovascularização córnea. Pequenas modificações terão de ser feitas para o grau de diluição, assim como a frequência e duração da aplicação. Além disso, os compostos que são facilmente solúveis em água poderá ser administrada na ausência de DMSO.
Declaração de ética: Todos os experimentos com animais só deve ser realizado em conformidade com a legislação nacional e os regulamentos institucionais. Este protocolo foi aprovado para uso pela Universidade de Tulane Institutional Animal Care e do Comitê Use.
1. Elaboração de Materiais (em ordem de utilização)
- Cortar um pedaço de papel de filtro de celulose (11 mm) em 2 milímetros círculos.
- Prepara-se uma solução 1 M de NaOH pordissolvendo 20 g de NaOH em 500 ml de água destilada H 2 O. Armazenar à temperatura ambiente. CUIDADO: soluções de NaOH são corrosivos e podem causar alcalinos-queimaduras.
- Preparar um cocktail anestésico por diluição de 10 ml de 100 mg / ml de cetamina e 2,5 ml de 20 mg / ml de xilazina em 37,5 ml de 1x PBS para uma concentração final de 20 mg / ml de cetamina e 4 mg / ml de xilazina.
- Prepara-se uma solução de 0,5% de cloridrato de proparacaína (para analgesia tópica) por dissolução de 500 mg de cloridrato de proparacaína, em 100 ml de PBS filtrado.
- Prepare 1x PBS por dissolução de 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, e 0,23 g de NaH 2 PO 4, em 900 ml de H2O destilada Ajustar o pH para 7,4. Levar a solução para um volume final de 1000 ml com H2O destilada e filtro para garantir a esterilidade.
- Preparar 1000 x soluções de estoque de SAHA em ~ 100 mM em dimetil-sulfóxido (DMSO) por dissolução de 26,4 mg de SAHA em 1 ml de DMSO. Dilui-se a um 1x (~ 10 mM)solução filtrada em PBS por cada utilização. Armazene a solução de reserva, a -20 ° C durante até um mês. CUIDADO: DMSO é uma toxina conhecida e mutagênico.
- Prepara-se uma solução de 4% de paraformaldeído (PFA) para fixação. Dentro de uma câmara química, dissolver 4 g de PFA em 90 ml de PBS. Levar a mistura até 65 ° C e a titulação para um pH de 7,4. Uma vez que o PFA tem dissolvido, levar a solução a um volume final de 100 ml. Armazenar a 4 ° C por até um mês. CUIDADO: PFA é um conhecido por ser alergênico, cancerígeno e tóxico.
- Preparar tampão de bloqueio por diluição 1x 5 ml de soro de cabra e de 500 ul de Triton X-100 em 94,5 ml de PBS.
- Preparar tampão de lavagem 1x diluindo 500 ul de Triton X-100 em 99,5 ml de PBS.
2. Alkali-Burn Tratamento de Lesões e Composto
- Molhe um pedaço redondo de papel de filtro, ~ 2 mm de diâmetro, em uma solução de NaOH 1 M.
- Anestesiar o rato com uma injeção de 100 mg / kg de ketamina e 5 mg / kg de xilazina, which é ~ 100 l do cocktail anestésico do passo de 1,3 por 25 g mouse. A anestesia deve tomar ~ 1-2 min para definir polegadas de profundidade da anestesia pode ser determinado comprimindo suavemente o dedo do pé ou da cauda do animal, se a anestesia for suficiente deve haver nenhuma resposta. Nota: Cuidados devem ser tomados para garantir o mouse não sucumbir à hipotermia induzida anestesia.
- A utilização de um conta-gotas, aplicar topicamente uma gota de cloridrato de proparacaína a 0,5% sobre a superfície da córnea para analgesia local.
- Utilizando uma pinça estéril, pegar um pedaço de papel de filtro embebido NaOH. Se você notar excesso de NaOH ou agarrando-se a pingar do papel de filtro, toque brevemente o papel de filtro embebido em um pedaço de papel de filtro seco para absorver o excesso. Coloque o pedaço de papel de filtro embebido NAOH na córnea central. Deixá-lo por 30 segundos para gerar um álcali-queimadura aguda de ~ 2 x 2 mm 2 de área. Um microscópio cirúrgico é útil para colocar adequadamente o papel de filtro. Nota: Apenas um olho do rato should ser feridos com o outro serve como um controlo.
- Remover o papel de filtro. Usando uma seringa de 10 ml, lavar cuidadosamente o olho com 10 ml de PBS 1x duas vezes para lavar o resíduo de NaOH 1 M.
- Imediatamente aplicar uma gota de solução de trabalho de 1 x SAHA (ou um controlo de veículo que consiste em PBS diluídas contendo DMSO sem SAHA) topicamente para a córnea. Repita 3x/dia pedido de 14 dias. Nota: durante este período uma pomada antibiótica tópica não é recomendado, pois pode interferir com o desenvolvimento da lesão e da entrega do composto. Usar uma solução de antibiótico líquido, solução de gentamicina, tal como 3%, em vez disso.
- Vá diretamente para Avaliação Clínica (Protocolo 3 abaixo) ou sacrificar o mouse e enuclear os olhos por córnea plana de montagem (Protocolo 4 abaixo) ou parafina / histologia congelado convencional.
3. Avaliação Clínica
- Executar um exame diário dos ratinhos de forma cega sob o microscópio cirúrgico e marcar corneal NV baseado na opacidade da córnea, NV, e tamanho do vaso. Use pelo menos dois observadores e gravar um escore final que é a média dos dois.
- Pontuação opacidade da córnea em uma escala de 0-4. 0 = completamente claras; 1 = um pouco obscuro, íris ea pupila facilmente visível; 2 = ligeiramente opacos, íris ea pupila ainda detectável; 3 = opacos, alunos dificilmente detectáveis; e 4 = totalmente opacos, sem vista do aluno.
- Pontuação NV numa escala de 0-3. 0 = sem neovasos; 1 = neovasos no limbo da córnea; 2 = neovasos que medem o limbo da córnea e se aproximando do centro da córnea; 3 = neovasos abrangendo o centro da córnea.
- Pontuação tamanho do vaso em uma escala de 0-3. 0 = sem neovasos; 1 = neovasos detectáveis ao microscópio cirúrgico; 2 = neovasos facilmente vistos ao microscópio cirúrgico; 3 = neovasos facilmente visto sem o microscópio.
- Usando uma câmera digital, tirar fotos representativas do olho em 7 dias e 14 dias.
4.Corneal Coloração e planas Mounts
- Fix olho enucleado em PFA a 4% durante pelo menos 1 hora a 4 ° C.
- Transfira o olho para 1x PBS e utilize uma pinça para remover cuidadosamente o excesso de tecido.
- Com o auxílio de um microscópio cirúrgico, usar uma agulha (18 gauge) ou micro-faca para perfurar a região pericorneal do olho (Atenção: este deve liberar líquido do olho).
- A partir da perfuração feita na secção 4.3.1 usar um par de tesouras cirúrgicas para cortar a porção anterior do olho (córnea) a partir da porção posterior.
- Transferir a córnea para trás em PFA a 4% para a fixação durante a noite a 4 ° C.
- Descarte a 4% PFA (ATENÇÃO: PFA é perigoso e deve ser eliminado de acordo com as normas institucionais) e enxaguar a córnea três vezes com PBS 1x de remover qualquer PFA residual.
- Incubar em 1x tampão de bloqueio durante, pelo menos, 2 horas à temperatura ambiente, para permeabilizar o tecido e impedir a ligação inespecífica do anticorpo primário.
- Aplicar o anticorpo primário em tampão de bloqueio 1x, a uma diluição de dobragem 100-500. (Por exemplo, rato anti-mouse-PECAM-1 para a detecção de vasos sanguíneos a 1:100, coelho anti-rato-lyve-1 para a detecção de vasos linfáticos em 1:500, e / ou anti-mouse-F4/80 rato para a detecção de macrófagos a 1:100). Incubar a 4 ° C durante a noite.
- Lavar seis vezes com 1x tampão de lavagem durante 1 hora de cada vez, à temperatura ambiente para remover totalmente o anticorpo primário não ligado.
- Aplicar um anticorpo secundário em 1x tampão de bloqueamento, a uma diluição de dobragem 500-1.000. (Por exemplo, uma lâmpada fluorescente de 488 nm com etiquetas de cabra anti-rato-IgG em 1:800 ou fluorescente 594 nm com etiquetas de cabra anti-coelho-IgG de 1:800). Incubar a 4 ° C durante a noite.
- Lavar três vezes com 1x PBS, durante 1 h cada, à temperatura ambiente para remover completamente o anticorpo secundário não ligado.
- Transferir a córnea em fresco 1x PBS e, com o auxílio de um microscópio cirúrgico, cuidadosamente fazer quatro incisões da periferia para o center. Isso deve dividir a córnea em quatro quadrantes de tamanho aproximadamente igual (a forma resultante deve ser um pouco como uma borboleta) e deixe-o deitado em um slide.
- Monte com um apropriado meio de montagem para a imagem latente fluorescente. Para melhores resultados, as amostras devem ser fotografada imediatamente e fotografias digitais feita, mas pode ser conservada durante várias semanas, ao abrigo da luz a 4 ° C.
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Representative Results
Após lesão alcalino-queimadura, NV córnea ocorre em, dependente do tempo de forma previsível. Figura 1 demonstra a diferença gritante tanto na neovascularização e opacidade da córnea entre um animal não tratado (Figura 1A) e de um animal tratado com o inibidor de HDAC SAHA (Figura 1B ) no ponto de tempo de 7 dias.
As Figuras 2A e 2B mostram uma montagem plana da córnea de um olho de controlo não tratado com PECAM-1 e LYVE-1 coloração primária e secundária com Alexa Fluor 488 e 594 de coloração (respectivamente). Figuras 2C e 2D mostram a mesma coloração em um olho tratado diariamente com o inibidor HDAC SAHA, observe a diminuição drástica tanto hemangiogenesis e lymphangiogenesis.
Figuras 3A e 3B oferecem um olhar detalhado sobre as duas manchas. PECAM-1 serve um marcador para o blood vasos (Figura 3A), enquanto LYVE-1 liga-se especificamente aos vasos linfáticos (Figura 3B). Uma sobreposição dos dois campos é mostrado na Figura 3C, o que permite a comparação dos hemangiogenesis vs linfangiogénese assim como uma comparação da morfologia das células diferentes.
Após PFA fixação (passo 4.1), você pode usar protocolos de seccionamento convencionais (não detalhados no protocolo acima) para gerar seções embutidos ou congelados ou parafina do olho. Enquanto isso não permitir o mesmo nível de quantificação de invasão que uma montagem plana faz, sagitais da córnea pode mostrar-lhe a espessura da córnea e profundidade relativa dos tubos dentro do olho. Figuras 3D-F mostra sagital, cortes congelados da córnea e quer F4/80 (coloração macrófagos), DAPI (coloração nuclear) ou uma imagem mesclada.
Figura 1. A progressão da neovascularização corneana sete dias após a lesão álcali-queimadura. (A) Imagem representativa de um olho não tratado. (B) Imagem representativa de um olho tratado três vezes por dia com o nosso composto de interesse (o inibidor HDAC SAHA). Observe a diferença de opacidade da córnea e neovascularização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens representativas de um controlo não tratado (A e B) e um SAHA tratados (C e & #160; D) córnea sete dias após álcali-queimaduras A e C) imagem de campo amplo de coloração da célula endotelial vascular com PECAM-1 (.. (B e D) imagem de campo amplo de coloração de células endoteliais linfáticas com lyve-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. (A) coloração endotelial vascular de células com PECAM-1. (B) linfática de coloração de células endoteliais com LYVE-1. (C) Incorporada coloração PECAM-1/LYVE-1. (D) coloração F4/80 de macrófagos em uma seção congelada sagital. (E) DAPI ruaaining de núcleos de células em uma seção de corte congelado sagital. (F) Incorporada F4/80 e coloração DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado resulta em níveis reprodutíveis de hemangiogenesis, lymphangiogenesis e inflamação, tornando-se um sistema ideal para estudar estes três processos (inter-relacionadas). Enquanto este método produz NV córnea centralizado, vários métodos que foram desenvolvidos para causar mais direcionado NV, ou seja, a sutura da córnea 17 e implantados do fator de crescimento expressando pelotas 18, também pode ser do seu interesse. Nosso protocolo é projetado para uso no rato adulto, proporcionando um fácil de usar modelo animal enquanto também permite que um laboratório para tirar o máximo proveito de uma série de técnicas moleculares e transgênicos ainda não está disponível para os mamíferos maiores. O protocolo acima e resultados representativos detalhes o uso de ratos em um fundo C57BL/6J. Camundongos albinos também seria adequado e pode fornecer para a imagem mais fácil; No entanto, um estudo recente indica que a resposta neovascular de ratos albinos não pode ser tão dramática 19. Além disso, ao contrário de muitosoutros modelos neovascularização, NV córnea pode ser marcado com o exame através de um microscópio cirúrgico ou mesmo a olho nu. Se for necessária uma quantificação mais rigorosa do grau de neovascularização, imagens digitais do monte liso manchado pode ser analisado através de um número de pacotes de software, um exemplo de como fazê-lo com o Photoshop CS4 pode ser visto em Conner, et al. recente Nature Protocols papel "Quantificação da retinopatia induzida por oxigênio no rato" 20.
Cloridrato de proparacaína é um analgésico aminoéster aplicado como uma solução tópica (que é possível que outros membros desta família seria igualmente aceitável). Mesmo que o animal é colocado sob anestesia geral para o procedimento, que julgamos analgesia tópica adicional uma necessidade ética para evitar dor de desfazer para a córnea. É imperativo que o PBS usado para diluir o composto e lave o olho ser filtrada e mantida limpa durante todo diaprocedimento e (verificar se há sinais visíveis de contaminação antes de cada utilização). PBS é chamado para baseada na tradição laboratório individual; qualquer solução de sal equilibrada equivalente deve atingir o resultado desejado. Da mesma forma, as revisões do protocolo de imuno-histoquímica apresentado aqui pode ser chamado para se anticorpos de outras fontes são usados (ou seja, o grau de diluição necessário).
Os mais tecnicamente desafiador partes deste processo são a colocação inicial do papel de filtro embebido NaOH ea dissecação da córnea. Recomendamos que ambas as técnicas ser praticado antes do procedimento real. O papel de filtro deve ser colocado no centro da córnea, a fim de promover um nível igual de neovascularização de todos os lados. Qualquer grau de compensação vai criar um alto nível de variabilidade de mouse para mouse. Dissecção da córnea requer uma boa dose de destreza manual. O olho é susceptível de se deformar em resposta a uma tentativa para perfurar a região pericorneal.Recomendamos a utilização de um forte, pequena agulha de calibre para fazer o corte inicial e liberar a pressão no interior. Depois de uma punção inicial é feita, de um par de tesouras cirúrgicas pode ser inserido no orifício e usada para cortar ao longo de uma linha imaginária que separa o segmento anterior do olho a partir do cálice ocular posterior. Trabalhando devagar e com cuidado deve render uma córnea intacta.
Deve-se notar que, embora o objetivo principal deste protocolo é para testar a eficácia de vários compostos no tratamento de lesões da córnea alcalino-queima, também tem o potencial de ser usado para estudar ferimento da córnea re-epitheliaztion, fibrose da córnea, e tronco epiteliais límbicas renovação celular. Além disso, ela serve como um modelo geral para explorar os mecanismos de hemangiogenesis patológico, linfangiogénese e inflamação. A relativa facilidade com que o protocolo pode ser realizada, bem como a sua natureza não invasiva, apresenta uma oportunidade atraente para o rastreio de compostos in vivo, ensaio de eficácias, e caracterização de modelos de camundongos transgênicos com respeito a angiogênese patológica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Somos gratos pela ajuda de Dr. Xinyu Li na preparação do manuscrito. SW foi suportado por um fundo de Startup da Universidade de Tulane, do Conselho de Pesquisa New Award do Presidente Investigador da UT Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, um prêmio de desenvolvimento de carreira a partir da pesquisa para prevenir a cegueira fundação, e um prêmio brilhante Foco na Idade Degeneração Macular Relacionada à Pesquisa .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 18 G Needle | BD | 305918 | |
| 10 ml Syringe | BD | 306575 | |
| 25 G Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, VECTASHIELD | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5 mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
References
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