Summary
La neovascularización (NV) de la córnea puede complicar múltiples patologías visuales. Utilizando un modelo de lesión de álcali-quema controlada, un nivel cuantificable de NV corneal puede ser producido para el estudio mecanicista de la NV corneal y la evaluación de posibles terapias para trastornos neovasculares.
Abstract
En condiciones normales, la córnea es avascular, y esta transparencia es esencial para mantener una buena agudeza visual. La neovascularización (NV) de la córnea, que puede ser causada por un traumatismo, queratoplastia o enfermedad infecciosa, se rompe el llamado "privilegio angiogénico 'de la córnea y constituye la base de múltiples patologías visuales que pueden incluso conducir a la ceguera. Aunque hay varias opciones de tratamiento disponibles, la necesidad médica fundamental presentado por patologías corneales neovasculares permanece insatisfecha. Con el fin de desarrollar terapias seguras, eficaces y selectivos, se requiere un modelo fiable de NV de la córnea y la intervención farmacológica. Aquí se describe un modelo de neovascularización corneal lesiones álcalis quemadura en el ratón. Este protocolo proporciona un método para la aplicación de una lesión alcalino-quema controlada a la córnea, la administración de un compuesto farmacológico de interés, y la visualización del resultado. Este método podría ser instrumentalTal para el estudio de los mecanismos y oportunidades para la intervención en NV corneal y otros trastornos neovasculares.
Introduction
Ceguera corneal es la cuarta causa más común de ceguera, responsable de aproximadamente el 4% de todos los casos 1. La neovascularización corneal (NV) desempeña un papel importante en muchas de estas patologías, incluyendo la queratitis herpética (la principal causa infecciosa de ceguera en Occidente) y el tracoma (la causa principal de ceguera en todo el mundo infecciosa) 2. Las terapias actuales incluyen esteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), las terapias anti-VEGF, y ciclosporina A, así como las técnicas quirúrgicas convencionales o láser 3. Sin embargo, la naturaleza gravemente debilitante de patologías NV basado corneales, la escasez de instalaciones quirúrgicas capaces de tratar NV corneal, y la falta de una opción farmacológica encarecidamente realizar encabezó una mesa redonda de expertos reciente a la conclusión de que, a pesar de las terapias existentes, la necesidad médica fundamental presentado por estas patologías permanece insatisfecha 4.
La córnea humanaconsta de 5 capas, 3 capas celulares (epitelial, del estroma y el endotelio) y 2 interfaz (membrana de Bowman y la membrana de Descemet). Funciona como una barrera mecánica y la superficie de refracción para el ojo. Su naturaleza transparente es la consecuencia de un delicado equilibrio de sus componentes, y es parte integral de su función adecuada 5. Normalmente avascular, la córnea recibe sangre de microvasos que se ejecutan a lo largo de su borde exterior que se alimenta desde la ciliar y las arterias oftálmicas. Corneal NV se produce cuando un estímulo promueve la angiogénesis de estos vasos permitiendo que crezcan hacia el centro de la córnea y por lo tanto limitar la visión 6. Angiogénesis corneal incluye hemangiogenesis y linfangiogénesis, que resultan en el crecimiento hacia el interior de los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos de la arcada vascular del limbo hacia el centro de la córnea. Esto conduce a un desglose de la córnea "privilegio angiogénico", un aumento en la opacidad de la córnea y la fibrosis, la alteración de la córnea Layers, y edema 7. Los disparadores precisos de NV corneal son numerosos, que van desde una respuesta a las enfermedades infecciosas como el tracoma en un estado inducido químicamente causado medicinas tradicionales, productos químicos industriales, o incluso agentes de guerra química.
Los mecanismos moleculares de este proceso no son, por ahora, completamente caracterizados; sin embargo, se han identificado algunos jugadores clave. En condiciones normales la córnea posee un 'privilegio angiogénico' única mantenida por una matriz redundante de factores anti-angiogénicos (tales como solubles de VEGF-R1) 8. Sin embargo, en respuesta a un estímulo externo (tal como una lesión), habrá una regulación por incremento local de factores pro-angiogénicos (por ejemplo, VEGF-A). Esto inclina la balanza de factores pro y anti-angiogénicos que subyace privilegio angiogénico de la córnea, y conduce a hemangiogenesis, lymphangeogenesis, y la inflamación, por lo tanto, causando la patología de la córnea e incluso ceguera 9.
<p class = "jove_content"> Debido a la necesidad médica no satisfecha de esta patología altamente debilitante, es de interés para el campo para tener un modelo animal fiable de NV corneal. Aquí se presenta un modelo de este tipo: control de lesiones álcalis quemadura. Se han utilizado diversos modelos de ojo de lesiones basado en el uso de anillos de papel de filtro desde 1970 10. En 1989, un grupo de oftalmólogos Escuela de Medicina de Harvard caracteriza un modelo estándar de una lesión alcalino-quemadura de la córnea central en conejo basado en remojo un pedazo de papel de filtro circular con hidróxido de sodio (NaOH) y su aplicación a la córnea en un rango específico de concentraciones 11. Desde entonces, esta técnica se ha adaptado para su uso en el 12-14 ratón. Recientemente, el laboratorio de Wang estudió los efectos terapéuticos de la histona deacetilasa (HDAC) inhibidor de SAHA en la patogénesis de NV de la córnea utilizando un modelo de lesión de la córnea del ratón alcalino-quemadura 15. La metodología del modelo de lesión de la córnea del ratón alcalino-quemadura presentado aquí fue construidoprincipalmente en el trabajo previo de otros dos trabajos 14,16.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: El siguiente protocolo y resultados representativos utilizan el inhibidor de HDAC SAHA como un compuesto de ejemplo. Sin embargo, este protocolo es de ningún modo limitada al uso de SAHA, y se recomienda como un método general para poner a prueba los efectos de los compuestos solubles en neovascularización de la córnea. Tendrá que ser hecha por el grado de dilución, así como la frecuencia y la duración de la aplicación modificaciones menores. Adicionalmente, los compuestos que son fácilmente solubles en agua podrán ser administrado en ausencia de DMSO.
Declaración de Ética: Todos los experimentos con animales no se deben efectuar de conformidad con la legislación nacional y los reglamentos institucionales. Este protocolo fue aprobado para su uso por la Universidad de Tulane Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
1. Preparación de los materiales (por orden de utilización)
- Corte un pedazo de papel de filtro de celulosa (11 m) en 2 círculos mm.
- Preparar una solución 1 M de NaOH pordisolviendo 20 g de NaOH en 500 ml de agua destilada H 2 O. Guarde a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: soluciones de NaOH es corrosivo y puede causar quemaduras alcalinos.
- Preparar un cóctel anestésico mediante la dilución de 10 ml de 100 mg / ml de ketamina y 2,5 ml de 20 mg / ml de xilazina en 37,5 ml de 1 x PBS para una concentración final de 20 mg / ml de ketamina y 4 mg / ml de xilazina.
- Preparar una solución de 0,5% de clorhidrato de proparacaína (para la analgesia tópica) mediante la disolución de 500 mg de clorhidrato de proparacaína en 100 ml de PBS filtrada.
- Preparar PBS 1x disolviendo 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, y 0,23 g de NaH 2 PO 4 en 900 ml de H2O destilada Ajuste a pH 7,4. Poner la solución en un volumen final de 1000 ml con H2O destilada y se filtra para garantizar la esterilidad.
- Preparar 1.000 x soluciones madre de SAHA en ~ 100 mM en dimetil sulfóxido (DMSO) disolviendo 26,4 mg de SAHA en 1 ml de DMSO. Diluir a una 1x (~ 10 M)solución en PBS filtrada para cada uso. La solución madre, a -20 ° C durante un máximo de un mes. PRECAUCIÓN: DMSO es una toxina y mutágeno conocido.
- Preparar una solución de 4% de paraformaldehído (PFA) para la fijación. Bajo una campana química, disolver 4 g del PFA en 90 ml de PBS. Llevar la mezcla a 65 ° C y valorar, a un pH de 7,4. Una vez que el PFA se ha disuelto, llevar la solución a un volumen final de 100 ml. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes. PRECAUCIÓN: PFA es una sabe que es alergénica, carcinogénico y tóxico.
- Preparar tampón de bloqueo 1x diluyendo 5 ml de suero de cabra y 500 ul de Triton X-100 en 94,5 ml de PBS.
- Preparar tampón de lavado 1x mediante la dilución de 500 ul de Triton X-100 en 99,5 ml de PBS.
2. Álcali-Tratamiento de Quemaduras Lesiones Compuesto
- Remojar una pieza circular de papel de filtro, ~ 2 mm de diámetro, en una solución de 1 M de NaOH.
- Se anestesia el ratón con una inyección de 100 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina, WHich es de ~ 100 l del cóctel anestésico desde el paso 1.3 por cada 25 g de ratón. La anestesia debe tomar ~ 1-2 min a establecer pulg Profundidad de la anestesia puede ser determinada por pellizcar suavemente la punta o la cola del animal, si la anestesia es suficiente no debe haber ninguna respuesta. Nota: Se debe tener cuidado para asegurar el ratón no sucumbe a la anestesia hipotermia inducida.
- Con un gotero, aplique tópicamente una caída del 0,5% de clorhidrato de proparacaína a la superficie de la córnea para la analgesia local.
- Usando una pinza estéril, tome un pedazo de papel de filtro empapado NaOH. Si usted nota un exceso de NaOH se aferran a goteo o del papel de filtro, toque brevemente el papel de filtro empapado en un pedazo de papel de filtro seco para absorber el exceso. Coloque la pieza de papel de filtro empapado NAOH en la córnea central. Déjelo por 30 segundos para generar un álcali-quemadura aguda de ~ 2 x 2 mm 2 de superficie. Un microscopio quirúrgico es útil en colocar correctamente el papel de filtro. Nota: Sólo un ojo de la s del ratónhould lesionarse con el otro que sirve como control.
- Retire el papel de filtro. Usando una jeringa de 10 ml, limpiar suavemente el ojo con 10 ml de 1x PBS dos veces para lavar residual de 1 M de NaOH.
- Inmediatamente aplique una gota de solución de trabajo 1x SAHA (o un control de vehículo que consiste en DMSO de PBS diluido que no contiene SAHA) tópicamente a la córnea. Repita 3 veces al día la aplicación durante 14 días. Nota: durante este período no se recomienda un ungüento antibiótico tópico ya que puede interferir con el desarrollo de la lesión y la entrega del compuesto. Use una solución de antibiótico líquido, solución de gentamicina tales como el 3%, en lugar.
- Proceder directamente a la Evaluación Clínica (Protocolo 3 a continuación) o sacrificar el ratón y enucleación de los ojos durante la córnea plana mount (Protocolo 4 abajo) o parafina / histología congelado convencional.
3. Evaluación clínica
- Realizar un examen diario de los ratones de una manera ciega con un microscopio quirúrgico y anotar corneal NV basa en la opacidad corneal, NV, y el tamaño del buque. Utilice por lo menos dos observadores y registrar una puntuación final que es el promedio de los dos.
- Puntuación opacidad de la córnea en una escala de 0-4. 0 = totalmente claras; 1 = poco nebuloso, iris y la pupila fácilmente visible; 2 = ligeramente opacos, el iris y la pupila aún detectable; 3 = opacos, los alumnos casi no detectables; y 4 = completamente opacos, sin vistas de la pupila.
- Puntuación NV en una escala de 0-3. 0 = sin neovasos; 1 = neovasos en el limbo de la córnea; 2 = neovasos que atraviesan el limbo corneal y se acercan al centro de la córnea; 3 = neovasos que atraviesan el centro de la córnea.
- Puntuación tamaño del vaso en una escala de 0-3. 0 = sin neovasos; 1 = neovasos detectables al microscopio quirúrgico; 2 = neovasos fácilmente visibles con microscopio quirúrgico; 3 = neovasos fácilmente visibles sin el microscopio.
- El uso de una cámara digital, tomar imágenes representativas de los ojos a los 7 días y 14 días.
4.Corneal Coloración y monturas Piso
- Fijar ojo enucleado en el 4% PFA durante al menos 1 hora a 4 ° C.
- Transferir el ojo a 1x PBS y utilizar pinzas para quitar con cuidado el exceso de tejido.
- Con la ayuda de un microscopio quirúrgico, el uso de una aguja (calibre 18) o micro-cuchillo para perforar la región pericorneal del ojo (nota: este debe liberar líquido del ojo).
- A partir de la perforación realizada en la sección 4.3.1 usar un par de tijeras quirúrgicas para cortar la parte anterior del ojo (córnea) de la porción posterior.
- Transfiera la córnea de nuevo en PFA al 4% para la fijación de la noche a 4 ° C.
- Deseche el 4% PFA (PRECAUCIÓN: PFA es peligrosa y debe ser eliminado de acuerdo con las normas institucionales) y enjuagar la córnea tres veces con 1x PBS para eliminar cualquier PFA residual.
- Incubar en tampón de bloqueo 1x durante al menos 2 horas a temperatura ambiente para permeabilizar el tejido y evitar la unión no específica del anticuerpo primario.
- Aplicar el anticuerpo primario en tampón de bloqueo 1x, a una dilución de plegado 100-500. (Por ejemplo, de rata anti-ratón-PECAM-1 para la detección de los vasos sanguíneos a 1:100, de conejo anti-ratón-LYVE-1 para detectar los vasos linfáticos a 1:500, y / o anti-mouse-F4/80 de rata para la detección de macrófagos a 1:100). Incubar a 4 ° C durante la noche.
- Lave seis veces con 1x tampón de lavado durante 1 hora cada vez a temperatura ambiente para eliminar por completo el anticuerpo primario no unido.
- Aplicar un anticuerpo secundario en 1x tampón de bloqueo a una dilución veces 500-1.000. (Por ejemplo, un fluorescente 488 nm etiquetados de cabra anti-rata-IgG a 1:800 o un fluorescente 594 nm etiquetados de cabra anti-IgG de conejo a 1:800). Incubar a 4 ° C durante la noche.
- Lavar tres veces con 1x PBS durante 1 hr cada uno a temperatura ambiente para eliminar totalmente el anticuerpo secundario no unido.
- Transferencia de la córnea en 1x PBS fresco y, con la ayuda de un microscopio quirúrgico, hacer cuidadosamente cuatro incisiones desde la periferia hacia el cientoer. Esto debería dividir la córnea en cuatro cuadrantes de aproximadamente el mismo tamaño (la forma resultante debería ser más bien como una mariposa) y deje que se acueste en una diapositiva.
- Montar con un medio apropiado para el montaje de imagen fluorescente. Para obtener los mejores resultados, las muestras deben ser reflejados inmediatamente y fotografías digitales tomadas, sino que se pueden almacenar durante varias semanas protegidos de la luz a 4 ° C.
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Representative Results
Después de la lesión alcalino-quemadura, NV córnea se produce en una, de la manera dependiente del tiempo predecible. La Figura 1 demuestra la gran diferencia tanto en la neovascularización y la opacidad de la córnea entre un animal sin tratar (Figura 1A) y un animal tratado con el inhibidor de HDAC SAHA (Figura 1B ) en el punto de tiempo de 7 días.
Las Figuras 2A y 2B demuestran una córnea plana de montaje de un ojo de control no tratado con PECAM-1 y LYVE-1 tinción primaria y secundaria Alexa Fluor 488 y 594 tinción (respectivamente). Figuras 2C y 2D muestran la misma tinción en un ojo tratado diariamente con el inhibidor de HDAC SAHA, tenga en cuenta la dramática disminución en tanto hemangiogenesis y linfangiogénesis.
Las figuras 3A y 3B proporcionan una visión detallada de las dos manchas. PECAM-1 sirve un marcador para la BLOvasos OD (Figura 3A), mientras que LYVE-1 se une específicamente a los vasos linfáticos (Figura 3B). Una superposición de los dos campos se muestra en la Figura 3C, permitiendo la comparación de hemangiogenesis vs linfangiogénesis, así como una comparación de la morfología de células diferentes.
Siguiendo PFA fijación (paso 4.1), puede utilizar protocolos de seccionamiento convencionales (no detallados en el protocolo anterior) para generar secciones ya sea congeladas o embebidas en parafina de los ojos. Si bien esto no permite el mismo nivel de cuantificación de invasión que una montura plana hace, las secciones sagitales de la córnea pueden mostrarle espesor y la profundidad relativa de los tubos dentro del ojo. Figuras 3D-F muestra sagital secciones congeladas de la córnea y, o bien F4/80 (tinción de macrófagos), DAPI (tinción nuclear), o una imagen fusionada.
Figura 1. La progresión de la neovascularización corneal siete días después de la lesión a los álcalis quemadura. (A) Imagen representativa de un ojo sin tratar. (B) Imagen representativa de un ojo tratado tres veces al día con un compuesto de interés (el inhibidor de HDAC SAHA). Tenga en cuenta la diferencia en la opacidad de la córnea y la neovascularización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes representativas de un control sin tratar (A y B) y un SAHA tratados (C y & #160, D) de córnea siete días después de álcali-quemaduras A y C) Imagen de campo amplio de la tinción de células endoteliales vasculares con PECAM-1 (.. (B y D) Imagen de campo amplio de la tinción de las células endoteliales linfático con LYVE-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. (A) tinción endotelial vascular de células con PECAM-1. (B) tinción de células endoteliales linfáticas con LYVE-1. (C) Fusionada tinción PECAM-1/LYVE-1. (D) la tinción de los macrófagos F4/80 en una sección congelada sagital. (E) DAPI staining del núcleo de la célula en una sección de corte congelado sagital. (F) Fusionada F4/80 y tinción DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo que se presenta aquí se traduce en niveles reproducibles de hemangiogenesis, LI, y la inflamación, por lo que es un sistema ideal para estudiar estos tres procesos (interrelacionados). Mientras que este método produce centralizado NV córnea, varios métodos que se han desarrollado para causar más dirigida NV, a saber, la sutura de la córnea 17 y implantados factor de crecimiento expresando gránulos 18, también puede ser de interés. Nuestro protocolo está diseñado para su uso en el ratón adulto, proporcionando un fácil utilizar el modelo animal, además de facilitar un laboratorio para sacar el máximo provecho de una serie de técnicas moleculares y transgénicos aún no están disponibles para los mamíferos más grandes. El protocolo anterior y los resultados representativos detalle el uso de los ratones en un fondo C57BL/6J. Ratones albinos también serían convenientes y pueden disponer de imágenes más fácil; Sin embargo, un estudio reciente indica que la respuesta neovascular de ratones albinos puede no ser tan dramática 19. Además, a diferencia de variosotros modelos de neovascularización, NV córnea pueden ser marcados con el examen a través de un microscopio quirúrgico o incluso a simple vista. Si se requiere una cuantificación más rigurosa de la extensión de la neovascularización, imágenes digitales del teñido plana de montaje pueden ser analizados a través de una serie de paquetes de software, un ejemplo de cómo hacerlo con el photoshop CS4 se puede ver en Conner, et al. reciente Nature Protocols papel "Cuantificación de la retinopatía inducida por oxígeno en el ratón" 20.
Clorhidrato de proparacaína es un analgésico amino éster aplicado como una solución tópica (es posible que otros miembros de esta familia serían igualmente aceptables). A pesar de que el animal se coloca bajo anestesia general para el procedimiento, consideramos analgesia tópica adicional una necesidad ética para prevenir el dolor de deshacer a la córnea. Es imperativo que el PBS utilizado para diluir el compuesto y el rubor se filtrará a los ojos y mantiene limpio lo largo de thprocedimiento e (verificar si hay signos visibles de contaminación antes de cada uso). PBS se pide en base a la tradición del laboratorio individual; cualquier solución de sal equilibrada equivalente debe lograr el resultado deseado. Del mismo modo, las revisiones del protocolo de inmunohistoquímica que aquí se presenta puede ser llamado por si los anticuerpos de otras fuentes se utilizan (es decir, el grado de dilución requerido).
Los más técnicamente desafiante partes de este procedimiento son la colocación inicial del papel de filtro empapado NaOH y la disección de la córnea. Se recomienda que ambas técnicas pueden practicar antes del procedimiento real. Papel de filtro debe ser colocado en el centro de la córnea con el fin de promover un nivel igual de neovascularización desde todos los lados. Cualquier grado de desplazamiento va a crear un alto nivel de variabilidad de ratón a ratón. Disección corneal requiere una buena dosis de destreza manual. El ojo es probable que deformarse en respuesta a un intento de perforar la región pericorneal.Le recomendamos que utilice una aguja de calibre pequeño para hacer el corte inicial y libere la presión en su interior. Después se realizó una punción inicial, un par de tijeras quirúrgicas puede ser insertado en el agujero y se utiliza para cortar a lo largo de una línea imaginaria que separa la parte anterior del ojo de la copa posterior del ojo. Trabajando despacio y con cuidado debe producir una córnea intacta.
Cabe señalar que, si bien el propósito principal de este protocolo es para ensayar la eficacia de diversos compuestos en el tratamiento de la córnea lesión alcalino-quemadura también tiene el potencial de ser utilizado para estudiar la herida de la córnea re-epitheliaztion, la fibrosis corneal, y madre epiteliales del limbo la renovación celular. Además, sirve como un modelo general para explorar los mecanismos de hemangiogenesis patológico, LI, y la inflamación. La relativa facilidad con la que el protocolo se puede realizar, así como su naturaleza no invasiva, presenta una oportunidad atractiva para el cribado compuesto in vivo, prueba de eficacias, y la caracterización de modelos de ratones transgénicos con respecto a la angiogénesis patológica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos por la ayuda del Dr. Li Xinyu en la preparación del manuscrito. SW fue apoyada por un fondo de inicio de la Universidad de Tulane, Consejo de Investigación Premio al Investigador Nuevo del presidente de UT Southwestern Medical Center, NIH subvención EY021862, un premio de desarrollo de la carrera de la Investigación para Prevención de fundación ceguera, y un Premio Brillante Foco en la edad degeneración macular asociada a la Investigación .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 18 G Needle | BD | 305918 | |
| 10 ml Syringe | BD | 306575 | |
| 25 G Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, VECTASHIELD | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5 mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
References
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