Innvielse av metastatisk brystkreft ved målretting av Ductal Epitel med Adenovirus-Cre: A Novel transgene mus modell av brystkreft

Summary

Aktivering av latent mutasjoner med adenovirus-Cre i melke ductal systemet resulterer i en klinisk relevant metastatisk brystkreft. Inkorporering av en YFP promoter tillater sporing av distale metastatiske tumorceller. Denne modellen er nyttig for å studere latent metastase, anti-tumor immunforsvar, og for å utforme nye immunterapi for å behandle brystkreft.

Abstract

Brystkreft er en heterogen sykdom som involverer kompliserte cellulære interaksjoner mellom utviklings svulst og immunsystem, til slutt resulterer i eksponentiell tumorvekst og metastasering til distale vev og sammenbruddet av anti-tumor immunitet. Mange nyttige dyremodeller eksisterer for å studere brystkreft, men ingen fullstendig rekapitulere sykdomsprogresjon som forekommer hos mennesker. For å få en bedre forståelse av de cellulære interaksjoner som fører til dannelsen av latent metastasering og redusert overlevelse, har vi generert en induserbar transgen musemodell av YFP-uttrykke duktalt karsinom som utvikler seg etter kjønnsmodning i immun-kompetente mus og drives ved konsekvent, endokrine uavhengig onkogen uttrykk. Aktivering av YFP, ablasjon av p53, og ekspresjon av et oncogent form av K-ras ble oppnådd ved levering av en adenovirus som uttrykker Cre-rekombinase inn i melkekanalen av seksuelt modne, jomfrue hunnmus. Svulsterbegynner å vises seks uker etter oppstart av kreftfremkallende hendelser. Etter svulster bli tydelig, fremgang de sakte i ca to uker før de begynner å vokse eksponentielt. Etter 7-8 uker etter adenovirus injeksjon, blir blodkar observert koble tumormassen til distale lymfeknuter, med eventuell lymphovascular invasjonen av YFP + tumorceller til de distale axillaris lymfeknuter. Infiltrere leukocyttpopulasjoner er lik de som finnes i humane brystcarcinomer, inkludert tilstedeværelsen av αβ og γδ T-celler, makrofager og MDSCs. Denne unike modellen vil lette studiet av cellulære og immunologiske mekanismer som er involvert i latent metastase og uvirksom i tillegg til å være nyttige for å utforme nye immunterapeutiske intervensjoner for å behandle invasiv brystkreft.

Introduction

Brystkreft er den hyppigst forekommende kreftformen hos kvinner over hele verden ^1,2 og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall ^to. Kompleks genetisk ^3,4, histologiske ^5, og kliniske fenotyper ⁶ blir brukt til å karakterisere de forskjellige subtyper av brystkreft og ofte blir brukt som et middel for å forutsi overlevelse. Analyse av en stor kohort av kvinner med brystkreft indikerte at det meste (ca. 80%) av pasienter som døde hadde dukket opp igjen i løpet av 10 år etter fjerning av den primære tumoren ^7.. For et flertall av invasive brystcarsinomer har lymphovascular invasjonen vist seg å være sterkt korrelert til et dårlig resultat og mer aggressiv klinisk sykdomsforløp ^åtte.

På grunn av den genetiske og fenotypiske kompleksiteten av brystkreft, er det ingen dyremodell som sammenfatter hele sykdomsforløpet. Humane brysttumorcellelinjer som har vært hyppigbrukt som xenograft eller ortotopiske ⁿⁱ modeller av invasiv og metastatisk brystkreft i immunmangelfull mus. Selv informative, disse modellene forekommer i fravær av immun trykk, og fordi det er en kryss arter graft, forvrenge effekten av hele tumoren mikromiljøet. Induserbare genetiske mutasjoner drevet av melke spesifikke arrangører som murine brystkjertelvirus (MMTV) og myse surt protein (WAP) har bidratt med en enorm mengde kunnskap om den genetiske natur brystkreft. Imidlertid er vevsspesifikk ekspresjon av disse promotorer kompromittert av deres respons på det endokrine system ^10-16, noe som resulterer i den variable ekspresjon av induserte genetiske mutasjoner som ikke gjenspeiler ekspresjon av onkogener typisk overexpressed i human brystkreft. For å overvinne endokrin kontroll av MMTV drevet uttrykk for onkogener, Moody et al. Generert en betinget, doksycyklin induserbar modell overekspresjon Neu i brystetepitel ^17. Denne modellen er nyttig for deinducing Neu etter tumordannelse å studere regresjon og tilbakefall, men krever konstant doksycyklin administrasjon for konsistent, langsiktig onkogen uttrykk. En omfattende diskusjon av de mange relevante brystsvulst modeller tilgjengelig kan finnes i anmeldelsen av Vargo-Gogola et al. ¹⁰

Vårt mål var å utvikle en musemodell for sporbar brystkreft på en full C57BL / 6 bakgrunn som, etter den permanente induksjon av mutasjons hendelser, modeller dannelsen av en begynnende svulst i nærvær av immun press. Vi innførte en adenovirus uttrykker Cre-recombinase inn i melkegangene av transgene mus som inneholder floxed alleler av TP53, og et oncogent form av K-ras, og YFP. Cre uttrykk ablates TP53, en hyppig mutert gen i mange brystkrefttilfeller ¹⁸ og induserer en onkogene allel av K-ras i tillegg til YFP uttrykk spesifikti melke ductal epitel. Selv om mutasjoner i K-ras er sjeldne i brystkreft, forekommer i bare 6,5% av brystkreftpasienter ^19,20, overekspresjon av oppstrøms kinaser som HER2/neu og EGFR resultat i konstituerende aktivering av Ras signalveien i menneskelige brystkreft svulster ^21-23. Aktivering av Ras signalveien i mange brysttumorcellelinjer er også blitt rapportert ^24,25. Vi vil beskrive oppstart av tumordannelse og teknikken til intraductal injeksjon av en adenovirus uttrykker Cre-recombinase inn kjønnsmodne, jomfrue hunnmus. Denne modellen av brystkreft utvikler utilslørt lesjoner som vokser eksponentielt etter ca 8 uker med treg tumor progresjon, med lymphovascular invasjon og metastasering til aksillær lymfeknute etter 7-8 uker. Fordi disse musene er på en full C57BL / 6 bakgrunn og YFP-uttrykker kreftceller er sporbare i distale lymfeknuter, gir denne modellen et relevant verktøy for å studere cellular og immunologiske mekanismer av latent metastasering og vil bidra til å utvikle nye terapeutiske tilnærminger for behandling av metastatisk brystkreft ductal.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av Wistar Institute Animal Care og bruk komité.

En. Produksjon og vedlikehold av transgene mus

1. Breed LSL-K-ras ^{tm4Tyj 26} og Trp53 ^{tm1Brn 27} (hentet fra NCI musemodeller av menneskelig kreft konsortium på en blandet bakgrunn) til en full C57BL / 6 bakgrunnen ²⁸ ved tilbakekryssing minst 10 generasjoner med C57BL / 6 mus. Å spore tumor metastasering, rase B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor ^{TM1 (EYFP) Cos} / J (LSL-EYFP, hentet fra The Jackson Laboratory på en full C57BL / 6 bakgrunnen) med dobbel transgen LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} mus.
   Merk: Transgenic LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} mus har loxP sider flankerer en transcriptionally forstummet allel av onkogene K-ras og den endogene p53 locus, slik at ved Cre-mediert eksisjon, overekspresjon av en onkogene K-ras mutant og ablasjon av p53 er achieved.
   Merk: LSL-EYFP mus inneholder en stopp kodon flankerer et gen for forbedret gul fluoriserende protein (YFP) at ved Cre-medierte excision resultater i uttrykket av YFP i vev der YFP stopp kassett er skåret.
   1. Breed transgene mus for å få LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} mus eller LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} LSL-EYFP mus for intraductal injeksjoner.
      Merk: Mus er avlet som homozygot for p53 ^{loxP / loxP} og heterozygot for LSL-K-ras ^{G12D / +} fordi mus med en homozygot sletting av K-ras dø i fosterlivet. Bruk naive jomfruelige kvinner i minst seks uker gamle for intraductal injeksjoner.
      Merk: Den primere for genotyping homozygot floxed p53 allel er p53 - T010-fwd (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ') og p53-T011-rev (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'). De produserer en vill type allel på 391 bp og p53 floxed allel på 461 bp ^29,30.
      Merk: De primere å oppdage den mutant form av K-ras er oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ') og oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'). De produserer det muterte bandet oppdaget ved 600bp.
      Merk: For YFP rapportør trippel transgene mus, til primerne detektere ROSA kassetten (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 '), villtype-allelet (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'), og en delt allel (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ") resultere i forsterkningen av bandene på 320 bp for floxed allel og 600 bp for villtype-allelet.

2. Kirurgisk Forberedelse

1. Rene kirurgiske materialer med 75% EtOH og autoklav dem før og etter alle injeksjoner.
2. Utføre kirurgi på en ren ryddig laboratoriebenken i en renovert rom inne i dyret anlegget. Tørk alle overflater, inkludert scenen og ringer av kirurgisk mikroskop med et bredspektret desinfeksjonsmiddel etterfulgt av 75% EtOH.
3. Veie-og anesthetize mus ved intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketamin (80 til 100 mg / kg) og xylazin (8-10 mg / kg) i sterilt saltvann.
4. Forsiktig plassere mus tilbake i burene sine uforstyrret i 5 min mens de går under anestesi. I løpet av denne tiden generere virus utfellinger (se protokoll 3).
5. Verifisere manglende respons på smerte ved tå klemming. Forsiktig dekke øynene til bedøvede mus med veterinær salve for å hindre overdreven hornhinnen tørking.
6. For å hindre hypotermi, plasserer bedøvet mus på en varmepute satt til lav varme under den kirurgiske prosedyren og til de begynner å komme seg.
7. For behandling av smerte, administrere mus meloksikam subkutant på en mg / kg før operasjonen og 24 timer etter.

Tre. Generering av Virus utfellinger

FORSIKTIG: Adenovirus vektorer, selv om de har blitt endret og ikke er i stand til å gjenskape, utgjøre fare forinfeksjon. Håndter adenovirus med forsiktighet. Alt personell skal være tilstrekkelig opplært i henhold til institusjonens retningslinjer for håndtering av BSL2 agenter Etter intraductal injeksjon, kast adenovirus i samsvar med retningslinjer BSL2.

1. Oppbevar adenovirus konsentrerte virus stocks ved -80 ° C frosset i alikvoter av 4 x 10 ⁸ pfu hver, er tilstrekkelig for å injisere 16 dyr med 3 ml av 2,5 x 10 ⁷ pfu adenovirus av partikler.
2. Oppbevar adenovirus alikvotene på tørris til ca 15-20 min før du begynner injeksjoner.
   Merk: Unngå gjentatte fryse tine sykluser, som virustiter synker betraktelig mellom hver syklus.
   Merk: Adenovirus bunnfall dannes ved å modifisere en protokoll som er beskrevet tidligere ^31.
3. Rekonstituer 504 mg av MEM pulver med 50 ml av steril molekylært kvalitetsbestemt vann, supplement med 244 mg natrium-bikarbonat, og et filter i sterile betingelser og oppbevar ved 4 ° C.
   <li> Klargjør kalsiumklorid-løsning ved tilsetning av 1,5 g kalsiumklorid i 50 ml molekyl grad av vann-og filter i sterile betingelser og oppbevar ved 4 ° C.
   1. Bland alikvoter inneholdende 4 x 10 ⁸ pfu adenovirus-Cre med tilstrekkelig 3% sukrose i sterilt vann til et sluttvolum på 10 ml. Legg 34 ml MEM for viruset, og bland forsiktig. Deretter legger 4 ml av CaCl ₂ løsning, bland forsiktig og inkuber ved romtemperatur i 15-20 min.
   2. Butikken adenovirus på tørris til den er klar til å danne bunnfall. Unngå tining av adenovirus og lagring på is eller ved romtemperatur i lengre tid, med mindre bunnfall dannes.
      Merk: Det er også mulig å blande sukrose, MEM-og CaCl ₂ før de operasjoner hvis det ikke er mulig å tine adenovirus aliquot og begynne å lage utfelles umiddelbart etter fjerning fra -80 ° C. Dette delmengde av sukrose, MEM, og kalsium kan lagres på tørris til den er klar til å legge den adenovirus.
      Merk: Virus-partikler er stabile i omtrent 1 time.
   3. Før hver injeksjon, knips forsiktig på røret for å sørge for at viruspartikler er blandet. Utarbeide 3 ml (2,5 x 10 ⁷ PFU) av viruspartikler inn i 10 ml sprøyte og forberede musen for intraductal injeksjon.

4. Intraductal Injeksjon av viruspartikler

1. Forsiktig plassere musen på ryggen på den opplyste scenen av en ren disseksjon mikroskop. Lys på magesiden med en ekstra lyskilde og finn venstre ^4. eller høyre 9 ^th lyskemelkekjertlene av de små hvite flekker av pels (synlige på C57BL / 6 kvinner) rundt hver brystvorte.
2. Gni brystvorten forsiktig med en steril etanol dynket bomull tippet applikator for å fjerne hår fra brystvorten og å sterilisere injeksjonsstedet. Hvis de er vanskelige å finne, forsiktig bruke et tykt lag med en hårfjerningskrem krem ​​eller bruke saks for å avsløre brystvortene. Fjern det keratin plugg, et lag av tette døde hudceller, som dekker brystvorten. Når brystvorten er utsatt, bør keratin pluggen være lett synlig under disseksjon mikroskop.
3. Sikre brystvorten med fine kirurgiske pinsett og dra opp med lys kraft for å fjerne den keratin pluggen.
4. Stabil brystvorten mellom tang.
5. Forsiktig inn nålen mellom tang, kanylerør kanalen kanalen på 90 °. Tast nippelen litt forbi skråkanten av nålen (ikke mer enn 2 mm) for å hindre gjennomtrengning gjennom melke vev og inn i de serøse membraner av den ventrale kroppshulen.
   1. Ikke sett inn nålen for dypt. For å sikre riktig dybde av injeksjon, dra forsiktig nålen opp etter å sette det inn i lumen av kanalen, og trekker brystvorten opp langs kantene av nålen som det er trukket opp.
      Merk: Visualisering av injeksjon er vanskelig, derfor practice for dette trinnet er anbefalt ved bruk av trypan blå.
6. Når nålen er riktig plassert i melkekanalen, frigjøre 3 ml av virusbunnfall (2,5 x 10 ⁷ pfu av adenovirus-Cre) ved forsiktig stuper sprøyten med tommelen på den hånd som holder sprøyten. Den nippel bør lett blåses som væsken tilsettes.

5. Gjenoppretting av Mus

1. Plasser musen tilbake på varmeputen etter injeksjonen til den begynner å komme seg fra anestesi.
2. Når musen er gjenopprettet, legg den tilbake i en ren bur og overvåke for full gjenoppretting og bevegelse.
3. 24 timer etter den intraductal injeksjon, subkutant administrere meloksikam på en mg / kg.

6. Overvåking Tumor Progression

1. Palpere det injiserte melkekjertlene på dag 30 for utvidelse og hevelse.
   1. Monitor tumor progresjon hver 5-7 dager en gang i hoven og forstørret bryst Gland er observert.
2. Mål tumor volumer hver 3-4 dager for svulst vekstkinetikk gang håndgripelig svulster vises (ca 50-60 dager etter adenovirale injeksjon).
3. Avlive mus når tumorvolumet overstiger 10% av kroppsvekten til musene.

Representative Results

Vellykket målretting av bryst ductal treet kan visualiseres ved å fremstille hele monteringer av melkekjertelen som tidligere beskrevet ³² etter injeksjon av trypan blått (for å verifisere riktig injeksjonsteknikk (figur 1A) eller en adenovirus som uttrykker mCherry (for å verifisere riktig virale preparat og infeksjon av duktale epitelceller, Figur 1B).

Figur 1. Intraductal målretting av melkekjertlene ved injeksjon med blå eller adenovirus-mCherry trypan. A) En hel mount, som tidligere rapportert ^32, av melkekjertlene etter injeksjon av melkekjertlene # 4 med trypanblått ble utarbeidet tre hr innlegg injeksjon til visualisere / bekrefte målretting av hele ductaltreet. Bildene er 4X forstørrelse. B) Infeksjon i duktalt epitel med adenovirus ved å injisere 2,5 x 10 ⁷ PFU av adenovirus uttrykke mCherry. Mus ble injisert intraductally, og fire dager etter injeksjon, en hel mount av brystkjertelen var forberedt på å bekrefte viral infeksjon i ductal treet. Bildet er 4X forstørrelse. MG er melkekjertlene, LD er meieri, eller hovedkanal, og TD er terminalen duct. Klikk her for å se større bilde.

Når svulster blir indusert i p53 ^{loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} transgene mus, svulster vil ikke være klart før rundt dag 40 når melkekjertlene blir forstørret og hoven. Det er nødvendig å begynne palpations når dette er observert, overvåking tumorvekst hver 5-7 dager. I våre hender, herding av brystkjertelen forut alltid utbruddet av tumor utvikling. Svulster vil fremgangen sakte i ytterligere to uker. Begynnelsen rundt dag 56, vil tumorer begynne å vokse eksponensielt (figur 2B). På dette punktet, er det viktig å måle kreft volumer hver 3 dager hvis kinetiske studier er ønskelig fordi det vil være liten mus til mus variasjon i tumorprogresjon, noe som er normalt (Tall 2A og 3A). Store abdominaltumor vil fremgå ved dag 80 (figur 2A, 2B og 3A), hvoretter musene skal avlives hvis tumorer overskrider mer enn 10% av sin kroppsvekt. cDNA analyse av tre kloner fra en tumor-bærende mus viste ekspresjon av mesothelin, cytokeratin-8, HER2/neu og østrogen reseptor-α (figur 2C).

> Figur 2. Tumor utvikling i p53 ^{loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} mus injisert intraductally med adenovirus-Cre. A) To eksempler på svulster 80 dager etter injeksjon med adenovirus uttrykker Cre. Mus ble gitt 2,5 x 10 ⁷ PFU av adenovirus som uttrykker Cre og 80 dager etter tumor-initiering, kan store opplagte masser bli visualisert som stikker ut fra abdominal side av dyret. B) Typisk tumorkinetikk og palpasjon plan for svulster indusert i p53 ^{loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} mus. C) Karakterisering av tre tumorcellekloner som stammer fra samme homogenisert svulst av en p53 ^{loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} mus. RNA ble ekstrahert og cDNA syntetisert for RT-PCR-analyse ved bruk av primere som er spesifikke for β-aktin, mesothelin, cytokeratin-8, HER2/neu, progesteron-reseptoren, østrogenreseptor-α og østrogenreseptor-β.tps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

I likhet med det cellulære mikromiljø på human brystkreft, har vi observert infiltrasjon av αβ og γδ T-celler, så vel som myeloide avledet suppressor-celler og makrofager i de tumorer (figur 4). Blodkar drenering til aksillær lymfeknute vil begynne å engorge før svulster har vokst til å omfatte hele melke vev der injeksjonen ble utført (figur 3A). Lymphovascular invasjon og metastasering av kreftceller kan spores ved å krysse LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} mus med LSL-EYFP mus. Etter at Cre-formidlet eksisjon, er tumorceller som uttrykker YFP (både høy-og lav) oppdaget i tumoren, og kan spores metastasering til drenering aksillær lymfeknute (figur 3B). Metastaser til den distale aksillær lymfeknute ble bekreftetved vellykket dyrkning en svulst cellelinje fra dette nettstedet i en svulst bærende LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} mus (data ikke vist).

Figur 3. Dannelse av svulster og latent metastaser til aksillær lymfeknute. A) Eksempel på tre avanserte brystkreft svulster med forskjellige priser av tumor progresjon. En fast masse, angitt ved pilspiss, former og til slutt vokser med størrelsen av hele mage mammary vev. Svulsten forblir begrenset til melke vev og er ikke observert å invadere eller feste til muskelen som dekker i bukhulen. Det er tydelig brystspreng av den overfladiske epigastriet såre mellom inguinal og axillaris lymfeknuter, merket med hvite pilspisser. Etter 7-8 uker, the aksillær lymfeknute begynner å bli utvidet på grunn av lymphovascular invasjon av tumorcellene, som angis med pilen. B) metastasering av YFP positive tumorceller kan visualiseres i aksillære lymfeknute ved strømningscytometri. LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} LSL-EYFP mus ble brukt til å fremkalle svulster og aktivering av YFP etter intraductal levering av adenovirus-Cre. For å verifisere lymphovascular invasjon av tumorceller inn i det aksillære lymfeknute, 80 dager etter adenoviral injeksjon, ble de indikerte lymfeknuter og organer fjernet og farget for lymfocytt-markører og kontrollert for YFP ekspresjon. CL representerer kontralateral nontumor drenering lymfeknute. Resultatene representerer avgrensning på CD45 negative tumorceller, noe som viser tumorcellene invaderer den distale aksillære lymfeknute. Tallene representerer prosent YFP positive celler fra total befolkning. Klikk her for å vise largeh image.

Figur 4 Immune infiltrerer i mus transgene brystsvulster.. Musebrystsvulster ble homogenisert og farget for CD45, CD3, γδTCR, CD11b og GR1. Tallene viser prosent av positive leukocytter i hele tumor (63.5), total CD3 ⁺ (46,7), total CD3 negative (40.1), total CD3 ⁺ γδ ⁺ (γδ T-celler, 13), CD3 ⁺ γδnegative (24), i alt GR1 høy CD11b (MDSC, 28,6) og totalt CD11b GR1 lave (makrofager, 18,5). Klikk her for å se større bilde.

På grunn av anatomien i musen og teknikk av intraductal injeksjoner, finner vi målretting of melkekjertlene 4 og 9 (figur 5) gir de mest konsistente resultater og pålitelig injeksjoner. Imidlertid kan en hvilken som helst kjertel være målrettet avhengig av preferanse for teknikeren å utføre operasjonen.

Figur 5. Nummerering av melkegangene. Bryst kanaler 4 og 9 er uthevet i rødt på diagrammet og indikert med piler på musen. I våre hender, vi fant ut at injeksjoner var lettest å utføre på disse melkegangene, men alle andre melke vev som vi målrettet utviklet svulster med liknende kinetikk. Klikk her for å se større bilde.

Discussion

Suksessen til denne prosedyren er avhengig av riktig teknikk under intraductal injeksjoner, noe som vil være vanskelig for utrente forskere. Erfarne forskere i vårt laboratorium vanligvis få bryst tumor masser 79% av tiden de administrerer adenovirale injeksjoner. Problemer med injeksjon kan føre til vesentlige forsinkelser, variabel, eller fraværende tumor utvikling. Hvis nålen er satt inn for dypt eller på en upassende vinkel, kan det ductal kanalen bli savnet. Det er viktig å legge inn nippelen litt forbi skråkanten av nålen (ikke mer enn 2 mm), for å hindre gjennomtrengning gjennom melke vev og inn i de serøse membraner av den ventrale kroppshulen. Dessuten kan for grunt plassering av nålen, eller injeksjon av større enn 3 ml av virusbunnfall medføre søl av viral prep utenfor melkekjertelen, og induksjon av utilsiktede tumorer. En måte å løse disse problemene er å sette nålen inn i brystvorten litt deeper enn 3 mm, og langsomt å trekke sprøyten tilbake opp og ut av kanalen til 2 mm fra spissen av den koniske. Dette vil sikre at brystvevet er rettet i stedet for muskelen som omgir bukhulen til mus (figur 1A). Dette vil også strekke nippelen langs kantene av sprøyten, slik at når viruset er utvist inn i kanalen, er det ingen utslipp og tap av virale bunnfall.

Visualisering av injeksjonen er vanskelig og praksis for dette trinnet er anbefalt. Vi har observert en økning i vellykkede injeksjoner etter praksis, noe som resulterer i en høyere pene av tumorutvikling. Fordi denne teknikken bruker nonlactating jomfrue kvinner, er det viktig å fjerne det keratin pluggen dekker nippelen for å avdekke den underliggende kanal kanalen. Det anbefales å praktisere dette trinnet ved å injisere trypan blå eller et annet sterilt sporbare fargestoff på innsiden av kanalen og forbereder hele mammary monteringer for å bekrefte målretting av ductal tree. I tillegg har andre protokoller som beskriver intraductal injeksjon av reagenser som er publisert ^33,34, som kan være nyttig for å utvikle passende teknikk. Problemer med viral forberedelse eller infeksjon i duktale lumen kan også bli undersøkt ved hjelp av en mCherry uttrykke adenovirus. Nontransgenic musene kan anvendes for hvert av disse formål inntil injeksjonsteknikken er optimalisert.

Selv om noen melkekjertlene kan brukes til å initiere svulster, har vi oppnådd de mest konsekvente vekstrater ved å målrette melkekjertlene fire eller ni, som vi tror er fordi det er lettere å utføre riktige injeksjoner på disse kjertlene, noe som resulterer i mer effektiv målretting av kanal. Nærheten til venstre ^4. eller høyre 9 ^th lyskemelkekjertlene til drenering lyske lymfeknute er også nyttig å undersøke anti-tumor immunresponser under ulike time poeng av tumor progresjon. For å modellere og spore latent metastaser til distale områder, transgenic mus ble krysset med LSL-EYFP mus. Ettersom tumor skrider frem, vil vaskulaturen forbinder tumor til armhulen lymfeknute blitt litt engorged på omtrent 5 uker, før tumoren begynner å vokse eksponensielt (figur 3A). Til slutt, etter 7-8 uker, vil lymphovascular invasjon resultere i tumorvekst i aksillære lymfeknute (figurene 3A og 3B). Bruke reporter mus og Cre-loxP teknologi, skaper inkorporering av YFP en plattform for å spore kreftceller metastasizing til distale områder i hele tumor progresjon. Dette kan legge til rette for studier med sikte på å belyse de cellulære og epigenetiske mekanismer som fremmer latent metastasering. I våre hender, bryst tumor cellelinjer uttrykt cytokeratin-8, mesothelin, østrogen reseptor-α, og HER2/neu, bekrefter målretting av duktalt epitel. Imidlertid, avhengig av de mutasjoner som er indusert og på grunn av vanskeligheten og variabiliteten av injeksjoner, anbefalesHistologisk karakterisering av tumorer Når modellen er veletablert i laboratoriet.

Fordi brystkreft er en dødelig og utbredte sykdom ^1,2, er det viktig å bruke dyremodeller som nøyaktig rekapitulere det komplekse samspillet mellom tumor og vert. Her beskriver vi et fullt backcrossed C57BL / 6 murine modell av brystsvulst. Først ved å fremkalle svulster fra innfødte celler, tillater vi svulsten til å utvikle seg naturlig i en full immunmikromiljøet. Immunmikromiljøet i de avanserte musebrystsvulster sammenfatter de populasjoner av αβ og γδ T-celler, myeloide avledet suppressor-celler og makrofager som vanligvis observeres i human brystkreft (figur 4). Som vi har publisert tidligere ved hjelp av adenovirus-Cre å indusere ovarietumorer, fant vi at viral injeksjon hadde ubetydelig effekt på de tilsvarende svulst infiltrater og tumorprogresjon ^28. For det andre endokrine uavhengigekspresjon av onkogener sikrer at tumorcellene har vedvarende høye nivåer av target genekspresjon. Tredje, ved å dra nytte av latente mutasjoner, kan vi kontrollere tidspunktet for tumorigenesis å lette presis tidsmessige sporing av svulst evolusjon. Anvendelser av denne modellen inkluderer forskning på tumorcellebiologi, studier av faktorer i mikromiljøet tumor, anti-tumor immunrespons, og til og med effekt evaluering av nye terapeutiske midler. Gjennom tilgjengeligheten av Cre-loxP system, kan denne teknikken brukes som en plattform for å undersøke et variert utvalg av tilleggs mutasjoner i initiering og progresjon av brystsvulster. Vi ønsker at bruk av denne modellen vil øke forståelsen av brystkreft biologi og til slutt lede til nye terapeutiske midler som tar sikte på behandling av metastatisk brystkreft.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trp53tm1Brn Transgenic mice K-rastm4Tyj Transgenic mice	Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium		Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1- Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice	Jackson Labs	006148
Primers p53loxP/loxP	Integrated DNA Technologies		5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-rasG12D/+	Integrated DNA Technologies		5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter	Integrated DNA Technologies		5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of Mesothelin expression	Integrated DNA Technologies		5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of Progesterone Receptor expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of Erbb2 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of B-Actin expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-Cre	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVCre	Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Adenovirus-mCherry	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVmCherry	Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Hamilton syringe	Hamilton company	701RN	10 μl syringe, RN series. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle	Hamilton company	7803-05	33 G 0.5 in long RN needle, with a 12° bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps	Dumont	52100-58	Dumostar No. 5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder	Cellgro	50 012 PB	Store at 4 °C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate	Fisher	S233	Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride	Sigma	C4901	Minimum 96%, anhydrous