Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

2D و 3D كروموسوم اللوحة في البعوض الملاريا

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/51173
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Entomology, Virginia Tech

Summary

الكروموسوم اللوحة هي طريقة مفيدة لدراسة تنظيم نواة الخلية وتطور karyotype. هنا، نظهر نهجا لعزل وتضخيم مناطق محددة ذات أهمية من كروموسومات البوليتين المفردة التي تستخدم لاحقا للفلورسنت ثنائي وثلاثي الأبعاد في التهجين الموقعي (FISH).

Abstract

الفلورسنت في التهجين الموقعي (FISH) من مسابير كروموسوم الذراع كله هو تقنية قوية لرسم خرائط المناطق الجينومية ذات الاهتمام، والكشف عن إعادة ترتيب الكروموسومات، ودراسة تنظيم ثلاثي الأبعاد (3D) من الكروموسومات في نواة الخلية. ظهور الليزر التقاط الالتصيع الدقيق (LCM) وتضخيم الجينوم كله (WGA) يسمح بالحصول على كميات كبيرة من الحمض النووي من خلايا واحدة. دفعتنا الحساسية المتزايدة لمجموعات WGA إلى تطوير دهانات الكروموسوم واستخدامها لاستكشاف تنظيم الكروموسوم وتطوره في الكائنات غير النموذجية. هنا، نقدم طريقة بسيطة لعزل وتضخيم شرائح euchromatic من الأسلحة كروموسوم البوليتين واحد من خلايا ممرضة المبيض من البعوض الملاريا الأفريقية Anopheles غامبيا. يوفر هذا الإجراء منصة فعالة للحصول على دهانات الكروموسوم ، مع تقليل الخطر العام لإدخال الحمض النووي الأجنبي إلى العينة. استخدام WGA يسمح لعدة جولات من إعادة تضخيم، مما أدى إلى كميات عالية من الحمض النووي التي يمكن استخدامها لتجارب متعددة، بما في ذلك 2D و 3D FISH. أثبتنا أن الدهانات الكروموسومية المطورة يمكن استخدامها بنجاح لإنشاء المراسلات بين الأجزاء euchromatic من أذرع الكروموسوم البوليتين والميتوتيك في An. gambiae. بشكل عام ، يوفر اتحاد LCM و WGA أحادي الكروموسوم أداة فعالة لإنشاء كميات كبيرة من الحمض النووي المستهدف للدراسات الجينية الخلوية والجينومية المستقبلية.

Introduction

الكروموسوم اللوحة هي تقنية مفيدة لدراسة تطور karyotypes 1-5 وتصور التشوهات الوراثية الخلوية عن طريق التهجين من الحمض النووي الصبغي المسمى فلوريا 1،6-8. يتم تطبيق هذه الطريقة أيضا على دراسة الديناميات ثلاثية الأبعاد لأقاليم الكروموسوم في التنمية 9 وعلم الأمراض 10. وتستخدم الدهانات الكروموسومية المسماة بشكل تفاضلي لتصور الفردية mitotic 11،12، meiotic 13،14، أو interphase غير البوليتين 15،16 وpolytene 9،11،17 الكروموسومات. ومن شأن وجود بروتوكول بسيط وقوي للحصول على دهانات الكروموسومات أن يكون مفيدا جدا في توسيع نطاق هذه التقنية لتشمل الكائنات الحية غير النموذجية، مثل البعوض. مجمع أنوفيليس غامبيا هو مجموعة من سبعة بعوض لا يمكن تمييزه من الناحية الشكلية يختلف في السلوك والتكيف، بما في ذلك القدرة على نقل الملاريا.  هذه البعوض بمثابة نموذج ممتاز لفهم أفضل لتطور الأنواع ذات الصلة الوثيقة التي تختلف اختلافا كبيرا في قدرتها ناقلات.  وقد أجريت معظم الدراسات الجينية الخلوية في بعوض الملاريا باستخدام كروموسومات متطورة وعالية تعدد الأضلاع (تمت مراجعتها في 18،19). سمحت أنماط الربط القابلة للقراءة لكروموسومات البوليتين للباحثين بإظهار الارتباط بين التقلبات المتعددة الأشكال والتكيفات البيئية في Anopheles gambiae 20. أيضا، وقد تم وصف الأنسجة محددة 21 والأنواع محددة 22 ملامح منظمة كروموسوم البوليتين 3D في مجمع An. macullipennis. ومع ذلك، يمكن أن توفر دراسة الكروموسومات ميتوتيك معلومات هامة إضافية. على سبيل المثال، ارتبط مستوى أعلى من تعدد الأشكال التريلوكروماتين لوحظ في الكروموسومات ميتوتيك مع انخفاض نشاط التزاوج والخصوبة في An. gambiae 23. قد يكون من الصعب تحديد المراسلات بين الأجزاء euchromatic من أذرع الكروموسومات المتعددة والميتوتيك فقط من خلال مقارنة أطوالها النسبية. وذلك لأن هيتيركروماتين تشكل جزءا كبيرا من الكروموسومات ميتوتيك, ولكن ممثلة تمثيلا ناقصا في الكروموسومات البوليتين 24. ومن شأن توافر الدهانات الكروموسومية لطاعوض الملاريا أن يسمح للباحثين بتوسيع الدراسات الجينية الخلوية بشكل كبير من خلال إدراج أنواع إضافية، مع تقليل التكلفة والوقت بشكل كبير في تحليلات تطور karyotypic والديناميات ثلاثية الأبعاد للكروموسومات في هذه المجموعة من الحشرات المهمة وبائيا.

من أجل الحصول على مساحات كبيرة من الكروموسومات ، أصبح الالتصاط الدقيق تقنية متكاملة للتلاعب وعزل مناطق محددة ذات أهمية للمكمل الكروموسومي.  عندما يقترن تضخيم الجينوم كله (WGA)، يؤدي التشحم الدقيق في تطبيقات المصب قوية بما في ذلك FISH 11،12 وتسلسل الجينوم الجيل القادم 25-27. في السابق ، كانت التقنية تتطلب استخدام إبر التشتيت الدقيق المتخصصة التي كان لا بد من التحكم فيها يدويا من قبل مستخدم متمرس 28.  أدى تقدم الالتصيع الدقيق لالتقاط الليزر (LCM) إلى أداة مبسطة أكثر ملاءمة لعزل الخلايا المفردة 29أو30 أو الكروموسومات الفردية 31-33 مع تقليل خطر التلوث. هذا النهج يسمح للمستخدم لدراسة التغايريات الوراثية والتشوهات الكروموسومية التي تحدث في خلايا واحدة، بدلا من المناظر الطبيعية توافق الآراء التي تنتج عن تجميع خلايا متعددة معا 34-36. وقد استخدمت أساليب متعددة لتضخيم الحمض النووي المنتجة من التشتيت الدقيق.  DOP-PCR، وهي تقنية مفيدة لتضخيم تسلسل متكررة للغاية، وقد استخدمت لتضخيم الكروموسومات microdissected من الأنواع بما في ذلك جندب 37،ثعبان البحر الشوكي 38،والبلطي النيل 39.  في الآونة الأخيرة ، أصبحت مجموعة GenomePlex WGA4 أحادية الخلية القائمة على PCR والتضخيم المتعدد القائم على الإزاحة (MDA) Repli-G Single Cell أدوات قيمة للتجارب التي تنطوي على التحليل الجيني للخلايا البشرية الفردية وكذلك الكروموسومات40-42، بما في ذلك أنظمة الكروموسوم B في الجنادب 37 والجراد 43. هذه المجموعات اثنين من كل مزايا وعيوب، ولكن تفوقهم الواضح فوق غيرها من أنظمة التضخيم المتاحة وقد ثبت 44.

كمية الحمض النووي التي يمكن الحصول عليها من كروموسوم واحد أو جزء كروموسوم أقل بكثير من تلك الموجودة في نواة كاملة. ولذلك فإن التجسيد الدقيق والتضخيم والتحليل اللاحق لكروموسوم واحد أكثر تحديا بكثير ، خاصة في الكائنات الحية ذات الجينوم الصغير كما هو الحال في Drosophila أو Anopheles.  على الرغم من أن الدهانات قد تم تطويرها من كروموسومات صغيرة واحدة للإنسان 33 و دبور 45، فإن تجربة FISH الناجحة تتطلب عدة (على الأقل 10-15) كروموسومات ميتوتيك مبتزة صغيرة لذبابة الفاكهة 11. ومع ذلك، فإن القدرة على microdissect وتضخيم كروموسوم واحد سيكون من المهم ل(1) الحد من فرصة التلوث مع المواد من كروموسوم مختلف، (2) التقليل من عدد الاستعدادات الكروموسومية اللازمة للانصاع المجهري، (3) خفض النيوكليوتيدات والتعددية الهيكلية للعينة المشقوقة في كل من FISH وتسلسل تطبيقات المصب. الكروموسومات البوليتين وجدت في العديد من الأنواع Dipteran توفر فرصة فريدة من نوعها للحصول على كمية أعلى بكثير بدءا من الحمض النووي. كما أنها توفر دقة أعلى وبنية كروموسوم لا يمكن تحقيقها من خلال استخدام الكروموسومات الميتوتيكية. يمكن أن تكون هذه الدقة المضافة حاسمة في تصور إعادة ترتيب الكروموسومات ، وهيكل الكروماتين ، وشرائح الكروموسومات ليتم تقسيمها 28،46.

هنا نقدم إجراء لعزل بكفاءة شريحة euchromatic من ذراع كروموسوم متعدد التين واحد، تضخيم الحمض النووي، واستخدامه في تطبيقات FISH المصب في البعوض الملاريا.  أولا، نحن نطبق LCM لعزل واستخراج ذراع كروموسوم واحد من الشرائح الغشاء المعدة خصيصا. ثانيا، يستخدم WGA لتضخيم الحمض النووي من المواد المجهرية. ثالثا، نحن تهجين الحمض النووي تضخيمها في تجارب FISH لمستحضرات الاسكواش البوليتين 47،ميتافيزي والشرائح الكروموسوم بين المراحل 48،فضلا عن عينات جبل المبيض 3D كله. وقد تم هذا الإجراء لرسم بنجاح غالبية euchromatin في أذرع الكروموسومات من An. غامبيا .

Protocol

1) بوليتين كروموسوم إعداد الشريحة لالتقاط الليزر microdissection

  1. تشريح الإناث Anopheles نصف gravid في 25 ساعة بعد تغذية الدم. إصلاح المبيضين من حوالي خمس إناث إلى 500 ميكرولتر من محلول كارنوي المعدل الطازج (100٪ الميثانول: حمض الخليك الجليدي، 3:1) في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. نقل المبيضين إلى -20 درجة مئوية لتخزين طويل الأجل.
  2. إعداد حل Carnoy (الإيثانول 100٪: حمض الخليك الجليدي، 3:1) وحمض البروبيونيك 50٪ قبل إجراء الشرائح الكروموسومية.
  3. ضع زوجا واحدا من المبيضين في قطرة واحدة من محلول Carnoy على شريحة غشاء ZEISS 1.0 PET. اعتمادا على الحجم، تقسيم المبيضين إلى ما يقرب من 2-4 أقسام مع تشريح الإبر ووضعها في قطرة من حمض البروبيونيك 50٪ على الشرائح النظيفة تحت المجهر تشريح.
  4. فصل بصيلات وإزالة الأنسجة المتبقية باستخدام منشفة ورقية تحت مجسم تشريح. إضافة قطرة جديدة من حمض البروبيونيك 50٪ إلى بصيلات والسماح لهم بالجلوس لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. ضع غطاء سيليكوني فوق القطيرات. دع الشريحة تقف لمدة دقيقة واحدة تقريبا.
  6. قم بتغطية الشريحة بمادة ماصة (يستخدم ورق التصفية لهذه الطريقة) ، وأثناء استخدام جانب الممحاة من قلم رصاص ، قم بتطبيق كمية سخية من الضغط على الغطاء عن طريق النقر عليه مرارا وتكرارا باستخدام الممحاة.
  7. سخني الشريحة إلى 60 درجة مئوية على نظام تشبع/تهجين الشريحة لمدة 15-20 دقيقة للمساعدة في تسطيح كروموسومات البوليتين. ضع الشرائح في غرفة رطبة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها للسماح للحمض بتسطيح الكروموسومات بشكل أكبر.
  8. وضع الشرائح في الإيثانول الباردة 50٪ لمدة 10 دقيقة. إزالة بلطف coverslip، واستبدال في الإيثانول الباردة 50٪ لمدة 10 دقيقة أخرى.
  9. الشرائح المجففة في 70٪، 90٪، 100٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما. الهواء الجاف الشرائح.
  10. إعداد حل من محلول العازلة GURR بإضافة قرص عازلة واحدة إلى 1 لتر من الماء المقطر. "أوتوكلاف"
  11. إعداد الحل Giemsa بإضافة 1 مل من حل تلطيخ Giemsa إلى 50 مل من العازلة GURR.
  12. وضع الشرائح المجففة الهواء في حل Giemsa لمدة 10 دقيقة ويغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X. الهواء الجاف الشرائح مرة أخرى في مناخ معقم تسيطر عليها لتجنب التلوث.

2) ليزر التقاط الالتصاع الدقيق لذراع كروموسوم البوليتين واحد

هذا القسم تفاصيل استخدام برنامج بالمروبو، الذي يأتي مع نظام بالم مايكروبيم ليزر Microdissection.

  1. تنظيف المجهر مع الإيثانول 100٪. تعقيم القفازات والأنابيب مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية في وصلة عرضية للأشعة فوق البنفسجية.
  2. قم بتشغيل مجهر التشبيك المجهري ليزر PALM MicroBeam تشغيل الليزر. افتح مجموعة تشريح الليزر، PALMRobo، و قم بتكوين إعدادات "الطاقة" و "التركيز" حسب الضرورة.
  3. البحث عن ذراع كروموسوم البوليتين من الفائدة.
  4. باستخدام أداة "قلم رصاص"، حدد المنطقة المحددة.
  5. افتح "نافذة العناصر" من شريط القوائم.
  6. حدد "العنصر المرسوم"، وتأكد من تحديد "قص".
  7. تثبيت أنبوب غطاء لاصق في حامل ومكان فوق الشريحة، وترك فجوة صغيرة <1 ملم في الحجم، وبدء قطع الليزر.
  8. ضع "اختيار المنجنيق" داخل موقع القطع ، تاركا مساحة بين الحافة والكروموسوم.
  9. حدد "LPC" من الخيار المنسدل وابدأ في القذف.
  10. تحقق للتأكد من أن العينة تم قذفها إلى الغطاء عن طريق الضغط على رمز "العين".

3) تنقية الحمض النووي من ذراع كروموسوم متعدد التخصصات واحد ميكروديسكت

اتبع تعليمات مجموعة المعدات الدقيقة للحمض النووي QIAamp لإطلاق وتنقية الحمض النووي الذي تم جمعه. تم تعديل الخطوة 3.1 لاستيعاب أنبوب مقلوب.

  1. أضف 15 ميكرولتر من ATL العازلة و 10 ميكرولتر بروتيناز K إلى الأنبوب المقلوب (داخل الغطاء) واحتضنه عند 56 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  2. إضافة 25 ميكرولتر من العازلة ATL، 50 ميكرولتر العازلة AL، و 1 ميكرولتر الناقل RNA؛ مزيج. إضافة 50 ميكرولتر 100٪ EtOH؛ خلط.
  3. نقل lysate إلى عمود QIAamp; الطرد المركزي. غسل بإضافة 500 ميكرولتر العازلة AW1; الطرد المركزي. ضع العمود في أنبوب جمع جديد، إضافة 500 ميكرولتر العازلة AW2؛ الطرد المركزي. ضع العمود في أنبوب جديد؛ الطرد المركزي لإزالة السائل الزائد.
  4. ضع عمودا في أنبوب 1.5 ميكرولتر من أجهزة الطرد المركزي وأضف 20 ميكرولتر من الماء إلى elute؛ الطرد المركزي.
  5. تتبخر الحمض النووي الطازج وصولا الى حجم النهائي من 9 ميكرولتر باستخدام فراغ.

4) تضخيم الحمض النووي من ذراع كروموسوم البوليتين واحد microdissected

تم استخدام بروتوكولين مختلفين لWGA من ذراع كروموسوم واحد.

  1. تضخيم الحمض النووي وإعداد التحقيق عبر جينومبلس WGA
    1. اتبع بروتوكول GenomePlex خلية واحدة WGA4 كيت لإنتاج الدفعة الأولى من الحمض النووي تضخيمها:
      1. إضافة محلول البروتين K الطازج إلى عينة 9 ميكرولتر؛ مزيج. احتضان الحمض النووي في 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم الحرارة إلى 99 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. ابق على الجليد.
      2. إضافة 2 ميكرولتر 1X مخزن إعداد مكتبة الخلية المفردة و1 ميكرولتر من حل تثبيت المكتبة؛ مزيج. عينة الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. بارد على الجليد والطرد المركزي.
      3. إضافة 1 ميكرولتر من إنزيم إعداد المكتبة. مزيج والطرد المركزي. حضانة على النحو التالي:
        Equation 1
      4. إضافة 7.5 ميكرولتر 10X التضخيم ماجستير ميكس، 48.5 ميكرولتر من الماء. 5.0 ميكرولتر WGA الحمض النووي بوليمراز; مزيج والطرد المركزي.
      5. دورة حرارية على النحو التالي:
        Equation 2
    2. تنقية الحمض النووي باستخدام الحمض النووي الجينومي نظيفة وكيت المكثف. البروتوكول كما يلي:
      1. إضافة 5:1 الحمض النووي ربط المخزن المؤقت: عينة الحمض النووي (خصيصا للحمض النووي الجينومي أقل من 2 كيلوبايت. إذا كان حجم عينة الحمض النووي أكبر من 2 كيلوبايت، استخدم نسبة 2:1) ثم قم بالتحويل إلى عمود الدوران المقدم. الطرد المركزي.
      2. إضافة 200 ميكرولتر الحمض النووي غسل العازلة والطرد المركزي. كرر خطوة الغسيل. ثم، إضافة 50 ميكرولتر من الماء وelute الحمض النووي في أنبوب 1.5 مل جديدة.
    3. إعادة تضخيم عينة الحمض النووي باستخدام مجموعة إعادة التضخيم GenomePlex WGA3 على النحو التالي:
      1. إضافة 10 ميكرولتر الحمض النووي إلى أنبوب PCR (مجموعة توصي 10 نانوغرام مجموع الحمض النووي) مع 49.5 ميكرولتر من الماء، 7.5 ميكرولتر 10x التضخيم ماجستير ميكس، 3.0 ميكرولتر 10 M M DNTP مزيج، و 5.0 ميكرولتر WGA DNA Polymerase. مزيج وأجهزة الطرد المركزي.
      2. استخدم الملف الشخصي التالي لرد الفعل:
        Equation 3
      3. تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
    4. تسمية الحمض النووي ل FISH باستخدام GenomePlex WGA3 إعادة التضخيم كيت على النحو التالي:
      1. إنشاء مزيج رئيسي من GenomePlex WGA3 إعادة التضخيم كيت بإضافة 10 ميكرولتر الحمض النووي إلى أنبوب PCR مع 49.5 ميكرولتر من الماء، 7.5 ميكرولتر 10X التضخيم ماجستير ميكس، 3.0 ميكرولتر 1 mM dNTP مزيج (1 mM من dATP، dCTP، dGTP، 0.3 ميكرولتر 1 mM dTTP - إذا باستخدام dUTP المسمى)، 1 ميكرولتر من 25 nM المسمى dUTPP ، و5.0 ميكرولتر WGA DNA بوليمراز.
      2. استخدم الملف الشخصي التالي لرد الفعل:
        Equation 3
      3. الايثانول يعجل التحقيق المسمى بإضافة 1/10 حجم التفاعل النهائي (7.5 ميكرولتر ل 75 ميكرولتر رد فعل) من 3 M خلات الصوديوم درجة الحموضة 5.2 و 2-3 أحجام الإيثانول 100٪. عينة الحمض النووي البرد في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      4. عينة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإنشاء بيليه المسمى وإزالة الكريات الفائقة والهواء الجاف.
      5. إنشاء المخزن المؤقت للتهجين كما يلي:
        0.2 غرام من كبريتات ديكتران
        1200 ميكرولتر من فورماميد الديون
        580 ميكرولتر H2O
        120 ميكرولتر 20X SSC
      6. إضافة 40 ميكرولتر من العازلة التهجين إلى بيليه الهواء المجفف.
  2. تضخيم الحمض النووي وإعداد التحقيق عن طريق REPLI-G خلية واحدة WGA تليها الترجمة
    1. اتبع REPLI-g خلية واحدة WGA كيت بروتوكول لإنتاج الحمض النووي تضخيم:
      1. إعداد المخزن المؤقت D2 (3 ميكرولتر من 1 M DTT + 33 ميكرولتر المخزن المؤقت DLB).
      2. مزيج 4 ميكرولتر من المواد المنقى microdissected مع 3 ميكرولتر العازلة D2. نفض الغبار أنبوب لخلط. حضانة لمدة 10 دقيقة في 65 درجة مئوية. إضافة 3 ميكرولتر من حل الإيقاف؛ خلط.
      3. إضافة 9 ميكرولتر H2O، 29 ميكرولتر REPLI-g رد فعل العازلة، و 2 ميكرولتر من REPLI-g DNA بوليمراز إلى العينة. حضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 8 ساعات. تعطيل بوليمرات الحمض النووي عن طريق التدفئة إلى 65 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
    2. اتبع بروتوكول ترجمة لتسمية REPLI-g تضخيم الحمض النووي:
      1. إعداد مزيج وضع العلامات التالية:
        1 ميكروغرام من الحمض النووي المضخم
        5 ميكرولتر 10X الحمض النووي بوليمراز العازلة
        5 ميكرولتر 10X dNTP
        5 ميكرولتر 1X BSA
        1 ميكرولتر 1 mM المسمى dNTP
        4 ميكرولتر 1 U/μl DNase I
        1 ميكرولتر 10 U/μl الحمض النووي بوليمراز I
        H2O إلى 50 ميكرولتر
      2. حضانة عند 15 درجة مئوية لمدة ساعتين. إضافة 2 ميكرولتر من 0.5 M EDTA لوقف رد الفعل. تحقق من حجم جزء الحمض النووي عن طريق تشغيل على هلام.
      3. اتبع الخطوات من 4.1.4.3-4.1.4.6 لتسريع وslubilize بيليه.

5) 2D FISH على بوليتين وميتوتيك الكروموسوم الاسكواش الاستعدادات

يرجى الرجوع إلى بروتوكولات مفصلة لفيش على الاستعدادات من الاسكواش البوليتين 47 والشرائح الكروموسوم ميتوتيك 48. هنا نقدم بروتوكولات موجزة.

  1. FISH على مستحضرات الاسكواش كروموسوم البوليتين
    1. تزج الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 20 دقيقة في الشرائح RT. إصلاح في 4٪ Paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 1 دقيقة.
    2. الشرائح المجففة من خلال يغسل الإيثانول: 50٪، 70٪، 90٪، 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما في الشرائح RT. الهواء الجاف.
    3. قبل الحرب المسبار في التهجين العازلة في 37 درجة مئوية. إضافة 10-20 ميكرولتر من المسبار إلى الشريحة. تغطية مع 22 × 22 مم coverslip. اضغط على أي فقاعات الهواء باستخدام طرف ماصة.
    4. الكروموسومات الناسخة والتحقيق في 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حواف الختم من غطاء مع الاسمنت المطاطي. نقل الشريحة إلى غرفة رطبة واحتضان في 39 °C بين عشية وضحاها.
    5. اغسل الشرائح مع 1X SSC عند 39 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اغسل الشرائح باستخدام 1X SSC في RT لمدة 20 دقيقة. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X، ثم إضافة إطالة المضادة للتلاشي مع DAPI. تغطية مع coverslip، وتخزينها في مربع الشريحة في 4 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل قبل التصور.
  2. FISH على الاستعدادات الاسكواش كروموسوم ميتوتيك
    1. استخراج الكروموسومات ميتوتيك من أقراص التصوير من 4th اليرقة نجمة من An. غامبيا.
    2. إعداد الشرائح الكروموسوم مناسبة لفيش.
    3. إضافة 2-3 ميكرولتر من مسبار الحمض النووي المسمى إلى المخزن المؤقت التهجين في أنبوب وتخلط بلطف عن طريق pipetting.
    4. تطبيق 10 ميكرولتر من خليط التحقيق على الشريحة وتغطية مع 22 × 22 مم coverslip. اضغط على أي فقاعات الهواء باستخدام طرف ماصة.
    5. لاحتواء وكشف، تطبيق إطالة المضادة للتلاشي مع DAPI لإعداد والحفاظ في الظلام لمدة ساعة على الأقل قبل التصور.

6) 3D FISH على كامل جبل أنسجة المبيض

  1. تحضير المخزن المؤقت A المزيج التالي:
    60 مليون كيلو متر كل عام
    15 مليون م كلوريد NaCl
    0.5 مليون من الحيوانات المنوية
    0.15 مليون من الحيوانات المنوية
    2 مليون EDTA
    0.5 مليون م EGTA
    أنابيب 15 mM
  2. إعداد الشرائح للتصور النووي عن طريق إضافة طبقة nailpolish في نمط مربع لتتناسب مع حجم coverlips. وهذا يخلق سطح مرتفع لمنع سحق النوى عند وضعها على غطاء في المستقبل.
  3. تشريح المبيضين الطازجة من المرحلة كريستوفر 3 الإناث والحفاظ على حل من 150-250 ميكرولتر العازلة A مع 0.5٪ digitonin. تشغيل أكبر إبرة تشريح على بصيلات (في أنبوب مع العازلة A مع 0.5٪ digitonin) لتدمير الغشاء الجريبي.
  4. دوامة لمدة 5-10 دقيقة لمزيد من إزعاج بصيلات. كشط أسفل أي قطعة الجريبي كبيرة وأنبوب الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في أدنى إعداد من الثورات ~ 500 في الدقيقة (RPM). نقل supernatant إلى أنبوب إيبيندورف 2 مل جديدة، وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة A. كرر الخطوة 6.3 بين 5-7 مرات، حتى يتم تقسيم الأنسجة المرئية إلى جزيئات صغيرة.
  5. تدور كلا الأنبوبين لمدة 10 دقائق في 2000 دورة في الدقيقة. تجاهل supernatant في كلا الأنبوبين. ملاحظة: سيتم استخدام كلا الأنبوبين لصنع شرائح التصور النووي النهائية. يجب أن يحتوي الأنبوب مع الناطقة التي تم جمعها على نواة مستخرجة في المقام الأول ، في حين أن الأنبوب الأصلي مع الأنسجة سيحتوي على مزيج من الأنسجة والنوى المضمنة في خلايا الممرضة. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة A - 0.1٪ تريتون واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C. جهاز طرد مركزي 5 دقائق عند 10,000 دورة في الدقيقة (10,621 x G) وإزالة الناسخة الفائقة.
  6. إضافة 200 ميكرولتر 4٪ بارافورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. احتضان في thermomixer لمدة 30 دقيقة، والاختلاط في 450 دورة في الدقيقة. جهاز طرد مركزي 5 دقائق عند 5000 دورة في الدقيقة (2655 × ز) وإزالة الناسخة الفائقة. اغسليه مع العازلة A مع تريتون 0.1٪ لمدة 5 دقائق، واخلطي عند 450 دورة في الدقيقة في الثيرموميكسير. جهاز طرد مركزي 5 دقائق عند 5000 دورة في الدقيقة (2655 جم) وإزالة الناسخة الفائقة.
  7. أضف درجة حرارة مسبقة عند 37 درجة مئوية مسبارا ملصقا إلى الأنبوب. النطر عند 95 درجة مئوية في thermomixer، الاختلاط في 450 دورة في الدقيقة، لمدة 10 دقيقة. استمر في التشبع عند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع استمرار الاختلاط. احتضان عند 37 درجة مئوية في thermomixer، مع 450 دورة في الدقيقة خلط بين عشية وضحاها. جهاز طرد مركزي 5 دقائق عند 5000 دورة في الدقيقة (2655 × ز). إزالة فائقة.
  8. غسل مع العازلة A مع 0.1٪ تريتون لمدة 5 دقائق. جهاز طرد مركزي 5 دقائق عند 5000 دورة في الدقيقة (2655 × ز). كرر 2 مرات. تطبيق قطرة من إطالة مكافحة تتلاشى مع DAPI.
  9. Pipet خارج الحل nuclei / DAPI بعناية (تجنب الفقاعات) ، تنطبق على الشريحة ، وتغطية مع coverslip.

Representative Results

يصف الشكل 1 إجمالي تدفق عبر البروتوكول الموضحة في هذه المقالة.  يبدأ المستخدم في البداية عن طريق قطع عينات الحمض النووي الكروموسومية من شرائح الغشاء.  يتم استخراج المواد المنقصة وتنقية. ثم يتم تضخيم الحمض النووي المنقى، وإعادة تضخيمه، وتسميته، ثم استخدامه ل FISH لتسمية ينتشر الكروموسوم.

يمكن تقسيم بروتوكول LCM إلى ثلاث خطوات عامة: 1) العثور على الكروموسومات ذات الاهتمام وإعداد المنطقة لقطع(الشكل 2A)،2) قطع والمنجنيق منطقة الكروموسوم ذات الأهمية عن طريق الليزر (الشكل 2B)، و 3) التحقق لتحديد ما إذا كانت العينة هي في الواقع قفزت إلى غطاء لاصق (الشكل 2C). تظهر عملية LCM المستخدمة على كروموسومات البوليتين سلالة An. غامبيا سوا في الفيديو 1. الفيديو تفاصيل العملية برمتها من بدء تشغيل البرنامج ، بما في ذلك وظائف البرنامج الهامة والنصائح.

GenomePlex و REPLI-g مجموعات WGA خلية واحدة المستخدمة في هذا البروتوكول تختلف اختلافا كبيرا في حجم المنتج الناتج، فضلا عن العائد العام.  ويبين الشكل 3 نتائج الكهروفورسيس الهلامي الذي أجري لمجموعات الجينومPlex و REPLI-g، فضلا عن تحديد كمية العينات عن طريق Nanodrop.

وقد استخدمت المواد المجهرية لإنشاء تحقيقات FISH التي تستهدف المناطق euchromatic من الكروموسوم.  يوضح الشكل 4 الأسماك من خمسة تحقيقات ولدت من المواد الممسكتة على كروموسومات البوليتين من An. غامبيا.  تم تسمية أربعة أذرع أوتوسومال بثلاثة فلوروفورس باستخدام مجموعة WGA3: يتم تسمية كروموسوم 3R باللون الأخضر (الفلورسين) ، وكروموسوم 3L في خليط من الأحمر (Cy-3) والأصفر (Cy-5) ، وكروموسوم 2R باللون الأصفر (Cy-5) ، وكروموسوم 2L باللون الأحمر (Cy-3). تم تصنيف كروموسوم X باللون البرتقالي (Cy-3) باستخدام ترجمة للمواد REPLI-g في تجربة منفصلة. لإنشاء المراسلات بين أجزاء euchromatic من الأسلحة الكروموسوم البوليتين والميتوتيك، وقد تم تهجين الدهانات الكروموسوم إلى إنترباز، prophase، بروميتافاس والكروموسومات ميتافايز من An. غامبيا (الشكل 5).  لتصور تنظيم 3D من ذراع كروموسوم البوليتين واحد في نواة الخلية، تم تنفيذ جبل كله FISH على An. غامبيا سوا سلالة خلايا ممرضة المبيض (فيديو 2).  وينظر بوضوح مناطق ذراع الكروموسوم متميزة في نواة مع إنترباتيز(الشكل 5D)وpolytene (فيديو 2) الكروموسومات.

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 تمثيل تخطيطي للإجراءات التجريبية نحو إعداد دهانات الكروموسوم. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم الخطوات الرئيسية في التشجر الدقيق الكروموسوم. أ) قطع بمساعدة الليزر من المنطقة الكروموسومية من الفائدة من خلال الغشاء. ب) يتم تنفيذ الغشاء مع ثقب بعد المنجنيق. ج) وجهة نظر قطعة منجنيق من الغشاء مع جزء الكروموسومات في ذلك تعلق على غطاء لاصق. يشير السهم إلى الهتيروماتين من كروموسوم X الذي بقي على الشريحة. تظهر النجمة قطعة من كروموسوم آخر بقي على الشريحة. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن صور هلام Agarose تظهر الحمض النووي بعد WGA. أ) انخفاض الوزن الجزيئي (200-500 نقطة أساس) الحمض النووي من الذراع 3R بعد استخدام مجموعات WGA4 و WGA3 GenomePlex. ب) الوزن الجزيئي العالي (10-20 kb) الحمض النووي من الذراع 2L بعد تضخيم REPLI-g. يظهر سلم 100 نقطة أساس في الممرات اليسرى. تظهر الجداول أدناه صور الجل تركيزات الحمض النووي التي تقاس بالانودروب. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 4
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال رسم كروموسومات البوليتين من خلايا ممرضة المبيض في An. gambiae باستخدام أربعة مسابير تم إنشاؤها من مواد مجزرة. تم تصنيف كروموسوم X باللون البرتقالي (Cy-3) من خلال ترجمة لمادة REPLI-g. وسم الذراع 2R باللون الأصفر (Cy-5)؛ الذراع 2L باللون الأحمر (Cy-3)؛ وسم الذراع 3R باللون الأخضر (الفلورسين); وسم الذراع 3L في خليط من الأحمر (Cy-3) والأصفر (Cy-5). تم تصنيف الوسومات التلقائية مع مجموعة تضخيم WGA3. الكروماتين ملطخ باللون الأزرق (DAPI). يتم وضع أسماء الكروموسومات بالقرب من المناطق التيلومريك. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 5
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم رسم الكروموسومات بين المراحل (A) والبروبهاز (B) والبروميتافاس (C) والميتافيزي (D) من أقراص اليرقات الماجينالية لسلالة An. gambiae Mopti باستخدام ثلاثة مسابير تم إنشاؤها من مواد مشقوقة صغيرة وصفتها WGA3. وسم الذراع 2R باللون الأخضر (الفلورسين); ذراع 2L غير تسمية; الذراع 3R باللون الوردي، وهو خليط من الأحمر (Cy-3) والبرتقال (Cy-5)؛ وسم الذراع 3L باللون البرتقالي (Cy-5). الكروموسوم X لديه تسمية حمراء المقابلة للمسبار rDNA 18S. الكروماتين ملطخ باللون الأزرق (DAPI). المناطق الملونة الزاهية من الكروموسومات تتوافق مع heterochromatin. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

فيديو 1. عملية LCM من الكروموسومات بوليتين An. غامبي. انقر هنا لمشاهدة الفيديو 1.

فيديو 2. جبل كامل 3D FISH يؤديها على خلايا ممرضة المبيض غامبيا. تم تسمية المسبار في Cy-3 (يصور باللون الأزرق) ومصطغ من ذراع كروموسوم 2R مجزئي.  كان ملطخا كروماتين مع DAPI ويصور بواسطة سماوية زائفة التلوين (الأزرق الفاتح). انقر هنا لعرض الفيديو 2.

Discussion

هناك خطوات متعددة حاسمة لتضخيم الحمض النووي بنجاح من عينات كروموسوم البوليتين المصححة. يستخدم البروتوكول استخدام LCM ، وهي طريقة تزيد من الكفاءة الشاملة وتقلل من التعرض للحمض النووي الأجنبي عن طريق إزالة تفاعل الأدوات المادية مع العينة. ومع ذلك ، فإن تضخيم الحمض النووي الأجنبي لا يزال أكبر عثرة محتملة لهذه التجربة. وبالتالي ، خلال العملية برمتها ، من الضروري الحفاظ على العينات محمية من التلوث. طوال مراحل إعداد الشريحة والتشريح الدقيق ، من الضروري غسل إبر تشريح الإيثانول ، والشرائح ، وقسائم الغطاء ، وكذلك مساحة العمل.  كما ينصح بمعالجة الأشعة فوق البنفسجية لجميع المعدات المعمول بها (الإبر والشرائح والأغطية) قبل الاستخدام.

الغشاء على الشرائح تشريح يجعل انتشار الكروموسومات صعبة للغاية.  من المهم استخدام المزيد من المبيض (نصف إلى زوج كامل من المبيضين) عند إجراء هذه الشرائح ، لتوفير فرصة أكبر للعثور على نواة منتشرة بشكل جيد.  كما يوصى باستخدام الأنسجة الطازجة عند صنع الشرائح ، حيث يبدو أن معدلات التضخيم تنخفض مع تقدم الأنسجة في سن 49 وانتشار الكروموسومات يصبح أكثر تحديا.  إعداد الشرائح للقسمة الدقيقة هو الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت في هذا البروتوكول.  يجب أن تنتشر الكروموسومات بشكل جيد لتجنب الاستحواذ العرضي على المواد غير المرغوب فيها.  تلطيخ Giemsa يسمح للمستخدم للتحقق من جودة انتشار مع المجهر النقيض المرحلة قبل استخدام نظام microdissection.

ويتيح الجمع بين التحلل الدقيق والتضخيم الفرصة لاستخراج وتحليل الأجزاء الكروموسومية التي تتراوح أحجامها بين المناطق الصغيرة ذات الأهمية وأغلبية الأسلحة.  يسمح هذا البروتوكول للمستخدم بالحصول على الحمض النووي من مناطق متميزة شكليا مثل الانعكاسات والعصابات euchromatic محددة وinterbands، التيلومريك، المركزية والتكلساتين. يمكن للمستخدم تطبيق مسابير اللوحة المتولدة لفحص الكروموسومات الشاذة ، أو دراسة الأوهام بين الأنواع في loci معينة ، أو توصيف التنظيم المكاني للكروموسومات في نواة ثلاثية الأبعاد سليمة. لتطوير الدهانات الكروموسومية، اخترنا شرائح euchromatic لتجنب تهجين الحمض النووي المتكررة مع مناطق الكروموسومات متعددة. ونتيجة لذلك، حصلنا على لوحة خاصة بالذراع دون استخدام منافس، مثل الحمض النووي الجينومي الكلي أو كسر الحمض النووي C0t-1.

اخترنا استخدام GenomePlex WGA ومجموعات REPLI-G استنادا إلى المراجعات التي قارنت معدل الكفاءة والتسرب من مجموعات تضخيم متعددة 40،44.  وكان أداء المجموعتين أفضل من بين الأساليب المتاحة في كل من معدل التسرب (كان معدل الجينومPlex 12.5٪ مقارنة مع REPLI-g 37.5٪) في 2012. ونسبة العلامات المضخمة (كان لدى GenomePlex معدل تضخيم 45.24٪ مقابل 30.0٪ في REPLI-g) 40.كما قدمت مجموعة GenomePlex كمية أعلى من الحمض النووي ، وبالتالي جعلها مرشحا أفضل لتقنيات المصب المتعددة.  كما تتوفر أيضا مجموعة أدوات لإعادة تضخيم نظام جينومبلس، مما يسمح بمزيد من تضخيم الحمض النووي. ومع ذلك ، من المهم أن نلاحظ أن التضخيم ليس مثاليا.  يبقى الاحتمال أن التضخيم الناجح يمكن أن يدخل أخطاء أو يكون له تحيز نحو loci محددة في الحمض النووي المستهدف. ومن المهم النظر في حجم الجزء النهائي من أساليب تضخيم الجينوم المتاحة.  ينتج عن تجزئة GenomePlex مكتبة ذات أجزاء تتراوح بين 200-500 نقطة أساس ، في حين تنتج مجموعة REPLI-g أجزاء من الحجم حوالي 10-20 كيلوبايت. والتطبيق المقصود لهذا البروتوكول في المصب هو FISH، مما يجعل مجموعة GenomePlex خيارا أكثر جدوى، لأنها توفر حجم الشظايا المطلوب والقدرة على تسمية شظايا الحمض النووي مباشرة من خلال WGA. يجب تجزئة جزيئات الحمض النووي الطويلة التي تنتجها تضخيم REPLI-g في رد فعل وضع العلامات على ترجمة في المصب.

تم تكييف هذا البروتوكول لتضخيم الحمض النووي بنجاح من ذراع كروموسوم بوليتين واحد.  تتطلب البروتوكولات الأخرى تجميع العديد من شظايا الكروموسوم (عادة 10-30) من أجل تضخيم العينة بنجاح 7و11و28و40.  على الرغم من أن تجميع الكروموسومات المتعددة ممكن باستخدام طريقتنا ، إلا أن زيادة احتمال تلوث العينة يؤكد على أهمية بدء التجربة مع أقل عدد ممكن من الكروموسومات. إذا لم تتوفر كروموسومات البوليتين، يمكن تكييف بروتوكولنا للاستخدام في الكروموسومات الميتوتيكية. قد يكون من الضروري، ومع ذلك، لتجميع الكروموسومات 10-15 ميتوتيك قبل تضخيم لأسماك ناجحة 11. التحيز التضخيم هو أقل مع كميات عالية من بدء قالب الحمض النووي 50. توفر كروموسومات البوليتين حوالي 512 نسخة من تسلسل الحمض النووي الواحد و 1024 نسخة من تسلسلين متجانسين للحمض النووي.  وبالتالي، فإن تجميع الكروموسومات ميتوتيك تساعد على زيادة الجودة الشاملة للمنتج الحمض النووي بعد تضخيم.

هذا الإجراء له العديد من الاستخدامات المحتملة في الدراسات الجينية الخلوية والجينومية. هنا، استخدمنا دهانات الكروموسوم لإنشاء المراسلات بين شرائح euchromatic من الأسلحة الكروموسوم البوليتين والميتوتيك في An. غامبيا. ويمكن تطبيق نفس المسابير اللوحة على توصيف الخلوية من خطوط الخلية الغامبية. إعادة ترتيب الجينوم واسعة النطاق والتغيرات في أعداد الكروموسومات هي السمات الشائعة لخطوط الخلية 51،52. تم الكشف عن الأنوبلويدية، والتعددية، وإعادة ترتيب الكروموسومات مثل عمليات النقل، والانقلابات، والحذف، والكروموسومات الحلقية في خطوط خلايا البعوض المختلفة 53،54. وقد أظهرت الملاحظات الجينية الخلوية الكلاسيكية 55 ورسم الخرائط الفيزيائية 56 حدوث انتقالات كروموسومية كاملة الذراع في تطور بعوض الملاريا. لذلك، يمكن استخدام المواد الممسوصة بالميكروستات جنبا إلى جنب مع تجارب FISH لمقارنة التماثل في المناطق الكروموسومية بين الأنواع. لقد نجحنا في تنفيذ 3D FISH مع مسبار 2R-painting على كروموسومات البوليتين في خلايا ممرضة المبيض الكاملة. هذه الطريقة سوف تسهل تتبع مسارات الكروموسوم ودراسة العمارة النووية في أنوفيليس. تقنيات مثل dna genotyping 57،58، الجيل التالي من تسلسل الجينوم 26،27، المادية وتطوير خريطة الربط ، وتوليد من تحقيقات للكروموسوم اللوحة 33،59 يمكن أن تستفيد جميع من التشحم الدقيق الذراع والمنطقة محددة. من خلال الجمع بين تكنولوجيا LCM والنهوض WGA خلية واحدة، ونحن نظهر كفاءة، وطريقة عملية لإنتاج كميات معقولة من الحمض النووي من ذراع كروموسوم البوليتين واحد.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة 1R21AI094289 إلى إيغور ف. شاراخوف

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Scientific A491-212
Methanol Fisher Scientific A412-4
Propionic acid  Sigma-Aldrich 402907
Membrane slides 1.0 PET Zeiss 415190-9051-000
Buffer tablets “GURR” Life Technologies 10582-013
KaryoMAX Giemsa Stain Life Technologies 10092-013
ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System Abbott Molecular 30-144110
Vacufuge vacuum concentrator Eppendorf 22820001
Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000 Fisher Scientific 11-992-89
Thermo Scientific NanoDrop Fisher Scientific ND-2000
REPLI-g Single Cell Kit Qiagen 150343
GenomePlex Single Cell Kit (WGA4) Sigma-Aldrich WGA4-10RXN
GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3) Sigma-Aldrich WGA3-50RXN
MZ6 Leica stereomicroscope Leica VA-OM-E194-354 A different stereomicroscope can be used
Olympus CX41 Phase Microscope Olympus CX41RF-5 A different phase microscope can be used
PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope Zeiss
Thermomixer Eppendorf 22670000
10x PBS Invitrogen P5493
50x Denhardt’s solution Sigma-Aldrich D2532
99% Formamide Fisher Scientific BP227500
Dextran sulfate sodium salt Sigma D8906
20x SSC buffer Invitrogen AM9765
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Fermentas R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP GE Healthcare PA53022, PA55022
BSA Sigma-Aldrich A3294
DNA polymerase I Fermentas EP0041
DNase I  Fermentas EN0521
Spermine Sigma-Aldrich S3256-1G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-1G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP3581
EGTA Sigma-Aldrich E0396-25G
PIPES Sigma-Aldrich P6757-25G
EDTA Fisher Scientific S311-500
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Triton-X100 Fisher Scientific BP151-100
AdhesiveCap 500 clear Zeiss 415190-9211-000
QIAamp DNA Micro Kit (50) Qiagen 56304
Genomic DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4010
37% Paraformaldehyde Fisher Scientific F79-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ried, T., Schrock, E., Ning, Y., Wienberg, J. Chromosome painting: a useful art. Human molecular genetics 7. , 1619-1626 (1998).
  2. Yang, F., et al. Reciprocal chromosome painting illuminates the history of genome evolution of the domestic cat, dog and human. Chromosome Res. 8, 393-404 (2000).
  3. Badenhorst, D., Dobigny, G., Robinson, T. J. Karyotypic evolution of hapalomys inferred from chromosome painting: a detailed characterization contributing new insights into the ancestral murinae karyotype. Cytogenet Genome Res 136. , 83-88 (2012).
  4. Trifonov, V. A., et al. Chromosomal evolution in Gekkonidae. I. Chromosome painting between Gekko and Hemidactylus species reveals phylogenetic relationships within the group. Chromosome Res. 19, 843-855 (2011).
  5. Nie, W., et al. Chromosomal rearrangements and karyotype evolution in carnivores revealed by chromosome painting. Heredity (Edinb. , 108-1017 (2012).
  6. Guan, X. Y., et al. Detection of chromosome 6 abnormalities in melanoma cell lines by chromosome arm painting probes). Cancer Genet Cytogenet. 107, 89-92 (1998).
  7. Guan, X. Y., et al. Characterization of a complex chromosome rearrangement involving 6q in a melanoma cell line by chromosome microdissection. Cancer genetics and cytogenetics 134. , 65-70 (2002).
  8. Breen, M., et al. Detection of equine X chromosome abnormalities in equids using a horse X whole chromosome paint probe (WCPP). Vet J. 153, 235-238 (1997).
  9. Kokhanenko, A. A., Anan'ina, T. V., Stegniy, V. N. The changes in chromosome 6 spatial organization during chromatin polytenization in the Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae) nurse cells. Protoplasma 250. , 141-149 (2013).
  10. Timme, S., et al. Nuclear position and shape deformation of chromosome 8 territories in pancreatic ductal adenocarcinoma. Anal Cell Pathol (Amst. 34, 21-33 (2011).
  11. Drosopoulou, E., et al. Sex chromosomes and associated rDNA form a heterochromatic network in the polytene nuclei of Bactrocera oleae (Diptera: Tephritidae). Genetica. 140, 169-180 (2012).
  12. Pazian, M. F., Shimabukuro-Dias, C. K., Pansonato-Alves, J. C., Oliveira, C., Foresti, F. Chromosome painting of Z and W sex chromosomes in Characidium (Characiformes). Crenuchidae). Genetica. 141, 1-9 (2013).
  13. Howe, E. S., Murphy, S. P., Bass, H. W. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol 990. , 53-66 (2013).
  14. Lysak, M. A., Mandakova, T. Analysis of plant meiotic chromosomes by chromosome painting. Methods Mol Biol 990. , 13-24 (2013).
  15. Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: detection of numerical and structural alterations in all 24 human chromosomes simultaneously using a novel OctoChrome FISH assay. J Vis Exp. 10, (2012).
  16. Idziak, D., et al. Painting the chromosomes of Brachypodium: current status and future prospects. Chromosoma. 120, 469-479 (2011).
  17. Fuchs, J., Kuhfittig, S., Reuter, G., Schubert, I. Chromosome painting in Drosophila. Chromosome Res. 6, 335-336 (1998).
  18. Zhimulev, I. F. Morphology and structure of polytene chromosomes. 34, Academic Press. 1-490 (1996).
  19. Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. in Chromosome Mapping Research Developments eds. J.F. Verrity & L.E. Abbington) (Nova Science. , Publishers, Inc. (2008).
  20. Coluzzi, M., Sabatini, A., Torre, della, Di Deco, A., A, M., Petrarca, V. A polytene chromosome analysis of the Anopheles gambiae species complex). Science. 298, 1415-1418 (2002).
  21. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malaria mosquitoes. Genetika. 23, 821-827 (1987).
  22. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malarial mosquitoes. II. Species specificity in the pattern of chromosome relations with the nuclear envelope of nutrient ovarian cells. Genetika. 23, 1194-1199 (1987).
  23. Bonaccorsi, S., Santini, G., Gatti, M., Pimpinelli, S., Colluzzi, M. Intraspecific polymorphism of sex chromosome heterochromatin in two species of the Anopheles gambiae complex. Chromosoma. 76, 57-64 (1980).
  24. Zhimulev, I. F. Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation. Adv Genet. 37, 1-566 (1998).
  25. Seifertova, E., et al. Efficient high-throughput sequencing of a laser microdissected chromosome arm. BMC Genomics. 14, 1471-2164 (2013).
  26. Weise, A., et al. High-throughput sequencing of microdissected chromosomal regions. European journal of human genetics. EJHG. 18, 457-462 (2010).
  27. Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 19. , 395-406 (2012).
  28. Moshkin, Y. M., et al. Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogastermutant Suppressor of Underreplication. Chromosoma. 111, 114-125 (2002).
  29. Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Laser Mahalingam, M. capture microdissection: methods and applications. Methods Mol Biol 755. , 1-15 (2011).
  30. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. 10, (2010).
  31. Kubickova, S., Cernohorska, H., Musilova, P., Rubes, J. The use of laser microdissection for the preparation of chromosome-specific painting probes in farm animals. Chromosome Res. 10, 571-577 (2002).
  32. Fukova, I., et al. Probing the W chromosome of the codling moth, Cydia pomonella, with sequences from microdissected sex chromatin. Chromosoma. 116, 135-145 (2007).
  33. Thalhammer, S., Langer, S., Speicher, M. R., Heckl, W. M., Geigl, J. B. Generation of chromosome painting probes from single chromosomes by laser microdissection and linker-adaptor PCR. Chromosome Res. 12, 337-343 (2004).
  34. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a chip 7. , 423-440 (2007).
  35. Hutchison, C. A., 3rd,, Venter, J. C. Single-cell genomics. Nature biotechnology. 24, 657-658 (2006).
  36. Lasken, R. S., Egholm, M. Whole genome amplification: abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens. Trends in biotechnology 21. , 531-535 (1016).
  37. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Cytogenet Genome Res. 125, 286-291 (2009).
  38. Liu, J. D., et al. Sex chromosomes in the spiny eel (Mastacembelus aculeatus) revealed by mitotic and meiotic analysis. Cytogenet Genome Res. 98, 291-297 (2002).
  39. Harvey, S. C., et al. Molecular-cytogenetic analysis reveals sequence differences between the sex chromosomes of Oreochromis niloticus: evidence for an early stage of sex-chromosome differentiation. Cytogenet Genome Res. 97, 76-80 (2002).
  40. Hockner, M., Erdel, M., Spreiz, A., Utermann, G., Kotzot, D. Whole genome amplification from microdissected chromosomes. Cytogenet Genome Res. 125, 98-102 (2009).
  41. Kitada, K., Taima, A., Ogasawara, K., Metsugi, S., Aikawa, S. Chromosome-specific segmentation revealed by structural analysis of individually isolated chromosomes. Genes Chromosomes Cancer. 50, 217-227 (2011).
  42. Ma, L., et al. Direct determination of molecular haplotypes by chromosome microdissection. Nature methods. 7, 299-301 (2010).
  43. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in Locusta migratoria. Chromosome Res. 17, 11-18 (2009).
  44. Treff, N. R., Su, J., Tao, X., Northrop, L. E., Scott, R. T. Single-cell whole-genome amplification technique impacts the accuracy of SNP microarray-based genotyping and copy number analyses. Molecular human reproduction 17. , 335-343 (2011).
  45. Rutten, K. B., et al. Chromosomal anchoring of linkage groups and identification of wing size QTL using markers and FISH probes derived from microdissected chromosomes. in Nasonia(Pteromalidae : Hymenoptera). Cytogenetic and Genome Research 105. , 126-133 (2004).
  46. Post, R. J., Kruger, A., Somiari, S. B. Laser-assisted microdissection of polytene chromosomes from Diptera for the development of molecular markers. Molecular Ecology Notes. 6, 634-637 (2006).
  47. George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-throughput physical mapping of chromosomes using automated in situ hybridization. Journal of visualized experiments : JoVE. 10, (2012).
  48. Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes. J Vis Exp. 10, (2012).
  49. Frumkin, D., et al. Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues. BMC biotechnology. 8, 10-1186 (2008).
  50. Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Applied and environmental microbiology 71. , 3342-3347 (2005).
  51. Cassio, D. Long term culture of MDCK strains alters chromosome content. BMC Res Notes. 6, 162-1610 (2013).
  52. Landry, J. J., et al. The Genomic and Transcriptomic Landscape of a HeLa Cell Line. G3. , Bethesda. (1534).
  53. Steiniger, G. E., Mukherjee, A. B. Insect chromosome banding: technique for G- and Q-banding pattern in the mosquito Aedes albopictus. Can J Genet Cytol. 17, 241-244 (1975).
  54. Brown, S. E., et al. Toward a physical map of Aedes aegypti. Insect Mol Biol. 4, 161-167 (1995).
  55. Green, C., Hunt, R. Interpretation of variation in ovarian polytene chromosomes of Anopheles funestus Giles. A. parensis Gillies, and A. aruni? Genetica. 51, 187-195 (1980).
  56. Sharakhova, M. V., Xia, A., Leman, S. C., Sharakhov, I. V. Arm-specific dynamics of chromosome evolution in malaria mosquitoes. BMC evolutionary biology. 11, 10-1186 (2011).
  57. Gu, L. H., et al. DNA genotyping of oral epithelial cells by laser capture microdissection]. Fa yi xue za zhi 22. , 196-197 (2006).
  58. Rook, M. S., Delach, S. M., Deyneko, G., Worlock, A., Wolfe, J. L. Whole genome amplification of DNA from laser capture-microdissected tissue for high-throughput single nucleotide polymorphism and short tandem repeat genotyping. The American journal of pathology 164. , 23-33 (2004).
  59. Houen, A., Field, B. L., Saunders, V. A. Microdissection and chromosome painting of plant B chromosomes. Methods in cell science : an official journal of the Society for In. Vitro Biology. 23, 115-124 (2001).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 83، التشنج المجهري، تضخيم الجينوم كله، بعوضة الملاريا، كروموسوم البوليتين، الكروموسومات الميتوتيكية، الفلورسينس في التهجين الموقعي، رسم الكروموسوم
2D و 3D كروموسوم اللوحة في البعوض الملاريا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

George, P., Sharma, A., Sharakhov,… More

George, P., Sharma, A., Sharakhov, I. V. 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes. J. Vis. Exp. (83), e51173, doi:10.3791/51173 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter