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Immunology and Infection

मलेरिया मच्छरों में 2डी और 3डी गुणसूत्र पेंटिंग

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/51173
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Entomology, Virginia Tech

Summary

गुणसूत्र चित्रकला कोशिका नाभिक और karyotype के विकास के संगठन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी विधि है। यहां, हम एकल पॉलीटीन गुणसूत्रों से ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों को अलग और बढ़ाने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदर्शित करते हैं जो बाद में सीटू संकरण (मछली) में दो और त्रि-आयामी फ्लोरोसेंट के लिए उपयोग किए जाते हैं।

Abstract

पूरे हाथ गुणसूत्र जांच के सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट ब्याज के जीनोमिक क्षेत्रों के मानचित्रण, गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं का पता लगाने, और कोशिका नाभिक में गुणसूत्रों के त्रि-आयामी (3 डी) संगठन का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत तकनीक है। लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) और पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) का आगमन एकल कोशिकाओं से बड़ी मात्रा में डीएनए प्राप्त करने की अनुमति देता है। WGA किट की बढ़ी हुई संवेदनशीलता ने हमें गुणसूत्र पेंट विकसित करने और गैर-मॉडल जीवों में गुणसूत्र संगठन और विकास की खोज के लिए उनका उपयोग करने के लिए प्रेरित किया। यहां, हम अफ्रीकी मलेरिया मच्छर एनोफेल्स गैम्बियाकी ओवेरियन नर्स कोशिकाओं से एकल पॉलीटीन गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक खंडों को अलग-थलग करने और बढ़ाने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रक्रिया गुणसूत्र पेंट प्राप्त करने के लिए एक कुशल मंच प्रदान करती है, जबकि नमूने के लिए विदेशी डीएनए शुरू करने के समग्र जोखिम को कम करती है। WGA का उपयोग पुनः प्रवर्धन के कई दौर के लिए अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए की उच्च मात्रा होती है जिसका उपयोग 2डी और 3डी मछली सहित कई प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। हमने दिखा दिया कि विकसित गुणसूत्र पेंट का उपयोग एएन गाम्बियामें पॉलीटेन और मिटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक भागों के बीच पत्राचार स्थापित करने के लिए सफलतापूर्वक किया जा सकता है । कुल मिलाकर, एलसीएम और एकल गुणसूत्र WGA का संघ भविष्य साइटोजेनेटिक और जीनोमिक अध्ययनों के लिए लक्ष्य डीएनए की महत्वपूर्ण मात्रा बनाने के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

गुणसूत्र चित्रकला 1-5 कायोटाइप के विकास का अध्ययन करने और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले क्रोमोसोमल डीएनए 1, 6-8 के संकरण के माध्यम से साइटोजेनेटिक असामान्यताओं की कल्पना करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है। यह विधि विकास 9 और पैथोलॉजी 10में गुणसूत्र क्षेत्रों की 3डी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी लागू की जाती है । अलग-अलग माइटोटिक 11, 12,मेयोटिक13, 14,या इंटरफेज नॉन-पॉलीटेन 15,16और पॉलीटीन 9,11, 17 क्रोमोसोम के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अलग-अलग लेबल वाले गुणक पेंट का उपयोग किया जाता है। गुणसूत्र पेंट प्राप्त करने के लिए एक सरल और मजबूत प्रोटोकॉल मच्छरों जैसे गैर-मॉडल जीवों के लिए इस तकनीक के विस्तार में बहुत उपयोगी होगा। एनोफेल्स गैम्बिया परिसर सात रूपात्मक रूप से अविवेच्य मच्छरों का एक समूह है जो मलेरिया संचारित करने की क्षमता सहित व्यवहार और अनुकूलन में भिन्न होते हैं।  ये मच्छर बारीकी से संबंधित प्रजातियों के विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में काम करते हैं जो उनकी वेक्टरल क्षमता में बहुत भिन्न होते हैं।  मलेरिया मच्छरों में अधिकांश साइटोजेनेटिक अध्ययन अच्छी तरह से विकसित, अत्यधिक पॉलीटेनाइज्ड गुणसूत्रों (18, 19में समीक्षा) का उपयोग करके किए गए हैं। पॉलीटेन गुणसूत्रों के पठनीय बैंडिंग पैटर्न ने शोधकर्ताओं को एनोफेल्स गैम्बिया 20में बहुरूपिक उलटा और पारिस्थितिक अनुकूलन के बीच संबंध प्रदर्शित करने की अनुमति दी। इसके अलावा, ऊतक-विशिष्ट 21 और प्रजातियों-विशिष्ट 3 डी पॉलीटीन गुणसूत्र संगठन की विशिष्ट 22 विशेषताएं एएन मैकलिपेनिस परिसर में विशेषता रही हैं। हालांकि, माइटोटिक गुणसूत्रों का अध्ययन अतिरिक्त महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, माइटोटिक गुणसूत्रों में मनाए गए हेट्रोक्रोमोमाटिन बहुरूपता का उच्च स्तर ए. गाम्बियाई 23में कम संभोग गतिविधि और प्रजनन क्षमता के साथ सहसंबद्ध किया गया है। पॉलीटेन और माइटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक खंडों के बीच पत्राचार केवल उनके सापेक्ष लंबाई की तुलना करके स्थापित करना मुश्किल हो सकता है। इसका कारण यह है कि हेट्रोक्रोमैटिन माइटोटिक गुणसूत्रों का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बनाता है, लेकिन पॉलीटीन गुणसूत्रों 24में कम प्रतिनिधित्व किया जाता है। मलेरिया मच्छरों के लिए गुणसूत्र पेंट की उपलब्धता शोधकर्ताओं को अतिरिक्त प्रजातियों को शामिल करके साइटोजेनेटिक अध्ययनों का काफी विस्तार करने की अनुमति देगी, जबकि महामारी विज्ञान के इस समूह में कायोयत्पिक विकास और गुणसूत्रों की 3डी गतिशीलता के विश्लेषण में लागत और समय को काफी कम कर देगा।

गुणसूत्रों के बड़े हिस्सों को प्राप्त करने के लिए, माइक्रोडिसेक्शन गुणसूत्र पूरक के हित के विशिष्ट क्षेत्रों में हेरफेर और अलग-थलग करने के लिए एक अभिन्न तकनीक बन गया है।  जब पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) के साथ मिलकर, माइक्रोडिसेक्शन के परिणामस्वरूप मछली 11,12 और अगली पीढ़ी के जीनोम अनुक्रमण 25-27सहित शक्तिशाली डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग होते हैं। पहले, तकनीक के लिए विशेष माइक्रोडिसेक्शन सुइयों के उपयोग की आवश्यकता होती थी जिसे एक अनुभवी उपयोगकर्ता द्वारा मैन्युअल रूप से नियंत्रित किया जाना था 28।  लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) की उन्नति के परिणामस्वरूप एक सरलीकृत उपकरण बेहतर रूप से एकल कोशिकाओं 29,30 या व्यक्तिगत गुणसूत्रों को अलग करने के लिए उपयुक्त है 31-33 प्रदूषण के कम जोखिम के साथ। यह दृष्टिकोण उपयोगकर्ता को एक आम सहमति परिदृश्य के बजाय, एकल कोशिकाओं में होने वाली आनुवंशिक विषमताओं और गुणसूत्र असामान्यताओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप कई कोशिकाओं को एक साथ 34-36से पूलिंग किया जाता है। माइक्रोडिसेक्शन से उत्पादित डीएनए को बढ़ाने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है।  डीओपी-पीसीआर, अत्यधिक दोहराव वाले दृश्यों के प्रवर्धन के लिए उपयोगी तकनीक, टिड्डी 37,स्पाइनी ईल 38और नील तिलपिया 39सहित प्रजातियों से माइक्रोडिसेक्टेड गुणसूत्रों को बढ़ाने के लिए उपयोग किया गया है।  हाल ही में, पीसीआर आधारित जीनोमप्लेक्स WGA4 सिंगल सेल किट और मल्टीपल विस्थापन प्रवर्धन आधारित (एमडीए) रिपली-जी सिंगल सेल किट एकल मानव कोशिकाओं के आनुवंशिक विश्लेषण के साथ-साथगुणसूत्रों 40-42के आनुवंशिक विश्लेषण से जुड़े प्रयोगों के लिए मूल्यवान उपकरण बन गए हैं, जिसमें टिड्डी 37 और टिड्डी 43में बी क्रोमोसोम सिस्टम शामिल हैं। इन दो किट प्रत्येक लाभ और नुकसान है, लेकिन अन्य उपलब्ध प्रवर्धन प्रणाली के ऊपर उनकी स्पष्ट श्रेष्ठता 44का प्रदर्शन किया गया है.

डीएनए की मात्रा जो एक गुणसूत्र या गुणसूत्र खंड से प्राप्त की जा सकती है, एक पूरे नाभिक की तुलना में काफी कम है। इसलिए माइक्रोडिसेक्शन, प्रवर्धन और एक गुणसूत्र का बाद में विश्लेषण कहीं अधिक चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से ड्रोसोफिला या एनोफेल्सजैसे छोटे जीनोम वाले जीवों में।  यद्यपि पेंट को मानव 33 और एक ततैया 45के एकल माइक्रोडिसेक्टेड गुणसूत्रों से विकसित किया गया है, लेकिन एक सफल मछली प्रयोग के लिए फल फ्लाई 11के कई (कम से कम 10-15) माइक्रोडिसेक्टेड माइटोटिक गुणसूत्रों की आवश्यकता होती है। हालांकि, एक गुणसूत्र को माइक्रोडिसेक्ट और बढ़ाना करने की क्षमता (i) के लिए महत्वपूर्ण होगी, जो एक अलग गुणसूत्र से सामग्री के साथ संदूषण की संभावना को कम करती है, (ii) माइक्रोडिसेक्शन के लिए आवश्यक गुणसूत्र तैयारियों की संख्या को कम करती है, (iii) मछली और अनुक्रमण दोनों में माइक्रोडिसेक्टेड नमूने के न्यूक्लियोटाइड और संरचनात्मक बहुरूपता को कम करना। कई डिप्टरन प्रजातियों में पाए जाने वाले पॉलीटेन गुणसूत्र डीएनए की बहुत अधिक शुरुआती मात्रा प्राप्त करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। वे एक उच्च संकल्प और गुणसूत्र संरचना भी प्रदान करते हैं जिसे माइटोटिक गुणसूत्रों के उपयोग के माध्यम से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। यह जोड़ा गया संकल्प क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्थाओं, क्रोमेटिन संरचना और क्रोमोसोमल खंडों को माइक्रोडिसेक्टेड 28,46होने की कल्पना करने में महत्वपूर्ण हो सकता है।

यहां हम एक एकल पॉलीटीन गुणसूत्र हाथ से एक यूक्रोमेटिक सेगमेंट को कुशलतापूर्वक अलग करने, डीएनए को बढ़ाने और मलेरिया मच्छरों में डाउनस्ट्रीम फिश अनुप्रयोगों में इसका उपयोग करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं।  सबसे पहले, हम विशेष रूप से तैयार झिल्ली स्लाइड से एक गुणसूत्र हाथ को अलग करने और निकालने के लिए एलसीएम लागू करते हैं। दूसरा, WGA का उपयोग माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से डीएनए को बढ़ाना है। तीसरा, हम मछली प्रयोगों में परिलक्षित डीएनए को पॉलीटेन स्क्वैश तैयारी 47,मेटाफेज और इंटरफेज गुणसूत्र स्लाइड 48,साथ ही 3 डी ओवेरियन पूरे माउंट नमूनों को संकरित करते हैं। यह प्रक्रिया एक गाम्बियाके गुणसूत्र हथियारों में अधिकांश यूक्रोमेटिन को सफलतापूर्वक पेंट करने के लिए की गई है ।

Protocol

1) लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के लिए पॉलीटेन गुणसूत्र स्लाइड तैयारी

  1. 25 घंटे के बाद रक्त खिलाने पर आधा ग्रेविड एनोफेल्स महिलाओं को काटना। लगभग पांच महिलाओं से अंडाशय को ताजा संशोधित कार्नॉय के समाधान (100% मेथनॉल: हिमनदों एसिटिक एसिड, 3:1) में 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 500 माइक्रोन में ठीक करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए अंडाशय को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
  2. क्रोमोसोम स्लाइड बनाने से ठीक पहले कार्नॉय का समाधान (100% इथेनॉल: हिमनद एसिटिक एसिड, 3:1) और 50% प्रोपियोनिक एसिड तैयार करें।
  3. एक Zeiss 1.0 पीईटी झिल्ली स्लाइड पर कार्नॉय के समाधान की एक बूंद में अंडाशय की एक जोड़ी रखें। आकार के आधार पर, विच्छेदन सुई के साथ लगभग 2-4 वर्गों में अंडाशय को विभाजित करें और उन्हें विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत साफ स्लाइड पर 50% प्रोपियोनिक एसिड की एक बूंद में रखें।
  4. अलग रोम और एक विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत कागज तौलिया का उपयोग कर शेष ऊतकों को हटा दें। रोम में 50% प्रोपियोनिक एसिड की एक नई बूंद जोड़ें और उन्हें कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें।
  5. बूंद के शीर्ष पर एक सिलिकॉन कवरलिप रखें। स्लाइड लगभग 1 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
  6. स्लाइड को शोषक सामग्री के साथ कवर करें (फिल्टर पेपर का उपयोग इस विधि के लिए किया जाता है), और पेंसिल के रबड़ पक्ष का उपयोग करते समय, इरेज़र के साथ बार-बार टैप करके कवरस्लिप पर उदार मात्रा में दबाव लागू करें।
  7. पॉलीटीन गुणसूत्रों को सपाट करने में सहायता करने के लिए 15-20 मिनट के लिए स्लाइड डेनैचुरेशन/हाइब्रिडाइजेशन सिस्टम पर स्लाइड को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। एसिड को और समतल गुणसूत्रों की अनुमति देने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड रखें।
  8. 10 मिनट के लिए ठंड 50% इथेनॉल में स्लाइड रखें। धीरे-धीरे कवरस्लिप को हटा दें, और 10 और न्यूनतम के लिए ठंडे 50% इथेनॉल में बदलें।
  9. 70%, 90%, 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल में निर्जलित स्लाइड। एयर ड्राई स्लाइड्स।
  10. आसुत पानी के 1 एल में एक ही बफर टैबलेट जोड़कर GURR बफर समाधान का समाधान तैयार करें। ऑटोक्लेव।
  11. जीमसा समाधान को 50 मिलीलीटर जीयूआर बफर में 1 मिलीलीटर गिम्सा धुंधला समाधान जोड़कर तैयार करें।
  12. 10 मिनट के लिए Giemsa समाधान में हवा सूखे स्लाइड रखें और 1X PBS में तीन बार धोएं । वायु सूखी स्लाइड फिर से एक नियंत्रित बाँझ जलवायु में प्रदूषण से बचने के लिए ।

2) लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन एक पॉलीटेन गुणसूत्र बांह का

इस सेक्शन में पामरोबो सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल का ब्योरा दिया गया है, जो पाम माइक्रोबीम लेजर माइक्रोडिसेक्शन सिस्टम के साथ आता है ।

  1. माइक्रोस्कोप को 100% इथेनॉल से साफ करें। एक यूवी-क्रॉसलिंकर में एक यूवी प्रकाश के साथ दस्ताने और ट्यूबों को स्टरलाइज करें।
  2. पाम माइक्रोबीम लेजर माइक्रोडिसेक्शन माइक्रोस्कोप को पावर करें और लेजर चालू करें। लेजर विच्छेदन सुइट, पामरबो खोलें, और आवश्यक के रूप में "पावर" और "फोकस" सेटिंग्स को कॉन्फ़िगर करें।
  3. ब्याज की पॉलीटेन गुणसूत्र शाखा के लिए खोजें।
  4. "पेंसिल" उपकरण का उपयोग करना, चयनित क्षेत्र की रूपरेखा।
  5. मेनू बार से "तत्व खिड़की" खोलें।
  6. "तैयार तत्व" का चयन करें, यह सुनिश्चित करें कि आपने "कट" का चयन किया है।
  7. चिपकने वाला कैप ट्यूब को धारक में स्थापित करें और स्लाइड के ऊपर रखें, आकार में एक छोटा सा अंतर <1 मिमी छोड़ दें, और लेजर कट शुरू करें।
  8. किनारे और गुणसूत्र के बीच जगह छोड़कर, कट साइट के भीतर "गुलेल चयन" रखें।
  9. ड्रॉप डाउन विकल्प से "एलपीसी" का चयन करें और गुलेल शुरू करें।
  10. यह सुनिश्चित करने के लिए जांच करें कि नमूना "आई" आइकन को दबाकर कैप में पहुंचा दिया गया था।

3) एक माइक्रोडिसेक्टेड पॉलीटीन गुणसूत्र बांह से डीएनए की शुद्धि

एकत्र डीएनए को जारी करने और शुद्ध करने के लिए QIAamp डीएनए माइक्रो किट के निर्देशों का पालन करें। उलटा ट्यूब को समायोजित करने के लिए चरण 3.1 को संशोधित किया गया था।

  1. उल्टे ट्यूब (टोपी के अंदर) में 15 माइक्रोन बफर एटीएल और 10 माइक्रोन प्रोटीन के जोड़ें और 3 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. 25 माइक्रोन बफर एटीएल, 50 माइक्रोन बफर अल, और 1 माइक्रोन कैरियर आरएनए जोड़ें; मिक्स करें। 50 माइक्रोन 100% एटोह जोड़ें; मिक्‍स।
  3. QIAamp कॉलम में स्थानांतरित करें; अपकेंद्रण यंत्र। 500 माइक्रोन बफर AW1 जोड़कर धोएं; अपकेंद्रण यंत्र। नए संग्रह ट्यूब में कॉलम रखें, 500 μl बफर AW2 जोड़ें; अपकेंद्रण यंत्र। कॉलम को एक नई ट्यूब में रखें; अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए अपकेंद्रित्र।
  4. कॉलम को 1.5 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें और एल्यूट करने के लिए 20 माइक्रोन पानी जोड़ें; अपकेंद्रण यंत्र।
  5. एक वैक्यूमफ्यूज का उपयोग करके 9 माइक्रोन की अंतिम मात्रा तक हौसले से वाष्पित डीएनए को वाष्पित करें।

4) एक माइक्रोडिसेक्टेड पॉलीटीन गुणसूत्र बांह से डीएनए का प्रवर्धन

एक गुणसूत्र बांह के डब्ल्यूजीए के लिए दो अलग-अलग प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था।

  1. जीनोमप्लेक्स WGA के माध्यम से डीएनए प्रवर्धन और जांच की तैयारी
    1. प्रवर्धित डीएनए के पहले बैच का उत्पादन करने के लिए जीनोमप्लेक्स सिंगल सेल WGA4 किट प्रोटोकॉल का पालन करें:
      1. 9 माइक्रोन नमूने में ताजा तैयार प्रोटीनेज कश्मीर समाधान जोड़ें; मिक्स करें। 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए को इनक्यूबेट करें, फिर 4 मिनट के लिए 99 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। बर्फ पर रखें।
      2. 2 माइक्रोन 1X सिंगल सेल लाइब्रेरी तैयारी बफर और लाइब्रेरी स्थिरीकरण समाधान के 1 माइक्रोन जोड़ें; मिक्स। 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए हीट नमूना। बर्फ और अपकेंद्रित्र पर शांत।
      3. पुस्तकालय तैयारी एंजाइम के 1 माइक्रोन जोड़ें; मिश्रण और अपकेंद्रित्र। इस प्रकार इनक्यूबेट:
        Equation 1
      4. 7.5 माइक्रोन 10X प्रवर्धन मास्टर मिक्स, 48.5 माइक्रोन पानी जोड़ें। 5.0 μl WGA डीएनए पॉलीमरेज; मिश्रण और अपकेंद्रित्र।
      5. थर्मोसाइकिल इस प्रकार है:
        Equation 2
    2. जीनोमिक डीएनए क्लीन एंड ओरस्टिंटेड किट का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें। प्रोटोकॉल इस प्रकार है:
      1. 5:1 डीएनए बाध्यकारी बफर जोड़ें: डीएनए नमूना (विशेष रूप से 2 केबी से कम के जीनोमिक डीएनए के लिए। यदि नमूना डीएनए 2 केबी से अधिक है, तो 2:1 अनुपात का उपयोग करें) और प्रदान किए गए स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें। अपकेंद्रण यंत्र।
      2. 200 माइक्रोन डीएनए वॉश बफर और सेंट्रलाइज जोड़ें। रिपीट वॉश स्टेप। फिर, 50 माइक्रोन पानी जोड़ें और डीएनए को एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एल्यूट करें।
    3. जीनोमप्लेक्स WGA3 रीएम्प्लिफिकेशन किट का उपयोग करके नमूना डीएनए को फिर से बढ़ाना इस प्रकार है:
      1. पीसीआर ट्यूब में 10 माइक्रोन डीएनए जोड़ें (किट 49.5 माइक्रोन पानी, 7.5 माइक्रोन 10x प्रवर्धन मास्टर मिक्स, 3.0 माइक्रोन 10 mM DNTP मिश्रण, और 5.0 μl WGA डीएनए बहुलक के साथ डीएनए के 10 एनजी कुल की सिफारिश की। मिक्स और सेंट्रलाइज।
      2. प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित प्रोफ़ाइल का उपयोग करें:
        Equation 3
      3. डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. निम्नलिखित के रूप में जीनोमप्लेक्स WGA3 पुनर्लिपि किट का उपयोग कर मछली के लिए डीएनए लेबल:
      1. 49.5 माइक्रोन पानी के साथ पीसीआर ट्यूब में 10 माइक्रोन डीएनए जोड़कर जीनोमप्लेक्स WGA3 रीम्प्लिफिकेशन किट से मास्टर मिक्स बनाएं, 7.5 माइक्रोन 10X प्रवर्धन मास्टर मिक्स, 3.0 माइक्रोन 1 एमएमएम डीएनटीपी मिक्स (1 एमएम डैटपी, डीसीटीपी, डीजीटीपी, 0.3 माइक्रोल 1 एमएम डीटीटीपी - यदि लेबल dUTP का उपयोग करते हैं, तो 25 एनएम लेबल डीयूटीपीपी का 1 माइक्रोन , और 5.0 माइक्रोन डब्ल्यूजीए डीएनए पॉलीमरेज।
      2. प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित प्रोफ़ाइल का उपयोग करें:
        Equation 3
      3. इथेनॉल 1/10 अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा (75 माइक्रोन प्रतिक्रिया के लिए 7.5 माइक्रोन) 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.2 और 100% इथेनॉल के 2-3 वॉल्यूम जोड़कर लेबल जांच को उपजी है। कम से कम 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा डीएनए नमूना।
      4. लेबल गोली बनाने और सुपरनैंट और हवा-सूखी गोली को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज नमूना।
      5. संकरण बफर को इस प्रकार बनाएं:
        0.2 ग्राम डेक्सट्रान सल्फेट
        1200 माइक्रोन डिएकाइज्ड फॉर्ममाइड
        580 माइक्रोल एच2ओ
        120 माइक्रोल 20X एसएससी
      6. हवा में सूखे गोली के लिए संकरण बफर के 40 माइक्रोन जोड़ें।
  2. डीएनए प्रवर्धन और REPLI के माध्यम से जांच की तैयारी-जी एकल सेल WGA निक अनुवाद के बाद
    1. प्रवर्धित डीएनए का उत्पादन करने के लिए REPLI-g एकल सेल WGA किट प्रोटोकॉल का पालन करें:
      1. बफर डी 2 (1 एम डीटीटी + 33 माइक्रोन बफर डीएलबी के 3 माइक्रोन) तैयार करें।
      2. 3 माइक्रोल बफर डी 2 के साथ शुद्ध माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री के 4 माइक्रोल मिलाएं। मिश्रण करने के लिए फ्लिक ट्यूब। 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। स्टॉप सॉल्यूशन के 3 माइक्रोन जोड़ें; मिक्‍स।
      3. नमूने में 9 माइक्रोन एच2ओ, 29 माइक्रोन रिपली-जी रिएक्शन बफर, और 2 माइक्रोन-आरईपीएल डीएनए पॉलीमरेज जोड़ें। 8 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। डीएनए पॉलीमरेज को 3 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके निष्क्रिय करें। डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. REPLI-g प्रवर्धित डीएनए लेबल करने के लिए निक अनुवाद प्रोटोकॉल का पालन करें:
      1. निम्नलिखित लेबलिंग मिश्रण तैयार करें:
        1 प्र परिलक्षित डीएनए का μg
        5 माइक्रोन 10X डीएनए पॉलीमरेज बफर
        5 माइक्रोन 10X डीएनटीपी
        5 माइक्रोन 1X बीएसए
        1 माइक्रोन 1 एमएमए लेबल dNTP
        4 माइक्रोन 1 यू/माइक्रोन DNase मैं
        1 माइक्रोन 10 यू/माइक्रोन डीएनए पॉलीमरेज I
        एच2ओ से 50 माइक्रोन
      2. 2 घंटे के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 0.5 एम ईडीटीए के 2 माइक्रोन जोड़ें। जेल पर चलाकर डीएनए के टुकड़े के आकार की जांच करें।
      3. 4.1.4.3-4.1.4.6 से कदम का पालन करें और गोली को कम करने और घुलनशील करने के लिए।

5) पॉलीटेन और माइटोटिक गुणसूत्र स्क्वैश तैयारी पर 2डी फिश

पॉलीटेन स्क्वैश 47 और माइटोटिक क्रोमोसोम स्लाइड 48की तैयारी पर मछली के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का उल्लेख करें। यहां हम संक्षिप्त प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

  1. पॉलीटेन गुणसूत्र स्क्वैश तैयारी पर मछली
    1. आरटी में 20 मिनट के लिए 1X पीबीएस में स्लीव्स विसर्जित करें। 1 मिनट के लिए 1X पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में स्लाइड फिक्स करें।
    2. इथेनॉल वॉश के माध्यम से डिहाइड्रेट स्लाइड: आरटी में 5 मिनट के लिए 50%, 70%, 90%, 100%। एयर-ड्राई स्लाइड।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर संकरण बफर में जांच पूर्वाद्ध। स्लाइड करने के लिए जांच के 10-20 μl जोड़ें । 22 X 22 मिमी कवरलिप के साथ कवर करें। पिपेट टिप का उपयोग करके किसी भी हवा के बुलबुले को दबाएं।
    4. 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर डिनाचर गुणसूत्र और जांच। रबर सीमेंट के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें। आर्द्र कक्ष में स्लाइड स्थानांतरित करें और रात भर 39 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. 20 मिनट के लिए 39 डिग्री सेल्सियस पर 1X एसएससी के साथ स्लाइड धोएं। 20 मिनट के लिए आरटी में 1X एसएससी के साथ स्लाइड धोएं । 1X PBS में स्लाइड कुल्ला, तो DAPI के साथ लंबे समय तक विरोधी फीका जोड़ें । कवरलिप के साथ कवर करें, और दृश्य से कम से कम एक घंटे पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड बॉक्स में स्टोर करें।
  2. माइटोटिक गुणसूत्र स्क्वैश तैयारी पर मछली
    1. ए. गाम्बिया के4वें इंस्टार लार्वा के कल्पनाशील डिस्क से माइटोटिक गुणसूत्रों को निकालें।
    2. मछली के लिए उपयुक्त गुणसूत्र स्लाइड तैयार करें।
    3. एक ट्यूब में संकरण बफर के लिए लेबल डीएनए जांच के 2-3 μl जोड़ें और पाइपिंग द्वारा धीरे मिश्रण ।
    4. स्लाइड करने के लिए जांच मिश्रण के 10 माइक्रोन लागू करें और एक 22 X 22 मिमी कवरलिप के साथ कवर । पिपेट टिप का उपयोग करके किसी भी हवा के बुलबुले को दबाएं।
    5. काउंटरिंग और डिटेक्शन के लिए, तैयारी के लिए DAPI के साथ लंबे समय तक एंटी-फीका लागू करें और दृश्य से कम से कम एक घंटे पहले अंधेरे में रखें।

6) पूरे माउंट अंडाशय ऊतक पर 3 डी मछली

  1. निम्नलिखित बफर ए मिक्स तैयार करें:
    60 एमएमएम केसीएल
    15 एमएमएल एनएसीएल
    0.5 mM शुक्राणु
    0.15 m शुक्राणु
    2 एमएम एडटा
    0.5 m EGTA
    15 एमएमएल पाइप
  2. कवरस्लिप के आकार से मेल खाने के लिए एक वर्ग पैटर्न में नेलपॉलिश की एक परत जोड़कर परमाणु दृश्य के लिए स्लाइड तैयार करें। यह भविष्य में कवरस्लिप पर रखने पर नाभिक के स्क्वैशिंग को रोकने के लिए एक उठाया सतह बनाता है।
  3. क्रिस्टोफर के चरण 3 महिलाओं से ताजा अंडाशय विच्छेदन और 0.5% डिजॉनिन के साथ 150-250 माइक्रोन बफर ए के समाधान में रखें। कूप झिल्ली को नष्ट करने के लिए रोम पर बड़ा विच्छेदन सुई (0.5% डिजोनिन के साथ बफर ए के साथ ट्यूब में) चलाएं।
  4. रोम को और परेशान करने के लिए 5-10 मिनट के लिए भंवर। ~500 क्रांतियों प्रति मिनट (आरपीएम) की सबसे कम सेटिंग में 30 सेकंड के लिए किसी भी बड़े कूप टुकड़े और अपकेंद्रित्र ट्यूब को कुरेदें। एक नए 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब के लिए सुपरनैंट स्थानांतरित करें, और 5-7 बार के बीच बफर ए रिपीट चरण 6.3 के 100 माइक्रोन जोड़ें, जब तक कि दृश्य ऊतक छोटे कणों में न टूट जाए।
  5. 2,000 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए दोनों ट्यूबों स्पिन। दोनों ट्यूबों में सुपरनैंट त्यागें। नोट: दोनों ट्यूबों का उपयोग अंतिम परमाणु दृश्य स्लाइड बनाने के लिए किया जाएगा। एकत्र सुपरनैक्टेंट के साथ ट्यूब में मुख्य रूप से निकाले गए नाभिक होना चाहिए, जबकि ऊतक के साथ मूल ट्यूब में नर्स कोशिकाओं में एम्बेडेड ऊतक और नाभिक का मिश्रण होगा। बफर ए के 200 माइक्रोन जोड़ें - 0.1% ट्राइटन और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। 10,000 आरपीएम (10,621 x G) पर 5 मिनट सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट निकालें।
  6. पीबीएस में 200 माइक्रोन 4% पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़ें। 30 मिनट के लिए थर्मोमिक्सर में इनक्यूबेट, 450 आरपीएम पर मिश्रण। 5,000 आरपीएम (2,655 x G) पर सेंट्रलाइज 5 मिनट और सुपरनैंट निकालें। थर्मोमिक्सर में 450 आरपीएम पर मिश्रण, 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन के साथ बफर ए के साथ धोएं। सेंट्रलाइज 5 मिनट पर 5,000 आरपीएम (2,655 जी) और सुपरनैंट निकालें।
  7. ट्यूब के लिए 37 डिग्री सेल्सियस लेबल जांच पर पूर्व गरम जोड़ें। थर्मोमिक्सर में 95 डिग्री सेल्सियस पर, 450 आरपीएम पर मिश्रण, 10 मिनट के लिए। निरंतर मिश्रण के साथ 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर डेनैचेशन जारी रखें। थर्मोमिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 450 आरपीएम के साथ रात भर मिला। 5,000 आरपीएम (2,655 x G) पर सेंट्रलाइज 5 मिनट। सुपरनिट निकालें।
  8. 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन के साथ बफर ए के साथ धोएं। 5,000 आरपीएम (2,655 x G) पर सेंट्रलाइज 5 मिनट। 2 बार दोहराएं। DAPI के साथ लम्बा विरोधी फीका की बूंद लागू करें।
  9. नाभिक/DAPI समाधान को ध्यान से (बुलबुले से बचना) को पिप्ट करें, स्लाइड पर लागू करें, और कवरस्लिप के साथ कवर करें।

Representative Results

चित्रा 1 इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल के समग्र प्रवाह-माध्यम का वर्णन करता है।  उपयोगकर्ता शुरू में झिल्ली स्लाइड से गुणसूत्र डीएनए नमूनों माइक्रोडिसेक्टिंग द्वारा शुरू होता है ।  माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री निकाली जाती है और शुद्ध की जाती है। शुद्ध डीएनए तो परिलक्षित, फिर से परिलक्षित, लेबल, और फिर मछली के लिए इस्तेमाल किया गुणसूत्र फैलता लेबल है ।

एलसीएम प्रोटोकॉल को तीन समग्र चरणों में तोड़ा जा सकता है: 1) ब्याज के गुणसूत्रों को ढूंढना और इस क्षेत्र को काटने के लिए तैयार करना(चित्रा 2A),2) लेजर(चित्रा 2B) और 3)के माध्यम से ब्याज के गुणसूत्र क्षेत्र को काटने और गुलेल करना, और 3) यह निर्धारित करने के लिए जांच करना कि क्या नमूना वास्तव में चिपकने वाली टोपी(चित्रा 2C)में पहुंचाया गया है। 1 गैम्बिया सुआ स्ट्रेन पॉलीटीन क्रोमोसोम्स पर इस्तेमाल होने वाली एलसीएम की प्रक्रिया वीडियो 1 में दिखाई गई है। वीडियो प्रोग्राम स्टार्ट अप से पूरी प्रक्रिया का विवरण देता है, जिसमें महत्वपूर्ण सॉफ्टवेयर कार्य और सुझाव शामिल हैं।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले जीनोमप्लेक्स और रिपली-जी एकल सेल डब्ल्यूजीए किट उत्पाद आकार के साथ-साथ समग्र उपज में बहुत भिन्न होते हैं।  चित्रा 3 से पता चलता है कि जैल इलेक्ट्रोफोरेसिस के परिणाम जीनोमप्लेक्स और रिपली-जी किट के लिए भाग गए, साथ ही नैनोड्रॉप द्वारा नमूनों की मात्राकरण भी।

मछली जांच बनाने के लिए माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री का उपयोग किया गया है जो गुणसूत्र के यू गुणसूत्र क्षेत्रों को लक्षित करता है।  चित्रा 4 एक गाम्बियाके पॉलीटीन गुणसूत्रों पर माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से उत्पन्न पांच जांचों की मछली को दर्शाता है ।  चार ऑटोसोमल हथियारों को WGA3 किट का उपयोग करके तीन फ्लोरोफोरस के साथ लेबल किया गया था: 3आर गुणसूत्र हरे रंग (फ्लोरोसीन) में लेबल किया गया है, 3L गुणसूत्र लाल (Cy-3) और पीले (Cy-5) के मिश्रण में है, 2R गुणसूत्र पीले (Cy-5) में है, और 2L गुणसूत्र लाल (Cy-3) में है। एक्स गुणसूत्र एक अलग प्रयोग में REPLI-जी सामग्री के निक अनुवाद का उपयोग कर नारंगी (Cy-3) में लेबल किया गया था । पॉलीटेन और माइटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक भागों के बीच पत्राचार स्थापित करने के लिए, गुणसूत्र पेंट को इंटरफेज, प्रोफैसे, प्रोमेटाफेज और मेटाफेज क्रोमोसोम्स ऑफ ए गाम्बिया (चित्रा 5)के लिए संकरित किया गया है।  कोशिका नाभिक में एक पॉलीटीन गुणसूत्र हाथ के 3 डी संगठन की कल्पना करने के लिए, पूरे माउंट फिश को ए. गैम्बिया सुआ स्ट्रेन ओवेरियन नर्स कोशिकाओं (वीडियो 2) पर किया गया था।  अंतरप्राज(चित्रा 5D)और पॉलीटीन (वीडियो 2) गुणसूत्रों के साथ नाभिक में विशिष्ट गुणसूत्र हाथ क्षेत्रों को स्पष्ट रूप से देखा जाता है।

Figure 1
चित्रा 1. गुणसूत्र पेंट की तैयारी की ओर प्रायोगिक प्रक्रियाओं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। गुणसूत्र माइक्रोडिसेक्शन में प्रमुख कदम। ए) झिल्ली के माध्यम से ब्याज के गुणसूत्र क्षेत्र की लेजर सहायता प्राप्त काटने। ख) गुलेल के बाद एक छेद के साथ झिल्ली किया जाता है । ग) चिपकने वाली टोपी से जुड़े इसमें एक गुणसूत्र खंड के साथ झिल्ली के गुलेल टुकड़े का दृश्य । यह तीर एक्स क्रोमोसोम के हेट्रोक्रोमेटिन को इंगित करता है जो स्लाइड पर बना हुआ था। तारक एक और गुणसूत्र का एक टुकड़ा दिखाता है जो स्लाइड पर बना रहा । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। Agarose जेल छवियों WGA के बाद डीएनए दिखा । ए) WGA4 और WGA3 जीनोमप्लेक्स किट का उपयोग करने के बाद हाथ 3R से कम आणविक वजन (200-500 बीपी) डीएनए । B) रिपली-जी प्रवर्धन के बाद आर्म 2L से उच्च आणविक वजन (10-20 केबी) डीएनए। 100 बीपी सीढ़ी बाईं गलियों में दिखाई गई है। जेल छवियों के नीचे टेबल नैनोड्रॉप द्वारा मापा डीएनए सांद्रता दिखाते हैं । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4. माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से उत्पन्न चार जांचों का उपयोग करके ए. गैम्बिया की ओवेरियन नर्स कोशिकाओं से पॉलीटीन गुणसूत्रों की चित्रकारी। एक्स गुणसूत्र को नारंगी (Cy-3) में REPLI-g सामग्री के निक-अनुवाद द्वारा लेबल किया गया है। 2आर आर्म पीले रंग (Cy-5) में लेबल किया गया है; 2L हाथ लाल (Cy-3) में है; 3R हाथ हरे रंग में लेबल है (फ्लोरोसेइन); 3L हाथ लाल (Cy-3) और पीले (Cy-5) के मिश्रण में लेबल है। ऑटोसोम्स को WGA3 प्रवर्धन किट के साथ लेबल किया गया है। क्रोमेटिन नीले रंग (DAPI) में दाग है। क्रोमोसोम नाम टेलोमेरिक क्षेत्रों के पास रखे जाते हैं। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। WGA3 द्वारा लेबल किए गए माइक्रोडिसेक्टेड सामग्री से उत्पन्न तीन जांचों का उपयोग करके ए. गाम्बिया मोप्ती तनाव के लार्वा कल्पित डिस्क से इंटरफेज (ए), प्रोफैसे (बी), प्रोमेटाफेज (सी) और मेटाफेज (डी) गुणसूत्रों की पेंटिंग। 2आर आर्म हरे रंग (फ्लोरोसीइन) में लेबल किया गया है; 2L हाथ अवेलेबल है; 3R हाथ गुलाबी रंग में है, लाल (Cy-3) और नारंगी (Cy-5) का मिश्रण; 3L हाथ नारंगी (Cy-5) में लेबल है। एक्स गुणसूत्र में 18S rDNA जांच के अनुरूप एक लाल लेबल है। क्रोमेटिन नीले रंग (DAPI) में दाग है। गुणसूत्रों के चमकीले दाग वाले क्षेत्र हेट्रोक्रोमोटिन के अनुरूप होते हैं। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1. एएन गाम्बिया पॉलीटीन गुणसूत्रों की एलसीएम की प्रक्रिया। वीडियो 1 देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2. पूरे माउंट 3 डी मछली एक gambiae अंडाशय नर्स कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया । जांच Cy-3 में लेबल है (नीले रंग में चित्रित) और एक माइक्रोडिसेक्टेड 2R गुणसूत्र हाथ से किया गया था ।  क्रोमेटिन को डीएपीआई से दाग दिया गया था और इसे सियान छद्म रंग (हल्के नीले) द्वारा चित्रित किया गया है। वीडियो 2 देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

माइक्रोडिसेक्टेड पॉलीटीन गुणसूत्र नमूनों से डीएनए को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए कई कदम महत्वपूर्ण हैं । प्रोटोकॉल एलसीएम के उपयोग को नियोजित करता है, एक विधि जो दोनों समग्र दक्षता बढ़ाती है और नमूने के साथ भौतिक उपकरणों की बातचीत को हटाकर विदेशी डीएनए के संपर्क को कम करती है। हालांकि, विदेशी डीएनए का प्रवर्धन अभी भी इस प्रयोग का सबसे बड़ा संभावित नुकसान है । इस प्रकार, पूरी प्रक्रिया के दौरान, नमूनों को संदूषण से संरक्षित रखना आवश्यक है। स्लाइड तैयारी और माइक्रोडिसेक्शन चरणों के दौरान, इथेनॉल धोने विच्छेदन सुई, स्लाइड, कवर स्लिप, साथ ही कार्यक्षेत्र के लिए आवश्यक है।  उपयोग से पहले सभी लागू उपकरणों (सुई, स्लाइड, कवरलिप) का इलाज करने की सलाह भी दी जाती है।

विच्छेदन स्लाइड पर झिल्ली गुणसूत्रों का प्रसार बहुत मुश्किल बना देती है।  इन स्लाइडों को बनाते समय अंडाशय (अंडाशय की एक पूरी जोड़ी के लिए आधा) का अधिक उपयोग करना महत्वपूर्ण है, ताकि एक अच्छी तरह से फैलने वाले नाभिक को खोजने का अधिक मौका मिल सके।  स्लाइड बनाते समय ताजा ऊतक का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है, क्योंकि प्रवर्धन दर ऊतकों की उम्र 49 और गुणसूत्र फैलने के रूप में गिरने लगती है।  माइक्रोडिसेक्शन के लिए स्लाइड्स तैयार करना इस प्रोटोकॉल में सबसे ज्यादा समय लेने वाला कदम है।  अवांछित सामग्री के आकस्मिक अधिग्रहण से बचने के लिए गुणसूत्रों को अच्छी तरह से फैलाया जाना चाहिए।  गिम्सा धुंधला उपयोगकर्ता माइक्रोडिसेक्शन सिस्टम का उपयोग करने से पहले एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के साथ प्रसार गुणवत्ता की जांच करने की अनुमति देता है।

माइक्रोडिसेक्शन और प्रवर्धन का संयोजन ब्याज के छोटे क्षेत्रों से लेकर अधिकांश हथियारों तक आकार में रंगीन टुकड़ों को निकालने और विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है।  यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को अमोर्फोलॉजिकल रूप से अलग क्षेत्रों जैसे इनवर्स, विशिष्ट यूक्रोमैटिक बैंड और इंटरबैंड, टेलोमेरिक, सेंट्रोमेरिक और इंटरकैलेरी हेट्रोक्रोमेटिन से डीएनए प्राप्त करने की अनुमति देता है। उपयोगकर्ता उत्पन्न पेंटिंग जांच को विशेष लोकी पर अंतर-प्रजाति होमोलॉजी का अध्ययन करने, या एक अक्षुण्ण 3 डी नाभिक में गुणसूत्रों के स्थानिक संगठन की विशेषता के लिए उत्पन्न पेंटिंग जांच लागू कर सकता है। गुणसूत्र पेंट विकसित करने के लिए, हमने कई गुणसूत्र क्षेत्रों के साथ दोहराव वाले डीएनए के संकरण से बचने के लिए यूक्रोमैटिक सेगमेंट का चयन किया। नतीजतन, हमने कुल जीनोमिक डीएनए या सी0 टी-1डीएनए अंश की तरह एक प्रतियोगी का उपयोग किए बिना हाथ-विशिष्ट पेंटिंग प्राप्त की।

हमने समीक्षाओं के आधार पर जीनोमप्लेक्स डब्ल्यूजीए और रिपली-जी किट का उपयोग करने का फैसला किया जो कई प्रवर्धन किट 40,44की दक्षता और ड्रॉपआउट दर की तुलना में करता है।  दोनों किट दोनों ड्रॉप आउट दर में उपलब्ध तरीकों के बीच सबसे अच्छा प्रदर्शन किया (जीनोमप्लेक्स REPLI-जी के ३७.५%) और प्रवर्धित मार्कर का प्रतिशत (जीनोमप्लेक्स में 45.24% प्रवर्धन दर बनाम रिपली-जी की 30.0%) 40. जीनोमप्लेक्स किट ने डीएनए की अधिक मात्रा भी प्रदान की, और इस प्रकार इसे कई डाउनस्ट्रीम तकनीकों के लिए एक बेहतर उम्मीदवार बना दिया।  जीनोमप्लेक्स प्रणाली के लिए एक पुनः प्रवर्धन किट भी उपलब्ध है, जो डीएनए के आगे प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रवर्धन सही नहीं है।  संभावना यह है कि सफल प्रवर्धन त्रुटियों को पेश कर सकता है या लक्ष्य डीएनए में विशिष्ट लोकी की ओर पूर्वाग्रह हो सकता है। उपलब्ध जीनोम प्रवर्धन विधियों के अंतिम टुकड़े आकार पर विचार करना महत्वपूर्ण है।  जीनोमप्लेक्स विखंडन 200-500 बीपी से लेकर टुकड़ों के साथ एक पुस्तकालय में परिणाम है, जबकि REPLI-जी किट आकार में लगभग 10-20 किलोलीटर टुकड़े पैदा करता है । इस प्रोटोकॉल का इरादा डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन मछली है, इस प्रकार जीनोमप्लेक्स किट को अधिक व्यवहार्य विकल्प बना रहा है, क्योंकि इसने वांछित टुकड़ा आकार और WGA के माध्यम से सीधे डीएनए टुकड़ों को लेबल करने की क्षमता प्रदान की है। REPLI-g प्रवर्धन द्वारा उत्पादित लंबे डीएनए अणुओं को डाउनस्ट्रीम निक-अनुवाद लेबलिंग प्रतिक्रिया में खंडित किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल को एक पॉलीटीन गुणसूत्र बांह से डीएनए को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया गया है।  अन्य प्रोटोकॉल ों मेंनमूना 7, 11 ,28,40 को सफलतापूर्वक बढ़ाने के लिए कई (आमतौर पर10-30)गुणसूत्र के टुकड़ों की पूलिंग की आवश्यकता होती है।  यद्यपि हमारी विधि का उपयोग करके कई गुणसूत्रों का पूलिंग संभव है, लेकिन नमूना संदूषण की बढ़ी हुई संभावना संभव के रूप में कुछ गुणसूत्रों के साथ प्रयोग शुरू करने के महत्व पर जोर देती है। यदि पॉलीटेन गुणसूत्र उपलब्ध नहीं हैं, तो हमारे प्रोटोकॉल को माइटोटिक गुणसूत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, सफल मछली11 के लिए प्रवर्धन से पहले 10-15 माइटोटिक गुणसूत्रों को पूल करना आवश्यक हो सकता है। शुरू टेम्पलेट डीएनए 50की उच्च मात्रा के साथ प्रवर्धन पूर्वाग्रह कम है। पॉलीटेन गुणसूत्र एक डीएनए अनुक्रम की लगभग 512 प्रतियां और दो समरूप डीएनए अनुक्रमों की 1024 प्रतियां प्रदान करते हैं।  इस प्रकार, माइटोटिक गुणसूत्रों को एकत्र करने से प्रवर्धन के बाद डीएनए उत्पाद की समग्र गुणवत्ता बढ़ाने में मदद मिलेगी।

इस प्रक्रिया में साइटोजेनेटिक और जीनोमिक अध्ययन में कई संभावित उपयोग होते हैं। यहां, हमने गुणसूत्र पेंट का उपयोग एक गाम्बियामें पॉलीटेन और मिटोटिक गुणसूत्र हथियारों के यूक्रोमैटिक खंडों के बीच पत्राचार स्थापित करने के लिए किया। एक ही पेंटिंग जांच को ए. गैम्बिया सेल लाइनों के साइटोजेनेटिक लक्षण वर्णन पर लागू किया जा सकता है। गुणसूत्र संख्या में व्यापक जीनोमिक पुनर्व्यवस्था और परिवर्तन कोशिका रेखाओं की सामान्य विशेषताएं हैं 51,52. विभिन्न मच्छर कोशिका लाइनों 53,54में एन्यूप्लाइडी, पॉलीप्लाइडी, और गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था जैसे ट्रांसलोकेशन, इनर्स्पर्स, विलोपन, विलोपनऔररिंग गुणसूत्रों का पता लगाया गया है। शास्त्रीय साइटोजेनेटिक अवलोकन 55 और भौतिक मानचित्रण 56 ने मलेरिया मच्छरों के विकास में पूरे हाथ के गुणसूत्र ट्रांसलोकेशन की घटना का प्रदर्शन किया है। इसलिए, प्रजातियों के बीच गुणसूत्र क्षेत्रों की होमोलॉजी की तुलना करने के लिए मछली प्रयोगों के साथ सूक्ष्मडिस्दाित सामग्री का उपयोग किया जा सकता है। हमने पूरे माउंट ओवेरियन नर्स कोशिकाओं में पॉलीटीन गुणसूत्रों पर 2आर-पेंटिंग जांच के साथ 3डी फिश को सफलतापूर्वक अंजाम दिया। इस विधि से गुणसूत्र प्रक्षेप पथों का पता लगाने और एनोफेल्समें परमाणु वास्तुकला का अध्ययन करने में मदद मिलेगी । डीएनए जेनोटीपिंग 57,58,अगली पीढ़ी के जीनोम अनुक्रमण 26,27,भौतिक और लिंकेज मानचित्र विकास, और गुणसूत्र पेंटिंग 33,59 के लिए जांच की उत्पादन जैसी तकनीकें सभी हाथ और क्षेत्र-विशिष्ट माइक्रोडिसेक्शन से लाभान्वित हो सकती हैं। एलसीएम प्रौद्योगिकी के संयोजन और एकल सेल WGA को आगे बढ़ाने के द्वारा, हम एक पॉलीटीन गुणसूत्र हाथ से डीएनए की उचित मात्रा के उत्पादन के लिए एक कुशल, व्यावहारिक विधि प्रदर्शित करते हैं ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से मिलने वाले अनुदान का समर्थन मिला 1R21AI094289 इगोर वी शाराखोव को

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Scientific A491-212
Methanol Fisher Scientific A412-4
Propionic acid  Sigma-Aldrich 402907
Membrane slides 1.0 PET Zeiss 415190-9051-000
Buffer tablets “GURR” Life Technologies 10582-013
KaryoMAX Giemsa Stain Life Technologies 10092-013
ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System Abbott Molecular 30-144110
Vacufuge vacuum concentrator Eppendorf 22820001
Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000 Fisher Scientific 11-992-89
Thermo Scientific NanoDrop Fisher Scientific ND-2000
REPLI-g Single Cell Kit Qiagen 150343
GenomePlex Single Cell Kit (WGA4) Sigma-Aldrich WGA4-10RXN
GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3) Sigma-Aldrich WGA3-50RXN
MZ6 Leica stereomicroscope Leica VA-OM-E194-354 A different stereomicroscope can be used
Olympus CX41 Phase Microscope Olympus CX41RF-5 A different phase microscope can be used
PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope Zeiss
Thermomixer Eppendorf 22670000
10x PBS Invitrogen P5493
50x Denhardt’s solution Sigma-Aldrich D2532
99% Formamide Fisher Scientific BP227500
Dextran sulfate sodium salt Sigma D8906
20x SSC buffer Invitrogen AM9765
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Fermentas R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP GE Healthcare PA53022, PA55022
BSA Sigma-Aldrich A3294
DNA polymerase I Fermentas EP0041
DNase I  Fermentas EN0521
Spermine Sigma-Aldrich S3256-1G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-1G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP3581
EGTA Sigma-Aldrich E0396-25G
PIPES Sigma-Aldrich P6757-25G
EDTA Fisher Scientific S311-500
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Triton-X100 Fisher Scientific BP151-100
AdhesiveCap 500 clear Zeiss 415190-9211-000
QIAamp DNA Micro Kit (50) Qiagen 56304
Genomic DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4010
37% Paraformaldehyde Fisher Scientific F79-500

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