Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

2D- og 3D-kromosommaleri i malariamygg

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/51173
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Entomology, Virginia Tech

Summary

Kromosommaleri er en nyttig metode for å studere organisering av cellekjernen og utviklingen av karyotypen. Her demonstrerer vi en tilnærming for å isolere og forsterke spesifikke interesseområder fra enkeltpolytenkromosomer som senere brukes til to- og tredimensjonal fluorescerende in situ hybridisering (FISH).

Abstract

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) av hele arm kromosom sonder er en robust teknikk for å kartlegge genomiske regioner av interesse, oppdage kromosomale omorganiseringer, og studere tredimensjonal (3D) organisering av kromosomer i cellekjernen. Fremveksten av laserfangstmikrodisseksjon (LCM) og hel genomforsterkning (WGA) gjør det mulig å skaffe store mengder DNA fra enkeltceller. Den økte følsomheten til WGA-settene fikk oss til å utvikle kromosommaling og bruke dem til å utforske kromosomorganisasjon og evolusjon i ikke-modellorganismer. Her presenterer vi en enkel metode for å isolere og forsterke de eukromatiske segmentene av enkelt polytene kromosomarmer fra eggstokksykepleierceller av den afrikanske malaria mygg Anopheles gambiae. Denne prosedyren gir en effektiv plattform for å skaffe kromosommaling, samtidig som den reduserer den totale risikoen for å introdusere utenlandsk DNA til prøven. Bruken av WGA tillater flere runder med reforsterkning, noe som resulterer i høye mengder DNA som kan brukes til flere eksperimenter, inkludert 2D og 3D FISH. Vi demonstrerte at de utviklede kromosommalingene med hell kan brukes til å etablere korrespondansen mellom eukromatiske deler av polytene og mititotiske kromosomarmer i An. gambiae. Samlet sett gir foreningen av LCM og enkeltkromosom WGA et effektivt verktøy for å skape betydelige mengder mål-DNA for fremtidige cytogenetiske og genomiske studier.

Introduction

Kromosommaling er en nyttig teknikk for å studere utviklingen av karyotyper 1-5 og for å visualisere cytogenetiske abnormiteter via hybridisering av fluorescerende merket kromosomalt DNA 1,6-8. Denne metoden brukes også til å studere 3D-dynamikken i kromosomområder i utvikling 9 og patologi 10. Differensialt merkede kromosommaling brukes til visualisering av individuelle mititotiske 11,12, meiotiske 13,14eller interfase ikke-polytene 15,16 og polytenen 9,11,17 kromosomer. En enkel og robust protokoll for å oppnå kromosommaling ville være svært nyttig for å utvide denne teknikken til ikke-modellorganismer, for eksempel mygg. Anopheles gambiae komplekset er en gruppe på syv morfologisk uutslettelige mygg som varierer i oppførsel og tilpasning, inkludert evnen til å overføre malaria.  Disse myggene tjener som en utmerket modell for bedre å forstå utviklingen av nært beslektede arter som varierer sterkt i deres vektorkapasitet.  De fleste cytogenetiske studier i malaria mygg har blitt gjort ved hjelp av velutviklede, svært polyteniserte kromosomer (gjennomgått i 18,19). De lesbare bandingmønstrene til polytene kromosomer tillot forskere å demonstrere sammenhengen mellom polymorfiske inversjoner og økologiske tilpasninger i Anopheles gambiae 20. Også vevsspesifikke 21 og artsspesifikke 22 trekk ved 3D polytene kromosomorganisasjon har blitt karakterisert i An. macullipennis-komplekset. Studier av mititotiske kromosomer kan imidlertid gi ytterligere viktig informasjon. For eksempel har et høyere nivå av heterokromatinpolymorfisme observert i mititotiske kromosomer blitt korrelert med redusert parringsaktivitet og fruktbarhet i An. gambiae 23. Korrespondansen mellom eukromatiske segmenter av polytene og mititotiske kromosomarmer kan være vanskelig å etablere bare ved å sammenligne deres relative lengder. Dette skyldes at heterokromatin utgjør en betydelig del av mitotiske kromosomer, men er underrepresentert i polyfinkromosomer 24. Tilgjengeligheten av kromosommaling for malaria mygg ville tillate forskere å utvide cytogenetiske studier betydelig ved å inkludere flere arter, samtidig som de betydelig reduserer kostnadene og tiden i analysene av karyotypisk evolusjon og 3D-dynamikk av kromosomer i denne gruppen epidemiologisk viktige insekter.

For å oppnå store strekninger av kromosomer har mikrodeseksjon blitt en integrert teknikk for å manipulere og isolere spesifikke interesseregioner av kromosomal komplement.  Kombinert med full genomforsterkning (WGA) resulterer mikrodeseksjon i kraftige nedstrømsapplikasjoner, inkludert FISH 11,12 og neste generasjons genomsekvensering 25-27. Tidligere krevde teknikken bruk av spesialiserte mikrodesisseksjonsnåler som måtte kontrolleres manuelt av en erfaren bruker 28.  Fremrykningen av laserfangstmikrodisseksjon (LCM) har resultert i et forenklet verktøy som er bedre egnet for å isolere enkeltceller 29,30 eller individuelle kromosomer 31-33 med redusert risiko for forurensning. Denne tilnærmingen lar brukeren studere de genetiske heterogeniteter og kromosomale abnormiteter som forekommer i enkeltceller, i stedet for et konsensuslandskap som skyldes sammenslåing av flere celler sammen 34-36. Flere metoder har blitt brukt til å forsterke DNA-et som produseres fra mikrodesisseksjon.  DOP-PCR, en teknikk som er nyttig for forsterkning av svært repeterende sekvenser, har blitt brukt til å forsterke mikrodisserte kromosomer fra arter, inkludert gresshopper 37, spiny ål 38og Nile tilapia 39.  Mer nylig har det PCR-baserte GenomePlex WGA4 Single Cell-settet og multippel forskyvningsforsterkningsbasert (MDA) Repli-G Single Cell kit blitt verdifulle verktøy for eksperimenter som involverer genetisk analyse av enkeltmenneskeceller samt kromosomer40-42, inkludert B-kromosomsystemene i gresshopper 37 og gresshopper 43. Disse to settene har hver fordeler og ulemper, men deres tilsynelatende overlegenhet over andre tilgjengelige forsterkningssystemer har blitt demonstrert 44.

Mengden DNA som kan fås fra et enkelt kromosom eller et kromosomsegment er betydelig mindre enn for en hel kjerne. Derfor er mikrodeseksjon, forsterkning og etterfølgende analyse av et enkelt kromosom langt mer utfordrende, spesielt i organismer med små genomer som i Drosophila eller Anopheles.  Selv om maling er utviklet fra enkelt mikrodisserte kromosomer av et menneske 33 og en veps 45, krevde et vellykket FISH-eksperiment flere (minst 10-15) mikrodisserte mitotiske kromosomer av en fruktflue 11. Imidlertid vil evnen til å mikrodissektere og forsterke et enkelt kromosom være viktig for (i) å redusere sjansen for forurensning med materiale fra et annet kromosom, (ii) minimere antall kromosomale preparater som trengs for mikrodisseksjon, (iii) senke nukleotid og strukturell polymorfisme av den mikrodissifiserte prøven i både FISK og sekvensering av nedstrømsapplikasjoner. Polytene kromosomer som finnes i mange dipteranske arter gir en unik mulighet til å skaffe seg en mye høyere startmengde av DNA. De gir også en høyere oppløsning og kromosomstruktur som ikke kan oppnås ved bruk av mitotiske kromosomer. Denne ekstra oppløsningen kan være avgjørende for å visualisere kromosomale omorganiseringer, kromatinstruktur og kromosomale segmenter som skal mikrodisserte 28,46.

Her presenterer vi en prosedyre for effektivt å isolere et eukromatisk segment fra en enkelt polytenkromosomarm, forsterke DNA og bruke det i nedstrøms FISKEapplikasjoner i malaria mygg.  Først bruker vi LCM for å isolere og trekke ut en enkelt kromosomarm fra spesiallagde membransklier. For det andre brukes WGA til å forsterke DNA-et fra det mikrodisserte materialet. For det tredje hybridiserer vi det forsterkede DNA-et i FISH-eksperimenter til polytene squashpreparater 47, metafase og interfasekromosom lysbilder 48, samt 3D ovarial hele monteringsprøver. Denne prosedyren er gjort for å kunne male et flertall av eukromatin i kromosomale armer av An. gambiae.

Protocol

1) Polytene kromosom lysbilde forberedelse for laser fange mikrodissection

  1. Dissekere halv-gravid Anopheles kvinner ved 25 timers post-blod fôring. Fest eggstokkene fra omtrent fem kvinner til 500 μl fersk modifisert Carnoys løsning (100% metanol: issyre, 3:1) ved romtemperatur i 24 timer. Overfør eggstokkene til -20 °C for langtidslagring.
  2. Forbered Carnoys løsning (100% etanol: iseddiksyre, 3:1) og 50% propionsyre like før du lager kromosomskred.
  3. Plasser ett par eggstokkene i en dråpe Carnoys løsning på en Zeiss 1.0 PET membransklie. Avhengig av størrelsen, del eggstokkene i ca 2-4 seksjoner med dissekering nåler og legg dem i en dråpe på 50% propionsyre på rene lysbilder under et disseksjonsmikroskop.
  4. Skill follikler og fjern gjenværende vev ved hjelp av papirhåndkle under et disseksjon stereomikroskop. Tilsett en ny dråpe 50% propionsyre til folliklene og la dem sitte i 3-5 min ved romtemperatur.
  5. Plasser en silikonisert deksle på toppen av dråpen. La skredet stå i ca. 1 min.
  6. Dekk lysbildet med et absorberende materiale (filterpapir brukes til denne metoden), og mens du bruker viskelærsiden av en blyant, bruk en sjenerøs mengde trykk på dekslene ved å trykke på den gjentatte ganger med viskelæret.
  7. Varm opp sklien til 60 °C på et glidendemetnings-/hybridiseringssystem i 15-20 min for å hjelpe til med å flate ut polytenkromosomene. Plasser sklier inn i et fuktig kammer ved 4 °C over natten for å la syren flate ut kromosomene ytterligere.
  8. Plasser sklier i kaldt 50% etanol i 10 min. Fjern forsiktig dekslene, og erstatt i kaldt 50% etanol i 10 minutter til.
  9. Dehydrere lysbilder i 70%, 90%, 100% etanol i 5 min hver. Lufttørk sklier.
  10. Forbered en løsning av GURR bufferløsning ved å legge til en enkelt buffertablett til 1 L destillert vann. autoklav.
  11. Forbered Giemsa-løsningen ved å tilsette 1 ml Giemsa fargingsoppløsning til 50 ml GURR-buffer.
  12. Plasser lufttørkede sklier i Giemsa-oppløsning i 10 min og vask tre ganger i 1X PBS. Lufttørk glir igjen i et kontrollert sterilt klima for å unngå forurensning.

2) Laserfangst mikrodesisseksjon av en enkelt polytenkromosomarm

Denne delen beskriver bruken av PALMRobo-programvaren, som følger med PALM MicroBeam Laser Microdissection-systemet.

  1. Rengjør mikroskopet med 100% etanol. Steriliser hansker og rør med UV-lys i en UV-krysskobling.
  2. Slå på PALM MicroBeam Laser Microdissection-mikroskopet og slå på laseren. Åpne laser disseksjonspakken, PALMRobo, og konfigurer innstillingene "Power" og "Focus" etter behov.
  3. Søk etter polytene kromosomarm av interesse.
  4. Bruk blyantverktøyet til å disponere det valgte området.
  5. Åpne "Elements window" fra menylinjen.
  6. Velg tegnet element, sørg for at du har valgt Klipp ut.
  7. Monter det selvklebende hetterøret i holderen og plasser over lysbildet, og la et lite gap <1 mm i størrelse, og start laserkuttet.
  8. Plasser "Catapult-merket" på det kuttede nettstedet, og la det være plass mellom kanten og kromosomet.
  9. Velg "LPC" fra rullegardinmenyen og begynn å katapultere.
  10. Kontroller at prøven ble katapultert i hetten ved å trykke på "Eye" -ikonet.

3) Rensing av DNA fra en enkelt mikrodissektert polytenkromosomarm

Følg instruksjonene i QIAamp DNA Micro Kit for å frigjøre og rense det innsamlede DNA-et. Trinn 3.1 ble modifisert for å imøtekomme det omvendte røret.

  1. Tilsett 15 μl Buffer ATL og 10 μl proteinase K til det inverterte røret (inne i hetten) og inkuber ved 56 °C i 3 timer.
  2. Legg til 25 μl buffer ATL, 50 μl buffer AL og 1 μl bærer RNA; blanding. Tilsett 50 μl 100% EtOH; blande.
  3. Overfør lysate til QIAamp kolonne; sentrifuge. Vask ved å legge til 500 μl buffer AW1; sentrifuge. Plasser kolonnen i nytt oppsamlingsrør, legg til 500 μl buffer AW2; sentrifuge. Plasser kolonnen i et nytt rør; sentrifuge for å fjerne overflødig væske.
  4. Plasser søylen i et 1,5 μl mikrosenterrør og tilsett 20 μl vann for å elute; sentrifuge.
  5. Fordamp ferskt eluted DNA ned til et siste volum på 9 μl ved hjelp av en vakuumfuge.

4) Forsterkning av DNA fra en enkelt mikrodissektert polytenkromosomarm

To forskjellige protokoller ble brukt til WGA av en enkelt kromosomarm.

  1. DNA-forsterkning og sondeforberedelse via GenomePlex WGA
    1. Følg GenomePlex Single Cell WGA4 Kit-protokollen for å produsere den første batchen med forsterket DNA:
      1. Tilsett nylaget Proteinase K-løsning i 9 μl-prøven; inkuber DNA ved 50 °C i 1 time, og varm deretter opp til 99 °C i 4 minutter. Hold deg på isen.
      2. Legg til 2 μl 1X forberedelsesbuffer for enkeltcellebibliotek og 1 μl bibliotekstabiliseringsløsning; mix. Varm prøven til 95 °C i 2 min. Avkjøl på is og sentrifuge.
      3. Tilsett 1 μl av bibliotekets forberedelsesenzym; blanding og sentrifugering. Inkuber som følger:
        Equation 1
      4. Tilsett 7,5 μl 10X forsterkning Master Mix, 48,5 μl vann. 5.0 μl WGA DNA polymerase; blanding og sentrifugering.
      5. Termocycle som følger:
        Equation 2
    2. Rens DNA ved hjelp av Genomisk DNA Clean &Concentrator Kit. Protokollen er som følger:
      1. Tilsett 5:1 DNA-bindingsbuffer:DNA-prøve (spesielt for genomisk DNA på mindre enn 2 kB. Hvis prøve-DNA er større enn 2 kB, bruk et 2:1-forhold) og overfør til angitt spinnkolonne. sentrifuge.
      2. Tilsett 200 μl DNA-vaskebuffer og sentrifuge. Gjenta vasketrinnet. Tilsett deretter 50 μl vann og elute DNA i et nytt 1,5 ml rør.
    3. Forsterk prøve-DNA på nytt ved hjelp av GenomePlex WGA3-reamplifiseringssettet på følgende måte:
      1. Tilsett 10 μl DNA i PCR-røret (settet anbefaler 10 ng totalt DNA) med 49,5 μl vann, 7,5 μl 10x Forsterkning Master Mix, 3,0 μl 10 mM DNTP-blanding og 5,0 μl WGA DNA Polymerase. Bland og sentrifuger.
      2. Bruk følgende profil for reaksjonen:
        Equation 3
      3. Oppbevar DNA ved -20 °C.
    4. Label DNA for FISH ved hjelp av GenomePlex WGA3 Reamplification Kit som følger:
      1. Lag en master mix fra GenomePlex WGA3 Reamplification Kit ved å legge 10 μl DNA til PCR-rør med 49,5 μl vann, 7,5 μl 10X Forsterkning Master Mix, 3,0 μl 1 mM dNTP blanding (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - hvis du bruker merket dUTP), 1 μl av 25 nM merket dUTPP og 5,0 μl WGA DNA-polymerase.
      2. Bruk følgende profil for reaksjonen:
        Equation 3
      3. Etanol utfeller den merkede sonden ved å tilsette 1/10 det endelige reaksjonsvolumet (7,5 μl for 75 μl reaksjon) av 3 M natriumacetat pH 5,2 og 2-3 volumer på 100% etanol. Chill DNA prøve ved -80 °C i minst 30 min.
      4. Sentrifugeprøve ved 4 °C i 10 minutter for å lage merket pellets og fjerne supernatant og lufttørr pellets.
      5. Opprett hybridiseringsbuffer på følgende måte:
        0,2 g Dextran sulfat
        1200 μl Deionisert formamid
        580 μl H2O
        120 μl 20X SSC
      6. Tilsett 40 μl hybridiseringsbuffer til lufttørket pellets.
  2. DNA-forsterkning og sondeforberedelse via REPLI-G Single Cell WGA etterfulgt av nick-oversettelse
    1. Følg REPLI-g Single Cell WGA Kit-protokollen for å produsere det forsterkede DNA-et:
      1. Klargjør buffer D2 (3 μl 1 M DTT + 33 μl buffer DLB).
      2. Bland 4 μl renset mikro uoppdaget materiale med 3 μl buffer D2. Vi sveip røret for å blande. Inkuber i 10 min ved 65 °C. Tilsett 3 μl stoppløsning; blande.
      3. Tilsett 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g reaksjonsbuffer og 2 μl REPLI-g DNA-polymerase i prøven. Inkuber ved 30 °C i 8 timer. Inaktiver DNA-polymerase ved oppvarming til 65 °C i 3 minutter. Oppbevar DNA ved -20 °C.
    2. Følg nick oversettelsesprotokollen for å merke REPLI-g forsterket DNA:
      1. Forbered følgende etikettmiks:
        1 μg forsterket DNA
        5 μl 10X DNA polymerase buffer
        5 μl 10X dNTP
        5 μl 1X BSA
        1 μl 1 mM merket dNTP
        4 μl 1 U/μl DNase I
        1 μl 10 U/μl DNA polymerase I
        H2O til 50 μl
      2. Inkuber ved 15 °C i 2 timer. Tilsett 2 μl 0,5 M EDTA for å stoppe reaksjonen. Kontroller DNA-fragmentstørrelsen ved å kjøre på gel.
      3. Følg trinnene fra 4.1.4.3-4.1.4.6 for å utfelle og løse pellets.

5) 2D FISH på polytene og mititotiske kromosom squashpreparater

Se detaljerte protokoller for FISH om preparater av polytene squashes 47 og mitotic kromosom lysbilder 48. Her gir vi korte protokoller.

  1. FISK på polytene kromosom squashpreparater
    1. Senk lysbildene i 1X PBS i 20 min på RT. Fest lysbildene i 4 % Paraformaldehyd i 1X PBS i 1 min.
    2. Dehydreres gjennom etanolvask: 50%, 70%, 90%, 100% i 5 min hver på RT. Lufttørke lysbilder.
    3. Forvarm sonden i hybridiseringsbuffer ved 37 °C. Tilsett 10-20 μl sonde for å skyve. Deksel med 22 X 22 mm deksler. Trykk ut eventuelle luftbobler ved hjelp av en pipettespiss.
    4. Denature kromosomer og sonde ved 90 °C i 10 min. Tetningskanter av dekslerlip med gummisement. Overfør gliden til fuktig kammer og inkuber ved 39 °C over natten.
    5. Vask lysbildene med 1X SSC ved 39 °C i 20 minutter. Vask lysbildene med 1X SSC ved RT i 20 minutter. Skyll lysbildene i 1X PBS, og tilsett deretter Prolong anti-fade med DAPI. Dekk med coverlip, og oppbevar i lysbildeboks ved 4 °C i minst en time før visualisering.
  2. FISK på mitotiske kromosom squashpreparater
    1. Trekk ut mitotiske kromosomer fra imaginale plater av4. instar larve av An. gambiae.
    2. Forbered kromosomsklier som passer for FISK.
    3. Tilsett 2-3 μl merket DNA-sonde til hybridiseringsbuffer i et rør og bland forsiktig ved pipettering.
    4. Påfør 10 μl av probeblandingen på gliden og dekk med en 22 X 22 mm dekslelip. Trykk ut eventuelle luftbobler ved hjelp av en pipettespiss.
    5. For motoppnåelse og deteksjon, bruk Prolong anti-fade med DAPI på preparatet og hold deg i mørke i minst en time før visualisering.

6) 3D FISH på helmontert eggstokkvev

  1. Klargjør følgende buffer A-blanding:
    60 mM KCl
    15 mM NaCl
    0,5 mM spermidin
    0,15 mM spermin
    2 mM EDTA
    0,5 mM EGTA
    15 mM RØR
  2. Forbered lysbilder for kjernefysisk visualisering ved å legge til et lag neglepolish i et firkantet mønster for å matche størrelsen på dekslene. Dette skaper en hevet overflate for å forhindre squashing av kjerner når du plasserer på dekslerlip i fremtiden.
  3. Disseker ferske eggstokkene fra Christophers stadium 3 kvinner og hold i en løsning på 150-250 μl Buffer A med 0,5% digitonin. Kjør større disseksjonsnål over follikler (i rør med buffer A med 0,5% digitonin) for å ødelegge follikulær membran.
  4. Vortex i 5-10 min for å forstyrre folliklene ytterligere. Skrap ned store follikulære stykker og sentrifugerør i 30 sek ved laveste innstilling på ~ 500 omdreininger per minutt (RPM). Overfør supernatant til et nytt 2 ml Eppendorf-rør, og tilsett 100 μl buffer A. Gjenta trinn 6,3 mellom 5-7 ganger, til det synlige vevet er brutt inn i små partikler.
  5. Spinn begge rørene i 10 min ved 2000 RPM. Kast supernatant i begge rørene. Merk: Begge rørene vil bli brukt til å lage endelige kjernefysiske visualiseringsskred. Røret med samlet supernatant skal inneholde primært ekstrahert kjerner, mens det opprinnelige røret med vev vil inneholde en blanding av vev og kjerner innebygd i sykepleierceller. Tilsett 200 μl buffer A – 0,1 % Triton og inkuber over natten ved 4 °C. Sentrifuge 5 min ved 10 000 o/min (10 621 x G) og fjern supernatant.
  6. Tilsett 200 μl 4% Paraformaldehyd i PBS. Inkuber i thermomixer i 30 min, bland ved 450 RPM. Sentrifuge 5 min ved 5000 RPM (2655 x G) og fjern supernatant. Vask med buffer A med 0,1% Triton i 5 min, bland ved 450 RPM i thermomixer. Sentrifuge 5 min ved 5000 RPM (2655 G) og fjern supernatant.
  7. Tilsett forvarmet ved 37 °C merket sonde på røret. Denature ved 95 °C i thermomixer, blanding ved 450 o/min, i 10 min. Fortsett denaturering ved 80 °C i 15 minutter med fortsatt blanding. Inkuber ved 37 °C i thermomixer, med 450 RPM blanding over natten. Sentrifuge 5 min ved 5000 RPM (2655 x G). Fjern supernatant.
  8. Vask med buffer A med 0,1% Triton i 5 min. Sentrifuge 5 min ved 5000 RPM (2655 x G). Gjenta 2 ganger. Påfør dråpe Prolong Anti-fade med DAPI.
  9. Rør ut nuklei/DAPI-oppløsningen forsiktig (unngå bobler), påfør på skyv og dekk med deksler.

Representative Results

Figur 1 beskriver den totale gjennomflyten av protokollen som er beskrevet i denne artikkelen.  Brukeren starter i utgangspunktet med mikrodissekterende kromosom-DNA-prøver fra membranskred.  Mikro uoppdaget materiale ekstraheres og renses. Det rensede DNA-et forsterkes deretter, forsterkes, merkes på nytt og brukes deretter til FISH for å merke kromosomspredninger.

LCM-protokollen kan deles inn i tre generelle trinn: 1) Finne kromosomer av interesse og klargjøre regionen for kutting (Figur 2A), 2) Skjære og katapultere kromosomområdet av interesse via laser (Figur 2B) og 3) Kontrollere om prøven faktisk er katapultert i limhette (Figur 2C). Prosessen med LCM som brukes på An. gambiae Sua stammepolyfinkromosomer er vist i video 1. Videoen beskriver hele prosessen fra programoppstart, inkludert viktige programvarefunksjoner og tips.

GenomePlex og REPLI-g enkeltcellede WGA-sett som brukes i denne protokollen, varierer sterkt i resulterende produktstørrelse så vel som samlet utbytte.  Figur 3 viser resultatene av gelelektroforese som ble kjørt for GenomePlex- og REPLI-g-settene, samt kvantifisering av prøvene av Nanodrop.

Mikro uoppdaget materiale har blitt brukt til å lage FISH-sonder som retter seg mot eukromatiske regioner i et kromosom.  Figur 4 demonstrerer FISK av fem sonder generert fra mikro uoppdaget materiale på polytene kromosomer av An. gambiae.  Fire autosomale armer ble merket med tre fluoroforer ved hjelp av WGA3-settet: 3R-kromosomet er merket med grønt (fluorescein), 3L-kromosomet er i en blanding av rødt (Cy-3) og gult (Cy-5), 2R-kromosomet er i gult (Cy-5), og 2L-kromosomet er i rødt (Cy-3). X-kromosomet ble merket i oransje (Cy-3) ved hjelp av nick-oversettelse av REPLI-g-materialet i et eget eksperiment. For å etablere korrespondansen mellom eukromatiske deler av polytene og mititotiske kromosomarmer, har kromosommaling blitt hybridisert til interfase, profase, prometaphase og metafasekromosomer av An. gambiae (figur 5).  For å visualisere 3D-organiseringen av en enkelt polytenkromosomarm i cellekjernen, ble hele fjellet FISH utført på An. gambiae Sua stamme eggstokksykepleierceller (Video 2).  Distinkte kromosomarmområder er tydelig sett i kjerner med interfase (Figur 5D) og polyfin (Video 2) kromosomer.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk representasjon av eksperimentelle prosedyrer mot fremstilling av kromosommaling. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 2
Figur 2. De viktigste trinnene i kromosommikrodisseksjon. A) Laserassistert kutting av kromosomområdet av interesse gjennom membranen. B) Membranen med et hull etter at katapulteringen er utført. C) Utsikten over det katapulterte membranstykket med et kromosomsegment i den festet til klebehetten. Pilen indikerer heterokromatinet til X-kromosomet som forblir på lysbildet. Stjernen viser et stykke av et annet kromosom som ble igjen på lysbildet. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 3
Figur 3. Agarose gel bilder som viser DNA etter WGA. A) Lav molekylvekt (200-500 bp) DNA fra arm 3R etter bruk av WGA4- og WGA3 GenomePlex-settene. B) Høy molekylvekt (10-20 kb) DNA fra arm 2L etter REPLI-g forsterkning. 100 bp stigen vises i venstre kjørefelt. Tabellene under gelbilder viser DNA-konsentrasjoner målt ved Nanodrop. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 4
Figur 4. Maleri av polytene kromosomer fra ovariesykepleierceller av An. gambiae ved hjelp av fire sonder generert fra mikrodissektert materiale. X-kromosomet er merket med oransje (Cy-3) ved nick-oversettelse av REPLI-g-materialet. 2R-armen er merket i gult (Cy-5); 2L-armen er i rødt (Cy-3); 3R-armen er merket i grønt (fluorescein); 3L-armen er merket i en blanding av rødt (Cy-3) og gult (Cy-5). Autosomer er merket med WGA3-forsterkningssettet. Kromatin er farget i blått (DAPI). Kromosomnavn er plassert i nærheten av telomeriske regioner. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 5
Figur 5. Maleri av interfase (A), profase (B), prometaphase (C) og metafase (D) kromosomer fra larval imaginale plater av An. gambiae Mopti-stammen ved hjelp av tre sonder generert fra mikro uoppdaget materiale merket av WGA3. 2R-armen er merket i grønt (fluorescein); 2L-armen er uten etikett; 3R-armen er i rosa, en blanding av rød (Cy-3) og oransje (Cy-5); 3L-armen er merket med oransje (Cy-5). X-kromosomet har en rød etikett som tilsvarer 18S rDNA-sonden. Kromatin er farget i blått (DAPI). Sterkt fargede områder av kromosomer tilsvarer heterochromatin. Klikk her for å vise større bilde.

Video 1. Prosessen med LCM av An. gambiae polytene kromosomer. Klikk her for å se video 1.

Video 2. Hele fjellet 3D FISH utført på An. gambiae ovarie sykepleierceller. Sonden er merket i Cy-3 (avbildet i blått) og ble laget av en mikrodissektert 2R-kromosomarm.  Kromatin ble farget med DAPI og er avbildet av cyan pseudo-fargestoffer (lyseblå). Klikk her for å se video 2.

Discussion

Det er flere trinn som er avgjørende for å lykkes med å forsterke DNA fra mikrodisserte polytenkromosomprøver. Protokollen benytter bruk av LCM, en metode som både øker den generelle effektiviteten og reduserer eksponeringen for utenlandsk DNA ved å fjerne samspillet mellom fysiske verktøy og prøven. Forsterkning av utenlandsk DNA er imidlertid fortsatt den største potensielle fallgruven i dette eksperimentet. Under hele prosessen er det derfor viktig å holde prøvene beskyttet mot forurensning. Gjennom glideforberedelses- og mikrodesisseksjonsfasene er det viktig å vaske disseksjonsnåler, lysbilder, dekselslipper, samt arbeidsområdet.  Det anbefales også å UV behandle alt gjeldende utstyr (nåler, sklier, deksler) før bruk.

Membranen på disseksjonsskredene gjør spredning av kromosomene svært vanskelig.  Det er viktig å bruke mer av eggstokken (halvparten til et helt par eggstokkene) når du lager disse lysbildene, for å gi større sjanse for å finne en godt spredt kjerne.  Det anbefales også å bruke friskt vev når du lager lysbilder, da forsterkningsgraden ser ut til å falle etter hvert som vev i alderen 49 og kromosomspredning blir mer utfordrende.  Utarbeidelsen av lysbilder for mikrodisseksjon er det mest tidkrevende trinnet i denne protokollen.  Kromosomer må være godt spredt for å unngå utilsiktet oppkjøp av uønsket materiale.  Giemsa farging gjør det mulig for brukeren å sjekke spredningskvaliteten med et fasekontrastmikroskop før bruk av mikrodeseksjonssystemet.

Kombinasjonen av mikrodisseksjon og forsterkning gir mulighet til å trekke ut og analysere kromosomale fragmenter som varierer i størrelse fra små interesseregioner til et flertall av armene.  Denne protokollen gjør det mulig for brukeren å få DNA fra morfologisk forskjellige regioner som inversjoner, spesifikke eukromatiske bånd og interbands, telomerisk, sentromerisk og interkalær heterochromatin. Brukeren kan bruke de genererte malingssondene til å undersøke avvikende kromosomer, studere inter-arter homologi på bestemt loci, eller karakterisere romlig organisering av kromosomer i en intakt 3D-kjerne. For å utvikle kromosommaling valgte vi eukromatiske segmenter for å unngå hybridisering av repeterende DNA med flere kromosomale regioner. Som et resultat fikk vi arm-spesifikt maleri uten å bruke en konkurrent, som totalt genomisk DNA eller C0t-1 DNA-fraksjon.

Vi valgte å bruke GenomePlex WGA- og REPLI-G-settene basert på vurderinger som sammenlignet effektiviteten og frafallshastigheten til flere forsterkningssett 40,44.  Begge settene presterte best blant de tilgjengelige metodene i begge frafallsfrekvensen (GenomePlex hadde en rate på 12,5% sammenlignet med REPLI-gs 37,5%) og prosentandel av forsterkede markører (GenomePlex hadde en forsterkningshastighet på 45,24 % sammenlignet med REPLI-gs 30,0 %) 40. GenomePlex-settet ga også en høyere mengde DNA, og gjorde det dermed til en bedre kandidat for flere nedstrømsteknikker.  Et reforsterkningssett for GenomePlex-systemet er også tilgjengelig, noe som muliggjør ytterligere forsterkning av DNA. Det er imidlertid viktig å merke seg at forsterkning ikke er perfekt.  Muligheten er fortsatt at vellykket forsterkning kan introdusere feil eller ha en skjevhet mot spesifikk loci i målet DNA. Det er viktig å vurdere den endelige fragmentstørrelsen på de tilgjengelige genomforsterkningsmetodene.  GenomePlex fragmentering resulterer i et bibliotek med fragmenter fra 200-500 bp, mens REPLI-g-settet produserer fragmenter omtrent 10-20 kb i størrelse. Den tiltenkte nedstrøms anvendelsen av denne protokollen er FISH, noe som gjør GenomePlex-settet til et mer gjennomførbart alternativ, da det ga ønsket fragmentstørrelse og muligheten til å merke DNA-fragmenter direkte gjennom WGA. Lange DNA-molekyler produsert av REPLI-g-forsterkningen må fragmenteres i nedstrøms nick-oversettelsesmerkingsreaksjon.

Denne protokollen er tilpasset for å forsterke DNA fra en enkelt polytenkromosomarm.  Andre protokoller krever gruppering av mange (vanligvis 10-30) kromosomfragmenter for å kunne forsterke prøven 7,11,28,40.  Selv om sammenslåing av flere kromosomer er mulig ved hjelp av vår metode, understreker den økte sannsynligheten for prøveforurensning viktigheten av å starte eksperimentet med så få kromosomer som mulig. Hvis polytene kromosomer ikke er tilgjengelige, kan vår protokoll tilpasses for bruk i mititotiske kromosomer. Det kan imidlertid være nødvendig å samle 10-15 mitotiske kromosomer før forsterkning for vellykket FISH 11. Forsterkningsbias er lavere med høye mengder startmal DNA 50. Polytene kromosomer gir omtrent 512 kopier av en enkelt DNA-sekvens og 1024 kopier av to homologe DNA-sekvenser.  Dermed vil sammenslåing av mititotiske kromosomer bidra til å øke den generelle kvaliteten på DNA-produktet etter forsterkning.

Denne prosedyren har mange potensielle bruksområder i cytogenetiske og genomiske studier. Her brukte vi kromosommaling for å etablere korrespondansen mellom eukromatiske segmenter av polytene og mititotiske kromosomarmer i An. gambiae. De samme malesondene kan brukes på cytogenetisk karakterisering av An. gambiske cellelinjer. Omfattende genomiske omorganiseringer og endringer i kromosomtall er vanlige trekk ved cellelinjene 51,52. Aneuploidy, polyploidy og kromosomale omorganiseringer som translokasjoner, inversjoner, slettinger og ringkromosomer har blitt oppdaget i forskjellige myggcellelinjer 53,54. Klassiske cytogenetiske observasjoner 55 og fysisk kartlegging 56 har vist forekomsten av helarms kromosomale translokasjoner i utviklingen av malaria mygg. Derfor kan mikro uoppdaget materiale brukes sammen med FISH-eksperimenter for å sammenligne homologi av kromosomale regioner mellom arter. Vi utførte vellykket 3D FISH med 2R-maleri sonde på polytene kromosomer i hele mount ovarie sykepleierceller. Denne metoden vil lette sporing av kromosombaner og studere atomarkitekturen i Anopheles. Teknikker som DNA genotyping 57,58, neste generasjons genomsekvensering 26,27, fysisk og linkage kartutvikling, og generering av sonder for kromosommaling 33,59 alle kan dra nytte av arm- og regionspesifikk mikrodesinfeksjon. Ved å kombinere LCM-teknologi og fremme encellet WGA, demonstrerer vi en effektiv, praktisk metode for å produsere rimelige mengder DNA fra en enkelt polyfinkromosomarm.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av stipendet fra National Institutes of Health 1R21AI094289 til Igor V. Sharakhov

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Scientific A491-212
Methanol Fisher Scientific A412-4
Propionic acid  Sigma-Aldrich 402907
Membrane slides 1.0 PET Zeiss 415190-9051-000
Buffer tablets “GURR” Life Technologies 10582-013
KaryoMAX Giemsa Stain Life Technologies 10092-013
ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System Abbott Molecular 30-144110
Vacufuge vacuum concentrator Eppendorf 22820001
Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000 Fisher Scientific 11-992-89
Thermo Scientific NanoDrop Fisher Scientific ND-2000
REPLI-g Single Cell Kit Qiagen 150343
GenomePlex Single Cell Kit (WGA4) Sigma-Aldrich WGA4-10RXN
GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3) Sigma-Aldrich WGA3-50RXN
MZ6 Leica stereomicroscope Leica VA-OM-E194-354 A different stereomicroscope can be used
Olympus CX41 Phase Microscope Olympus CX41RF-5 A different phase microscope can be used
PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope Zeiss
Thermomixer Eppendorf 22670000
10x PBS Invitrogen P5493
50x Denhardt’s solution Sigma-Aldrich D2532
99% Formamide Fisher Scientific BP227500
Dextran sulfate sodium salt Sigma D8906
20x SSC buffer Invitrogen AM9765
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Fermentas R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP GE Healthcare PA53022, PA55022
BSA Sigma-Aldrich A3294
DNA polymerase I Fermentas EP0041
DNase I  Fermentas EN0521
Spermine Sigma-Aldrich S3256-1G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-1G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP3581
EGTA Sigma-Aldrich E0396-25G
PIPES Sigma-Aldrich P6757-25G
EDTA Fisher Scientific S311-500
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Triton-X100 Fisher Scientific BP151-100
AdhesiveCap 500 clear Zeiss 415190-9211-000
QIAamp DNA Micro Kit (50) Qiagen 56304
Genomic DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4010
37% Paraformaldehyde Fisher Scientific F79-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ried, T., Schrock, E., Ning, Y., Wienberg, J. Chromosome painting: a useful art. Human molecular genetics 7. , 1619-1626 (1998).
  2. Yang, F., et al. Reciprocal chromosome painting illuminates the history of genome evolution of the domestic cat, dog and human. Chromosome Res. 8, 393-404 (2000).
  3. Badenhorst, D., Dobigny, G., Robinson, T. J. Karyotypic evolution of hapalomys inferred from chromosome painting: a detailed characterization contributing new insights into the ancestral murinae karyotype. Cytogenet Genome Res 136. , 83-88 (2012).
  4. Trifonov, V. A., et al. Chromosomal evolution in Gekkonidae. I. Chromosome painting between Gekko and Hemidactylus species reveals phylogenetic relationships within the group. Chromosome Res. 19, 843-855 (2011).
  5. Nie, W., et al. Chromosomal rearrangements and karyotype evolution in carnivores revealed by chromosome painting. Heredity (Edinb. , 108-1017 (2012).
  6. Guan, X. Y., et al. Detection of chromosome 6 abnormalities in melanoma cell lines by chromosome arm painting probes). Cancer Genet Cytogenet. 107, 89-92 (1998).
  7. Guan, X. Y., et al. Characterization of a complex chromosome rearrangement involving 6q in a melanoma cell line by chromosome microdissection. Cancer genetics and cytogenetics 134. , 65-70 (2002).
  8. Breen, M., et al. Detection of equine X chromosome abnormalities in equids using a horse X whole chromosome paint probe (WCPP). Vet J. 153, 235-238 (1997).
  9. Kokhanenko, A. A., Anan'ina, T. V., Stegniy, V. N. The changes in chromosome 6 spatial organization during chromatin polytenization in the Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae) nurse cells. Protoplasma 250. , 141-149 (2013).
  10. Timme, S., et al. Nuclear position and shape deformation of chromosome 8 territories in pancreatic ductal adenocarcinoma. Anal Cell Pathol (Amst. 34, 21-33 (2011).
  11. Drosopoulou, E., et al. Sex chromosomes and associated rDNA form a heterochromatic network in the polytene nuclei of Bactrocera oleae (Diptera: Tephritidae). Genetica. 140, 169-180 (2012).
  12. Pazian, M. F., Shimabukuro-Dias, C. K., Pansonato-Alves, J. C., Oliveira, C., Foresti, F. Chromosome painting of Z and W sex chromosomes in Characidium (Characiformes). Crenuchidae). Genetica. 141, 1-9 (2013).
  13. Howe, E. S., Murphy, S. P., Bass, H. W. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol 990. , 53-66 (2013).
  14. Lysak, M. A., Mandakova, T. Analysis of plant meiotic chromosomes by chromosome painting. Methods Mol Biol 990. , 13-24 (2013).
  15. Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: detection of numerical and structural alterations in all 24 human chromosomes simultaneously using a novel OctoChrome FISH assay. J Vis Exp. 10, (2012).
  16. Idziak, D., et al. Painting the chromosomes of Brachypodium: current status and future prospects. Chromosoma. 120, 469-479 (2011).
  17. Fuchs, J., Kuhfittig, S., Reuter, G., Schubert, I. Chromosome painting in Drosophila. Chromosome Res. 6, 335-336 (1998).
  18. Zhimulev, I. F. Morphology and structure of polytene chromosomes. 34, Academic Press. 1-490 (1996).
  19. Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. in Chromosome Mapping Research Developments eds. J.F. Verrity & L.E. Abbington) (Nova Science. , Publishers, Inc. (2008).
  20. Coluzzi, M., Sabatini, A., Torre, della, Di Deco, A., A, M., Petrarca, V. A polytene chromosome analysis of the Anopheles gambiae species complex). Science. 298, 1415-1418 (2002).
  21. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malaria mosquitoes. Genetika. 23, 821-827 (1987).
  22. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malarial mosquitoes. II. Species specificity in the pattern of chromosome relations with the nuclear envelope of nutrient ovarian cells. Genetika. 23, 1194-1199 (1987).
  23. Bonaccorsi, S., Santini, G., Gatti, M., Pimpinelli, S., Colluzzi, M. Intraspecific polymorphism of sex chromosome heterochromatin in two species of the Anopheles gambiae complex. Chromosoma. 76, 57-64 (1980).
  24. Zhimulev, I. F. Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation. Adv Genet. 37, 1-566 (1998).
  25. Seifertova, E., et al. Efficient high-throughput sequencing of a laser microdissected chromosome arm. BMC Genomics. 14, 1471-2164 (2013).
  26. Weise, A., et al. High-throughput sequencing of microdissected chromosomal regions. European journal of human genetics. EJHG. 18, 457-462 (2010).
  27. Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 19. , 395-406 (2012).
  28. Moshkin, Y. M., et al. Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogastermutant Suppressor of Underreplication. Chromosoma. 111, 114-125 (2002).
  29. Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Laser Mahalingam, M. capture microdissection: methods and applications. Methods Mol Biol 755. , 1-15 (2011).
  30. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. 10, (2010).
  31. Kubickova, S., Cernohorska, H., Musilova, P., Rubes, J. The use of laser microdissection for the preparation of chromosome-specific painting probes in farm animals. Chromosome Res. 10, 571-577 (2002).
  32. Fukova, I., et al. Probing the W chromosome of the codling moth, Cydia pomonella, with sequences from microdissected sex chromatin. Chromosoma. 116, 135-145 (2007).
  33. Thalhammer, S., Langer, S., Speicher, M. R., Heckl, W. M., Geigl, J. B. Generation of chromosome painting probes from single chromosomes by laser microdissection and linker-adaptor PCR. Chromosome Res. 12, 337-343 (2004).
  34. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a chip 7. , 423-440 (2007).
  35. Hutchison, C. A., 3rd,, Venter, J. C. Single-cell genomics. Nature biotechnology. 24, 657-658 (2006).
  36. Lasken, R. S., Egholm, M. Whole genome amplification: abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens. Trends in biotechnology 21. , 531-535 (1016).
  37. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Cytogenet Genome Res. 125, 286-291 (2009).
  38. Liu, J. D., et al. Sex chromosomes in the spiny eel (Mastacembelus aculeatus) revealed by mitotic and meiotic analysis. Cytogenet Genome Res. 98, 291-297 (2002).
  39. Harvey, S. C., et al. Molecular-cytogenetic analysis reveals sequence differences between the sex chromosomes of Oreochromis niloticus: evidence for an early stage of sex-chromosome differentiation. Cytogenet Genome Res. 97, 76-80 (2002).
  40. Hockner, M., Erdel, M., Spreiz, A., Utermann, G., Kotzot, D. Whole genome amplification from microdissected chromosomes. Cytogenet Genome Res. 125, 98-102 (2009).
  41. Kitada, K., Taima, A., Ogasawara, K., Metsugi, S., Aikawa, S. Chromosome-specific segmentation revealed by structural analysis of individually isolated chromosomes. Genes Chromosomes Cancer. 50, 217-227 (2011).
  42. Ma, L., et al. Direct determination of molecular haplotypes by chromosome microdissection. Nature methods. 7, 299-301 (2010).
  43. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in Locusta migratoria. Chromosome Res. 17, 11-18 (2009).
  44. Treff, N. R., Su, J., Tao, X., Northrop, L. E., Scott, R. T. Single-cell whole-genome amplification technique impacts the accuracy of SNP microarray-based genotyping and copy number analyses. Molecular human reproduction 17. , 335-343 (2011).
  45. Rutten, K. B., et al. Chromosomal anchoring of linkage groups and identification of wing size QTL using markers and FISH probes derived from microdissected chromosomes. in Nasonia(Pteromalidae : Hymenoptera). Cytogenetic and Genome Research 105. , 126-133 (2004).
  46. Post, R. J., Kruger, A., Somiari, S. B. Laser-assisted microdissection of polytene chromosomes from Diptera for the development of molecular markers. Molecular Ecology Notes. 6, 634-637 (2006).
  47. George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-throughput physical mapping of chromosomes using automated in situ hybridization. Journal of visualized experiments : JoVE. 10, (2012).
  48. Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes. J Vis Exp. 10, (2012).
  49. Frumkin, D., et al. Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues. BMC biotechnology. 8, 10-1186 (2008).
  50. Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Applied and environmental microbiology 71. , 3342-3347 (2005).
  51. Cassio, D. Long term culture of MDCK strains alters chromosome content. BMC Res Notes. 6, 162-1610 (2013).
  52. Landry, J. J., et al. The Genomic and Transcriptomic Landscape of a HeLa Cell Line. G3. , Bethesda. (1534).
  53. Steiniger, G. E., Mukherjee, A. B. Insect chromosome banding: technique for G- and Q-banding pattern in the mosquito Aedes albopictus. Can J Genet Cytol. 17, 241-244 (1975).
  54. Brown, S. E., et al. Toward a physical map of Aedes aegypti. Insect Mol Biol. 4, 161-167 (1995).
  55. Green, C., Hunt, R. Interpretation of variation in ovarian polytene chromosomes of Anopheles funestus Giles. A. parensis Gillies, and A. aruni? Genetica. 51, 187-195 (1980).
  56. Sharakhova, M. V., Xia, A., Leman, S. C., Sharakhov, I. V. Arm-specific dynamics of chromosome evolution in malaria mosquitoes. BMC evolutionary biology. 11, 10-1186 (2011).
  57. Gu, L. H., et al. DNA genotyping of oral epithelial cells by laser capture microdissection]. Fa yi xue za zhi 22. , 196-197 (2006).
  58. Rook, M. S., Delach, S. M., Deyneko, G., Worlock, A., Wolfe, J. L. Whole genome amplification of DNA from laser capture-microdissected tissue for high-throughput single nucleotide polymorphism and short tandem repeat genotyping. The American journal of pathology 164. , 23-33 (2004).
  59. Houen, A., Field, B. L., Saunders, V. A. Microdissection and chromosome painting of plant B chromosomes. Methods in cell science : an official journal of the Society for In. Vitro Biology. 23, 115-124 (2001).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 83 mikrodeseksjon forsterkning av hele genomet malariamygg polyfinkromosom mititotiske kromosomer fluorescens in situ hybridisering kromosommaling
2D- og 3D-kromosommaleri i malariamygg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

George, P., Sharma, A., Sharakhov,… More

George, P., Sharma, A., Sharakhov, I. V. 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes. J. Vis. Exp. (83), e51173, doi:10.3791/51173 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter